Особенности участия белков S100b, HLDF и аутоантител к ним в развитии цереброваскулярных осложнений гипертонической болезни

Размещено на http://www.allbest.ru/

2

Особенности участия белков S100b, HLDF и аутоантител к ним в развитии цереброваскулярных осложнений гипертонической болезни

общая характеристика работы

Актуальность исследования. Гипертоническая болезнь (ГБ) является одним из наиболее распространенных сердечно-сосудистых заболеваний среди трудоспособного населения в большинстве стран мира (Синькова Г.М., 2007; Kearney P.M. et al., 2005). По данным ВОЗ, в экономически развитых странах повышение артериального давления (АД) отмечается у 25% взрослого населения, а среди лиц старше 65 лет - более чем в 50% случаев. В Российской Федерации частота встречаемости артериальной гипертонии (АГ) у населения превышает 40% (Чазова И.Е., 2007; Гогин Е.Е., 2010).

Одним из центральных органов-мишеней, страдающих при ГБ, является головной мозг (Скворцова В.И., 2006; Суслина З.А. и др. 2006; Amenta F. et al., 2003). Известно, что АГ является причиной развития острых нарушений мозгового кровообращения преходящего характера - церебральных гипертонических кризов (ГК) (Широков Е.А., Симоненко В.Б., 2001; Бокарев И.Н., 2005; Vilela-Martin J.F. еt al., 2011), транзиторных ишемических атак (Парфенов В.А. и др., 2009; Zhang W.W. et al., 2009), или стойкого характера - геморрагических и ишемических инсультов (Wu C.Y. et al., 2010; Mancia G. еt al., 2011), а также хронической прогрессирующей недостаточности мозгового кровообращения - дисциркуляторной энцефалопатии и сосудистой деменции (Камчатнов П.Р. и др., 2007; Зверева З.Ф. и др., 2010; Richard E. et al., 2010; Sharp S.I. et al., 2011). В настоящее время доля смертности от сердечно-сосудистых заболеваний составляет 53,1%, при этом 35,4% случаев обусловлено именно цереброваскулярными осложнениями ГБ (Харченко В.И. и др., 2005; Гусев Е.И. и др., 2006; Morentin B., Audicana C., 2011).

В связи с широким распространением ГБ и связанных с ее развитием цереброваскулярных заболеваний (ЦВЗ), таких как церебральный ГК и острый ишемический инсульт (ОИИ), дальнейшее изучение механизмов нарушения регуляции АД, приводящих к ГБ, является актуальным направлением современной медицины, а поиск новых подходов ранней молекулярной диагностики осложнений данного заболевания имеет важное социально-экономическое значение.

Современные представления о нейробиологических и патофизиологических механизмах развития ЦВЗ указывают на ключевую роль нарушения микроциркуляции и трофического обеспечения, а также программированной гибели клеток нервной и сердечно-сосудистой систем (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Taoufik E., Probert L., 2008; Busl K.M., Greer D.M., 2010). В связи с этим особый интерес вызывает изучение вовлеченности в молекулярные механизмы ЦВЗ факторов-регуляторов процессов роста, развития, выживаемости и гибели эндотелиальных, нервных, глиальных клеток. В данном аспекте особое внимание привлекает нейротрофический белок S100b (Heizmann C.W. et al., 2002). Имеются многочисленные литературные данные о многообразии функциональной активности, которую проявляет S100b как внутриклеточно (Brozzi F. et al., 2009; Zimmer D.B., Weber D.J., 2010), так и в межклеточном пространстве (Donato R., Heizmann C.W., 2010; Sorci G. et al., 2010). Показано, что данный белок в зависимости от концентрации проявляет нейротрофические или проапоптотические свойства (Sherstnev V.V. et al., 2003; Mori T. et al., 2010). Продемонстрирована патогенетическая роль повышения концентрации S100b при ишемическом инсульте (Шерстнев В.В. и др., 2002; Kaca-Oryсska M. et al., 2010; Dayon L. et.al., 2011) и других заболеваниях нервной системы (Chaves M.L. et.al., 2010; Moritz S. et al., 2010).

Другим молекулярным регулятором процессов роста и гибели клеток является фактор дифференцировки, гликопротеин HLDF (human leukemia differentiation factor) (Kostanyan I.A. et al., 1994), недавно обнаруженный в крови человека (Sherstnev V.V., 2004) и в различных структурах головного мозга крыс (Sewell R.D., et al., 2005). Показано, что различные пептидные фрагменты HLDF проявляют как про- , так и антиапоптотическую активность (Костанян И.А. и др., 2000; Шерстнев В.В., и др., 2003; Сторожева З.И. и др., 2004). Установлено, что 24-членный и 8-членный пептидные фрагменты фактора - HLDF-24 и HLDF-8 - обладают выраженной гемодинамической активностью: при внутривенном введении они изменяют АД и частоту сердечных сокращений у нормотензивных и у спонтанно-гипертензивных крыс (Ржевский Д.И. и др., 2006). Имеются данные о структурной гомологии HLDF с эндотелин-превращающим ферментом (Ржевский Д.И. и др., 2005). В совокупности вышеизложенные данные позволяют предположить вовлеченность этого фактора в молекулярное обеспечение функционирования сердечно-сосудистой системы при изучаемых заболеваниях.

В настоящее время особый интерес представляет изучение участия иммунных механизмов в формировании ГБ и ЦВЗ (Harrison D.G. et al., 2011; Zhang Y., Popovich P., 2011). Становится все более очевидной вовлеченность иммунной системы в процессы единой нейроиммуноэндокринной регуляции в норме (Морозов С.Г. и др., 2005), а также при ГБ (Мингазетдинова Л.Н., 2006; Muller D.N. et al., 2011) и при ОИИ (Скворцова В.И. и др., 2005; Алферова В.В. и др., 2008). В последнее время показано, что аутоантитела (ауто-АТ) к S100b и к HLDF могут отражать и/или предопределять состояние когнитивных, психических, двигательных и сосудистых функций пациентов при острых и хронических нарушениях мозгового кровообращения (Грудень М.А. и др., 1999; Грудень М.А., Шерстнев В.В., 2008; Sherstnev V.V., 2004).

Вышеизложенные факты указывают на актуальность изучения вовлеченности белков S100b, HLDF, а также идиотипических ауто-АТ (АТ) и антиидиотипических ауто-АТ (аи-АТ) к данным белкам в развитие ГБ и ЦВЗ, а также поиска современных подходов молекулярной диагностики разных стадий ГБ, контроля эффективности лечения и прогноза ГБ и ее цереброваскулярных осложнений.

Цель работы заключалась в исследовании участия факторов развития и гибели нервных, глиальных, эндотелиальных клеток - белков S100b и HLDF, а также идио/антиидиотипических аутоантител к ним в развитии гипертонической болезни и ее цереброваскулярных осложнений.

Задачи исследования:

1. Изучить содержание белков S100b, HLDF и уровни идио/антиидиотипических аутоантител ним в сыворотке крови пациентов с гипертонической болезнью, а также в критические периоды развития (на 1, 3, 7 и 21 сутки) церебрального гипертонического криза и острого ишемического инсульта.

2. Сопоставить содержание белка S100b, уровни идио/антиидиотипических аутоантител к S100b в сыворотке крови с неврологическими показателями у пациентов с церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом.

3. Проанализировать соотношение содержания белка HLDF, уровней идио/антиидиотипических аутоантител к HLDF в сыворотке крови и клинических показателей, отражающих функциональное состояние сердечно-сосудистой системы у пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом.

4. Оценить диагностическую и прогностическую значимость определения белков S100b, HLDF и уровней идио/антиидиотипических аутоантител к ним в сыворотке крови пациентов при гипертонической болезни и ее цереброваскулярных осложнениях.

Научная новизна. Впервые изучена динамика и выявлены различия в сывороточном содержании белков S100b и HLDF, а также в уровнях идио/антиидиотипических ауто-АТ к данным белкам у пациентов в критические периоды развития ГК и ОИИ, а также при не осложненной ГБ. С помощью изучаемых иммунобиохимических показателей - белка S100b и ауто-АТ к нему - обнаружено нарушение гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) у больных с не осложненным и кризовым течением ГБ. Доказана диагностическая значимость определения антиидиотипических ауто-АТ к S100b на основе выявленных статистических взаимосвязей их уровня с неврологической симптоматикой пациентов при ГК и ОИИ. У пациентов с ГК обнаружена взаимосвязь концентрации HLDF и уровня ауто-АТ к HLDF с величиной АД, длительностью течения ГБ и выраженностью кардиологической симптоматики (сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца). Впервые документирована благоприятная прогностическая значимость повышения уровня идиотипических ауто-АТ к HLDF для клинического исхода ОИИ.

Теоретическая и практическая значимость. Подтверждены теоретические предпосылки о том, что факторы развития и гибели нервных, глиальных, эндотелиальных клеток - белки S100b и HLDF - наряду с эффекторами гуморального иммунного ответа - ауто-АТ к рассматриваемым белкам - вовлечены в молекулярные механизмы патогенеза ГБ и ее цереброваскулярных осложнений. Полученные новые экспериментальные данные о молекулярных механизмах патогенеза ЦВЗ, связанных с ГБ, расширяют существующие в настоящее время представления о дизрегуляции нейроиммунных взаимодействий при цереброваскулярной патологии. Полученные данные о различном сывороточном содержании изученных показателей у пациентов, страдающих ГБ, ГК и ОИИ, демонстрируют ранее не описанные особенности молекулярных процессов патогенеза ГБ и одновременную вовлеченность элементов нервной, сердечно-сосудистой и иммунной систем в патогенетические механизмы ЦВЗ, ассоциированных с ГБ. Полученные результаты позволяют рассматривать системы факторов, состоящие из белков S100b, HLDF, АТ и аи-АТ к ним, а также перечисленные факторы по отдельности в качестве молекулярных нейроиммунных биомаркеров для ранней диагностики и прогнозирования цереброваскулярных осложнений ГБ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Гипертоническая болезнь и ее цереброваскулярные осложнения (церебральный гипертонический криз, острый ишемический инсульт) сопровождаются повышением содержания белка S100b и уровня идиотипических антител к нему, а также снижением содержания белка HLDF и уровня идио/антиидиотипических антител к нему в сыворотке крови пациентов.

2. Содержание белков S100b, HLDF и уровни идио/антиидиотипических аутоантител к ним в сыворотке крови коррелируют с клиническими показателями, отражающими функциональное состояние сердечно-сосудистой и нервной систем у пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом.

3. Системы белков S100b, HLDF и идио/антиидиотипических аутоантител к ним на молекулярном уровне отражают процессы дизрегуляции в нервной, иммунной, и сердечно-сосудистой системах организма при гипертонической болезни, а также могут иметь значение для прогноза развития церебральных осложнений данного заболевания.

Апробация. Основные положения и результаты исследования были доложены на 17-м съезде Европейского колледжа нейрофармакологии (Москва, 2004), Итоговой научной сессии НИИ Нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН (Москва, 2004), XX съезде физиологического сообщества имени И.П. Павлова (Москва, 2007), юбилейной конференции «Современные возможности клинической лабораторной диагностики», посвященной 20-летию компании БиоХимМак (Москва, 2009), 6-й Российской конференции «Нейроиммунопатология» (Москва, 2010), 7-м Европейском форуме по нейронаукам (Амстердам, 2010), 1-й Международной междисциплинарной конференции «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций» (Сафага, 2010), а также на внутрилабораторных конференциях Лаборатории функциональной нейрохимиии НИИ НФ им. П.К.Анохина РАМН (Москва, 2004-2011).

Структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3-х глав результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 110 отечественных и 191 иностранный источник. Диссертация изложена на 160-ти страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 45 рисунков.

Публикации по теме диссертации. Опубликовано 11 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

материалы и методы исследования

Проведено комплексное клинико-иммунобиохимическое обследование 117-ти пациентов обоего пола в возрасте 63,0±11,1 лет. Под наблюдением находились 43 больных с диагнозом гипертоническая болезнь (группа 2) и 34 больных с диагнозом гипертонический криз (группа 3) отделения кардиологии 2-го Центрального Военного клинического госпиталя им. П.В. Мандрыка (руководитель отделения - д.м.н. И.С. Денищук, консультант - профессор, д.м.н. Е.А. Широков), а также 20 пациентов с впервые диагностированным острым ишемическим инсультом (группа 4) I-го и II-го неврологических отделений Городской клинической больницы № 20 г. Москвы (консультант - член-корр. РАМН, профессор, д.м.н. В.И. Скворцова). 27 условно здоровых лиц сопоставимого возраста составили контрольную группу (группа 1).

Пациенты всех групп подвергались комплексному клиническому обследованию с уточнением анамнеза заболевания, характера жалоб, особенностей течения патологического процесса. Детально анализировали общеклинический и психоневрологический статус. Проводилось функциональное исследование сердечно-сосудистой системы, включающее электро- и эхо-кардиографию с расчетом показателей центральной гемодинамики, суточное мониторирование ЭКГ и АД. Состояние магистральных артерий головы и интракраниальных артерий (наличие и степень стеноза, окклюзий, ангиоспазма) оценивали по данным ультразвуковой допплерографии и дуплексного сканирования брахиоцефальных сосудов (Денищук И.С., 2006). Проводилось установление степени артериальной гипертонии (АГ), наличия ишемической болезни сердца (ИБС), сердечной недостаточности (СН), их формы, давности течения, наличия инфарктов в анамнезе. Для оценки структурно-морфологического состояния головного мозга при цереброваскулярных осложнениях ГБ и подтверждения локализации и характера очаговых изменений в мозге, определенных клинически, использовали результаты магнитно-резонансной и компьютерной томографии (Ефремова Н.М., 2003; Шалавин А.Н.., 2009).

В контрольную группу (11 мужчин и 16 женщин) были включены пациенты, проходившие плановое медицинское обследование в ЦВГ им. П.В. Мандрыка (13 человек) и в ГКБ №20 (14 человек), в результате которого у них не выявлено сердечно-сосудистых и неврологических заболеваний. Результаты измерений АД у всех пациентов данной группы находилось в пределах нормы (?139/89мм рт.ст.).

Вторую группу (18 мужчин и 25 женщин) составили пациенты с диагностированной гипертонической болезнью (ГБ), протекающей стабильно без осложнений в течение 0,5-34 лет. Среднее систолическое АД (САД) составляло у больных данной группы 144±16 мм рт.ст., диастолическое АД (ДАД) - 89±9 мм рт.ст.

Пациенты третьей группы (22 мужчины и 12 женщин) страдали ГБ 0,5-40 лет, на фоне которой развился гипертонический криз (ГК) с преходящей неврологической симптоматикой - церебральный ГК. Среднее САД в период криза составляло 210±23 мм рт.ст., среднее ДАД - 117±9 мм рт.ст. Для объективизации общемозговых и очаговых (полушарных, стволовых, мозжечковых) расстройств у больных данной группы использовали шкалу клинической оценки неврологического статуса Е.А. Широкова (Симоненко В.Б., Широков Е.А., 1998), согласно которой 10 баллов соответствует незначительным нарушениям (таким как головокружение, нистагм и др.), а 100 баллов - коматозному состоянию.

Четвертая группа (7 мужчин и 13 женщин) состояла из пациентов с ГБ длительностью 4-19 лет, на фоне которой впервые развился острый ишемический инсульт (ОИИ) в каротидном бассейне. Среднее САД у больных ОИИ составляло 148±16 мм рт.ст., ДАД - 87±8 мм рт.ст. Методом компьютерной томографии у пациентов данной группы оценивали размер очага инфаркта мозга в динамике на 1, 3, 7 и 21 сутки госпитализации (Ефремова Н.М., 2003). Для объективизации тяжести состояния больных в остром периоде ишемического инсульта были использованы различные клинические шкалы: шкала NIH (National Institutes of Health Stroke Scale) (Brott T. et al., 1989) для оценки степени выраженности неврологического дефицита (отсутствие изменений в неврологическом статусе оценивается как 0 баллов, грубый неврологический дефицит - 55 баллов) и шкала Orgogozo (Orgogozo J.M. et al., 1992) для оценки общей тяжести состояния больных и выраженности неврологического дефицита (оценка в 0 баллов соответствует смерти пациента, 100 баллов - отсутствию неврологического дефекта).

При формировании всех групп пациентов были использованы следующие критерии исключения: 1) вторичная артериальная гипертензия; 2) заболевания периферической нервной системы; 3) эпилепсия или клинически значимые психические заболевания; 4) инфекционные заболевания; 5) травмы головного мозга; 6) коагулопатии; 7) хроническая печеночная, почечная и легочная недостаточность; 8) аутоиммунные заболевания; 9) сахарный диабет; 10) злокачественные новообразования; 11) нейродегенеративные заболевания.

Таким образом, проведенное клиническое обследование пациентов, привлеченных в данное обследование, показало, что одной из основных этиологических причин, вызвавших недостаточность кровоснабжения головного мозга, являлась ГБ.

Белки S100b, HLDF и ауто-АТ к ним определяли в сыворотке периферической крови, взятой из кубитальной вены по стандартной методике в условиях асептики. Образцы крови центрифугировали при 3000 об/мин, сыворотку отбирали, аликвотировали и хранили при -80°С до проведения исследования. Определение иммунобиохимических показателей проводилось методом гетерогенного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА; Ensyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) (Самуилов В.Д., 1999; Rich R.R. et al., 2001; Wilhelm K.R. et al., 2007), модифицированным в лаборатории функциональной нейрохимии УРАМН НИИ НФ им. П.К. Анохина РАМН (Gruden M.A. et al., 2007). Содержание белка S100b определяли путем сорбции исследуемой сыворотки непосредственно на полистироловый планшет с последующим выявлением S100b с помощью кроличьих моноспецифических поликлональных антител к S100b (ИБХ РАН). Содержание белка HLDF определяли «сэндвич»-методом с использованием поликлональных моноспецифических антител крысы (НИИ НФ РАМН) и кролика (ИБХ РАН) к различным антигенным детерминантам белка HLDF. Для определения идиотипических ауто-АТ к S100b и к HLDF в качестве тест-антигенов использовали раствор белка S100b (Sigma, USA) и белка HLDF (ИБХ РАН) соответственно. Для определения антиидиотипических ауто-АТ к S100b и к HLDF в качестве тест-антигенов использовали аффинноочищенные моноспецифические поликлональные антитела кролика к белкам S100b и HLDF соответственно. Исследуемые сыворотки титровали для получения последовательных разведений от 1:100 до 1:12800. Полученные результаты выражали в титрах - последнее разведение сыворотки, при котором регистрировалась оптическая плотность, превышающая таковую в контрольной лунке.

Иммунобиохимическое исследование проводилось однократно в контрольной группе и у пациентов с не осложненной ГБ. При ГК и ОИИ определение иммуно-биохимических показателей проводилось динамике на 1-е, 3-е, 7-е и 21-е сутки от поступления в стационар.

Статистическую обработку данных проводили по алгоритму пакета программ «Statistica» (версия 6.0) с использованием описательной статистики, дисперсионного, корреляционного и факторного анализа. Описательная статистика проводилась с расчетом средних величин, моды и медианы, что позволяло проверить соответствие распределения выборки нормальному закону. К нормальному распределению относили ту выборку, в которой значения моды, среднего и медианы отличалось не более чем на 5%. При выборке с нормальным распределением дальнейшая проверка статистических гипотез о различиях между группами проводилась с расчетом t-критерия Стьюдента. Преобладающая часть статистических расчетов производились с использованием непараметрических критериев. Сравнение групп и подгрупп пациентов проводили методом рангового однофакторного дисперсионного анализа по Краскелу-Уоллесу (Kruskal-Wallis ANOVA by Ranks) и при помощи медианного теста. В случае выявленной статистической значимости в данных тестах попарное сравнение групп проводили по Манну-Уитни (Mann-Whitney U Test) и по Колмогорову-Смирнову. Сравнение зависимых групп (динамика неврологических и нейро-иммунохимических показателей) осуществляли с использованием рангового дисперсионного анализа по Фридману (Friedman ANOVA) с вычислением коэффициента конкордантности Кендалла (Kendall Coeff. of Concordance). Данные представлены в виде М±m, где М - среднее арифметическое значение, m - стандартная ошибка среднего. При использовании клинических показателей выделялись подгруппы по порядковым качественным и количественным признакам, таким как степень ИБС и СН, выраженность субъективных симптомов и объективных клинических показателей по клиническим шкалам. Для дальнейшего выявления взаимосвязей клинических и иммуно-нейрохимических показателей использовался корреляционный анализ. Корреляционный анализ проводился с использованием метода ранговой корреляции по Спирмену (R) и гамма-корреляции (). Критическое значение уровня статистической значимости (p) при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05.

результаты исследования

БеЛКИ S100b, HLDF и аутоантителА к S100b, HLDF ПРИ гипертонической болезнИ и ЕЕ цереброваскулярных осложнениях

Содержание белка S100b, уровни идиотипических и антиидиотипических аутоантител к S100b в сыворотке крови пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом

Проведено сравнительное изучение количественного содержания S100b, титров АТ и аи-АТ к S100b в сыворотке крови пациентов с ГБ, ГК и ОИИ, а также условно здоровых лиц контрольной группы. В результате проведенных исследований выявлено, что в контрольной группе среднее содержание белка S100b составило 0,57±0,29нг/мл (рис.1а). У пациентов с ГБ и цереброваскулярными осложнениями ГБ концентрация S100b статистически значимо превышала более чем в 15 раз таковую у пациентов контрольной группы и составила 8,6±1,0нг/мл (р<0,0001), 9,0±1,1нг/мл (р<0,0001), 15,9±1,6нг/мл (р<0,0001) при ГБ, ГК и ОИИ соответственно. Наибольшее сывороточное содержание белка S100b, превышающее в 26 раз аналогичный показатель в контрольной группе, выявлено у пациентов с ОИИ, при этом концентрация S100b у них вдвое превышала таковую у пациентов с ГБ (р=0,001) и ГК (р=0,001) (рис.1а).

Обнаружение нейроспецифического белка S100b в крови пациентов с ГБ указывает на нарушение его метаболизма в клетках мозга и/или их повреждение, а также на нарушение проницаемости ГЭБ не только при ЦВЗ, но и при гипертонии, протекающей без церебральных осложнений (Ганнушкина И.В. и др., 2005; Kleindienst A. et al., 2007). Следует отметить, что, согласно литературным данным, циркулирующий в повышенной концентрации S100b может принимать участие в развитии эндотелиальной дисфункции, усиливать адгезию лейкоцитов к эндотелию, способствовать пролиферации гладкомышечных клеток сосудов (особенно в присутствии глюкозы и ангиотензина II), таким образом выступая одним из патогенетических факторов ГБ (Sorci G. et al., 2010).

Выявление повышенного содержания белка S100b при ГБ и ее церебральных осложнениях поставило перед нами задачу изучения у обследуемых пациентов активности гуморального звена иммунитета, а именно - продукции ауто-АТ к белку S100b. Подробное изучение сывороточного уровня данных ауто-АТ у пациентов обследованных групп выявило следующие закономерности. Средний титр АТ к S100b в сыворотке крови условно здоровых лиц составил 1:237±1:211 (рис.1b). У пациентов с ГБ и ее церебральными осложнениями титр идиотипических ауто-АТ к S100b статистически значимо (в 4-12 раз) превышал уровень, выявленный в контрольной группе, и составил при ГБ 1:1033±1:451 (р=0,004), при ГК - 1:1715±1:413 (р=0,014) и при ОИИ - 1:2840±1:1144 (р=0,005). Кроме того, титр АТ к S100b у пациентов с ГК и ОИИ превышал таковой у пациентов с не осложненным течением ГБ в 1,7 (p=0,002) и 2,7 (p=0,001) раз соответственно, при этом наиболее высокий средний титр АТ к S100b наблюдался у пациентов с ОИИ. Обнаруженный повышенный уровень АТ к S100b у пациентов, длительно страдающих ГБ, вероятно, является результатом хронической недостаточности мозгового кровообращения, что может привести к гибели нейронов и глиальных клеток, изменениям в проницаемости ГЭБ с проникновением нейроантигенов в спинномозговую жидкость и кровь и инициации аутоиммунных процессов против S100b и/или проникновению фрагментов ауто-АТ в мозг и связыванию свободного S100b, что в результате ослабляет нейротрофическое звено регуляции с его участием (Скворцова В.И. и др., 2005).

Исследование антиидиотипических (вторичных) ауто-АТ к белку S100b при ГБ и ЦВЗ представляет особый интерес, что обусловлено возможностью выявления не только особенностей функционирования иммунологической сети у обследованных пациентов, но и нарушений нейроиммунных взаимодействий, а также дисбаланса иммунного ответа (Корнева Е.А., 2005; Магаева С.В., Морозов С.Г., 2005; Полетаев А.Б., 2004). При определении уровня аи-АТ к S100b установлено, что в сыворотке крови условно здоровых лиц их средний титр составил 1:185±1:49, в группе с не осложненной ГБ - 1:107±1:4, при ГК - 1:209±1:62, при ОИИ - 1:113±1:7 (рис.2с). Статистически значимых отличий в титрах аи-АТ к S100b у пациентов с ГБ, ГК и ОИИ от контрольной группы выявлено не было. Возможно, это обусловлено начальными стадиями индукции синтеза аи-АТ, либо образованием иммунных комплексов с первичными ауто-АТ. Кроме того, аи-АТ могут не выявляться с помощью используемой методики ИФА в результате их низкой аффинности, которая определяет слабое связывание данных аи-АТ с иммобилизованными на полистироловом планшете АТ к S100b.

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали, что ГБ, ГК и ОИИ характеризуются 15-26-кратным увеличением сывороточной концентрации белка S100b и 4-12-кратным увеличением титра АТ к S100b по сравнению с контрольной группой. При этом, по сравнению с не осложненной ГБ, ГК характеризуется повышением в 1,6 раз уровня АТ к S100b, а ОИИ сопровождается увеличением концентрации S100b и титра АТ к S100b в 2 и 2,7 раз соответственно.

Содержание белка HLDF, уровни идиотипических и антиидиотипических аутоантител к HLDF в сыворотке крови пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом

Результаты исследования содержания белка HLDF, уровня АТ и аи-АТ к HLDF в сыворотке крови пациентов с диагностированными ГБ, ГК, и ОИИ, а также условно здоровых лиц представлены на рис.2. Установлено, что у пациентов контрольной группы среднее содержание HLDF составило 435,8±21,2нг/мл, в то время как в группах пациентов с ГБ и церебральными осложнениями ГБ оно было статистически значимо снижено более чем в 50 раз: 2,7±0,9нг/мл (р<0,0001) при не осложненной ГБ; 46,4±10,0нг/мл (р<0,0001) при ГК; 51,4±8,4нг/мл (р<0,0001) при ОИИ. Как видно из рис.2а, наименьшая концентрация HLDF, составляющая 0,6% от нормы, выявлена у пациентов с не осложненной ГБ, при этом она была статистически значимо ниже, чем у пациентов с осложненным течением ГБ: в 17 раз по сравнению с ГК (р=0,0003) и в 19 раз по сравнению с ОИИ (р=0,0001).

Выраженное снижение содержания фактора дифференцировки HLDF в сыворотке крови пациентов с ГБ и ее церебральными осложнениями по сравнению с условно здоровыми лицами позволяет предположить вовлеченность HLDF в механизмы регуляции АД на молекулярном уровне. Возможно, данный фактор дифференцировки принимает участие в процессах, контролирующих нормальное функционирование эндотелия и/или других клеток сердечно-сосудистой системы, в частности, в процессах вазоконстрикции, так как при снижении его сывороточной концентрации в организме происходят гипертонические изменения, которые мы наблюдали у пациентов с ГБ, ГК и ОИИ. Объяснением этому эффекту может служить продемонстрированная гемодинамическая активность пептидных фрагментов фактора - HLDF-24 и HLDF-8, а также обнаруженный гомологичный мотив в аминокислотной последовательности HLDF c молекулой эндотелин-превращающего фермента (Ржевский Д.И. и др., 2006). Известно, что развитие ГБ напрямую связано с эндотелиальной дисфункцией (Versari D. et al., 2009; Hirata Y. et al., 2010), в формирование которой, возможно, вовлечен изучаемый фактор дифференцировки и его фрагменты. Учитывая факт обнаружения белка HLDF в структурах мозга (Sewell R.D. et al., 2005), нельзя исключить вовлеченность HLDF в регуляцию АД на уровне центральной нервной системы.

Исследование продукции АТ к белку HLDF у пациентов обследованных групп выявило, что их средний титр в сыворотке крови условно здоровых лиц составил 1:42501:982 (рис.2b). У пациентов с ГБ и церебральными осложнениями ГБ титр АТ к HLDF был статистически значимо ниже в 2-2,5 раз, чем в контрольной группе, и составил 1:1965±1:545 при ГБ (р=0,002), 1:1922±1:592 при ГК (р=0,012), и 1:1698±1:681 при ОИИ (р=0,011). Обнаружено, что титр АТ к HLDF при не осложненном течении ГБ статистически значимо отличался в распределении от титра АТ к HLDF при кризовом течении ГБ согласно тесту Колмогорова-Смирнова (р<0,025).

В результате выявления аи-АТ к HLDF установлено, что в сыворотке крови условно здоровых лиц их средний титр составил 1:23501:800 (рис.2с). Наивысшее значение титра аи-АТ к HLDF среди пациентов обследованных групп выявлено при не осложненной ГБ (1:3509±1:845), однако статистически значимого отличия от контрольной группы не обнаружено. Уровень аи-АТ к HLDF у пациентов с кризовым течением ГБ был в 2,6 раз снижен по сравнению не осложненной ГБ (1:1316±1:293, р=0,032). При этом обнаружено, что титр аи-АТ к HLDF у пациентов с ОИИ выявлялся на уровне 1:2101:74 и был статистически значимо снижен по сравнению с условно здоровыми лицами в 11 раз (р<0,05) и по сравнению с ГК в 6 раз (р=0,0002).

Однонаправленное снижение уровня АТ и аи-АТ к HLDF по сравнению с контролем, согласующееся со снижением концентрации белка HLDF в сыворотке крови пациентов с ГБ и с церебральными осложнениями ГБ, позволяет предположить вовлеченность в механизмы регуляции АД также и специфичных к HLDF ауто-АТ. Можно полагать, что ауто-АТ к HLDF в достаточно высоких титрах (что свидетельствует о высокой их активности) в норме выполняют регуляторную гомеостатическую функцию. При этом снижение синтеза и/или усиление катаболизма фактора HLDF приводит к ответному снижению титра идиотипических ауто-АТ к HLDF. В то же время, аи-АТ к могут служить функциональным аналогом антигена и существенно влиять на течение аутоиммунных процессов (Крыжановский Г.Н., 2010; Морозов С.Г. и др., 2005). Действительно, при не осложненной ГБ выявлено минимальное из всех обследованных групп пациентов содержание HLDF (рис.2а) и максимальный уровень аи-АТ к HLDF (рис.2c). Не исключено, что при нарушении метаболизма белка HLDF, наблюдаемого нами при ГБ, повышение уровня аи-АТ к HLDF можно объяснить попыткой организма скомпенсировать недостаточность фактора дифференцировки HLDF как адаптогенного агента. С другой стороны, понижение уровня ауто-АТ к HLDF по сравнению с наблюдаемым у здоровых лиц может свидетельствовать о дисбалансе в системе HLDF - АТ к HLDF - аи-АТ к HLDF, взаимосвязанной, по нашему предположению, с эндотелиновой системой, что, вероятно, может быть одним из звеньев дизрегуляции функционирования сердечно-сосудистой системы на молекулярном уровне. Так, при ОИИ мы наблюдаем не только истощение самого фактора HLDF в крови пациентов (рис.2а), но и снижение титра аи-АТ к HLDF до минимального из всех обследованных групп пациентов уровня (рис.2с).

Таким образом, проведенные исследования показали, что ГБ, ГК и ОИИ сопровождаются снижением сывороточного содержания белка HLDF (в 160, 9 и 8,5 раз соответственно), а также снижением уровня АТ к HLDF в 2-2,5 раз и уровня аи-АТ к HLDF в 2-11 раз по сравнению с условно здоровыми лицами. При этом развитие ГК характеризуется снижением титра аи-АТ к HLDF по сравнению с не осложненной ГБ в 2,6 раз.

Сопоставление содержания в сыворотке крови белков S100b, HLDF и уровней идиотипических и антиидиотипических аутоантител к ним с показателями функционального состояния сердечно-сосудистой и нервной систем у пациентов с гипертонической болезнью и ЕЕ цереброваскулярными осложнениями

Сравнительный анализ содержания белка S100b, уровня идиотипических и антиидиотипических аутоантител к S100b и динамики неврологических показателей у пациентов с церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом

При помощи статистического анализа были изучены взаимосвязи количественного содержания S100b, продукции АТ к S100b, аи-АТ к S100b в сыворотке крови пациентов, перенесших ГК и ОИИ, с неврологической симптоматикой. Обнаружена прямая корреляция титра АТ к S100b с очаговой симптоматикой при полушарном повреждении мозга, оцениваемой по шкале клинической оценки неврологического статуса Е.А. Широкова на 3-е сутки (R=0,37 p=0,042), 7-е сутки (R=0,41 p=0,021) и 21-е сутки (=0,57 p=0,031) развития ГК.

Сравнение по уровню аи-АТ к S100b подгрупп пациентов с различной выраженностью очаговой симптоматики при полушарном повреждении мозга (0 баллов, 10 баллов, 20 баллов) продемонстрировало, что на всех этапах обследования - с 1-го по 21-й день от начала ГК - наибольший титр аи-АТ к S100b соответствует наиболее выраженной очаговой симптоматике (рис.3).

*р<0,05 в сравнении с симптоматикой 0 баллов в соответствующий период наблюдения

**р<0,01 в сравнении с симптоматикой 0 баллов в соответствующий период наблюдения

Рис.3. Взаимосвязь титра антиидиотипических антител к S100b и очаговой симптоматики при полушарном повреждении мозга у пациентов с гипертоническим кризом в течение периода наблюдения.

У пациентов, перенесших ОИИ, обнаружена отрицательная корреляция содержания S100b с неврологической симптоматикой, оцениваемой по клинической шкале Orgogozo (рис.4), при которой более низкие баллы соответствуют более выраженному неврологическому дефициту. Как видно из представленных на рис.4 кривых корреляции, наиболее высокая концентрация S100b соответствует наиболее низким баллам по шкале Orgogozo, т.е. чем выше сывороточное содержание белка S100b в крови пациентов с ОИИ, тем выраженнее у них неврологическая симптоматика согласно данной шкале.

В результате проведения дисперсионного анализа полученных экспериментальных и клинических данных в работе обнаружена прямая взаимосвязь содержания белка S100b у пациентов, перенесших ОИИ, с объемом инфаркта мозга (ОИМ). При сравнении подгрупп пациентов с различным размером инфаркта мозга при ОИИ было обнаружено, что наивысшей концентрации белка S100b соответствует наибольший объем очага (рис.5). Принимая во внимание литературные данные, указывающие на то, что течение и исход инсульта напрямую зависят от ОИМ (Гусев Е.И., 2003; Широков E.A., 2007; Gaudinski M.R. et al., 2008; Pialat J.B. et al., 2005; Schiemanck S.K. et al., 2005), а также полученные в данной работе результаты, указывающие на статистически значимо больший размер очага инфаркта мозга у пациентов с неблагоприятным исходом ОИИ (рис.14), можно утверждать, что сывороточное содержание белка S100b может быть прогностическим показателем относительно исхода ишемического инсульта, поскольку оно коррелирует с ОИМ. В связи с этим данный временной период можно рассматривать как критический для дальнейшего развития и прогноза исхода ОИИ.

Анализ взаимосвязей иммунохимических и клинических показателей также документировал прямую корреляцию титра аи-АТ к S100b с выраженностью неврологической симптоматики по шкале NIH в группе пациентов, перенесших ОИИ (рис.6). Представленные на данном рисунке кривые корреляции указывают на то, что чем выше уровень аи-АТ к S100b в крови пациентов с ОИИ, тем выраженнее у них неврологическая симптоматика согласно шкале NIH.

Таким образом, в данной работе установлена прямая статистическая взаимосвязь сывороточного содержания белка S100b и уровней АТ и аи-АТ к S100b с выраженностью неврологической симптоматики при ГК и при ОИИ, а также с объемом инфаркта мозга при ОИИ.

Полученные в данной работе результаты подтвердили литературные данные о взаимосвязи содержания белка S100b (Foerch C. et al., 2005; Nash D.L. et al., 2008; Sienkiewicz-Jarosz Н. et al., 2009; Dayon L. et al., 2011) и уровня первичных ауто-АТ к нему (Жданов Г.Н. и др., 2004; Камчатнов П.Р. и др., 2009; Poletaev A.B. et al., 2000) с неврологической симптоматикой, тяжестью и исходом цереброваскулярных заболеваний, а также выявили статистическую взаимосвязь титра вторичных ауто-АТ к S100b с выраженностью неврологических проявлений при церебральном ГК и при ОИИ. Описанные данные указывают на вовлеченность белка S100b и ауто-АТ к S100b в патогенетические механизмы цереброваскулярных осложнений ГБ, что позволяет использовать S100b, АТ к S100b и аи-АТ к S100b в качестве маркеров нейронального повреждения и нарушений нейроиммунных взаимодействий при рассматриваемых патологиях.

Сравнительный анализ содержания белка HLDF, уровня идиотипических и антиидиотипических аутоантител к HLDF и клинических показателей, отражающих функциональное состояние сердечно-сосудистой системы у пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом

Для выяснения возможных статистических взаимосвязей между сывороточным содержанием белка HLDF, а также уровнем АТ к HLDF и аи-АТ к HLDF и клиническими показателями, отражающими функциональное состояние сердечно-сосудистой системы у обследованных пациентов с ГБ, ГК и ОИИ, был проведен корреляционный и дисперсионный анализ. Выявлено, что содержание белка HLDF в сыворотке крови всех обследованных пациентов с ГБ и осложнениями ГБ, а также пациентов контрольной группы, обратно взаимосвязано с длительностью протекания ГБ (рис.7). При этом длительность ГБ у условно здоровых лиц принималась равной нулю.



*р0,05 по сравнению с длительностью ГБ 0-5 лет

Рис.7. Взаимосвязь сывороточного содержания белка HLDF с длительностью гипертонической болезни у всех обследованных пациентов.

*р0,05 по сравнению со стенозом МАГ менее 70%

Рис.8. Взаимосвязь сывороточного содержания HLDF с выраженностью стеноза магистральных артерий головы у пациентов с острым ишемическим инсультом.

Как продемонстрировано на рис.7, содержание белка HLDF у пациентов, страдающих ГБ от 6-ти до 15-ти и более лет, статистически значимо снижено по сравнению с содержанием HLDF у пациентов, страдающих ГБ менее 5-ти лет.

При дисперсионном анализе обнаружен также факт зависимости концентрации белка HLDF от выраженности стеноза магистральных артерий головы (МАГ) у пациентов, перенесших ОИИ (рис.8). Как видно из данного рисунка, пациенты с гемодинамически не значимым (менее 70%) стенозом МАГ демонстрируют более высокую сывороточную концентрацию белка HLDF (в 2 и более раз), чем пациенты с гемодинамически значимым (более 70%) стенозом МАГ.

*р0,05 по сравнению с длительностью ГБ 0,5-5 лет

Рис.9. Взаимосвязь титра АТ к HLDF с длительностью гипертонической болезни у пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом.

*р0,05 по сравнению с ИБС функционального класса «1» в соответствующий период наблюдения

**р0,001 по сравнению с ИБС функционального класса «1» в соответствующий период наблюдения

Рис.10. Взаимосвязь титра АТ к HLDF с выраженностью ишемической болезни сердца у пациентов с гипертоническим кризом в течение периода наблюдения.

Дисперсионный анализ позволил обнаружить прямую взаимосвязь уровня идиотипических ауто-АТ к HLDF с длительностью протекания ГБ у пациентов с ГБ, ГК и ОИИ (рис.9). Данный рисунок демонстрирует, что значения титра АТ к HLDF у пациентов, страдающих ГБ 15-ть и более лет, статистически значимо превышают его значения у пациентов, страдающих ГБ от 0,5-ти до 15-ти лет.

При изучении кардиологической симптоматики в анамнезе обследованных пациентов с 1-го по 21-й день после поступления в стационар обнаружено, что в группе пациентов с ГК уровень АТ к HLDF взаимосвязан выраженностью ИБС. При разделении пациентов с ГК по степени выраженности ИБС на подгруппы с ИБС функционального класса «1» и ИБС функционального класса «2» было установлено, что титр АТ к HLDF в течение всего периода наблюдения выше у больных с более выраженной ИБС (рис.10). На данном рисунке видно, что титр АТ к HLDF на 1-е, 7-е и 21-е сутки обследования пациентов, страдающих ИБС функционального класса «2», статистически значимо превышает титр АТ к HLDF у пациентов, страдающих ИБС функционального класса «1» в те же временные периоды. В 3-и сутки обследования статистически значимых отличий титра АТ к HLDF у пациентов с различной выраженностью ИБС выявлено не было.

Дизрегуляция в сердечно-сосудистой системе у пациентов как с не осложненной, так и с осложненной ГБ напрямую взаимосвязана с иммунологической регуляцией гомеостаза сосудов (Harrison D.G. et al., 2011; Matrougui K. et al., 2011; Muller D.N. et al., 2011). Примером может служить выявленная в результате проведенного анализа прямая корреляция титра аи-АТ к HLDF и величины САД и ДАД у всех обследованных пациентов независимо от патологического состояния (рис.11). Как видно, титр аи-АТ к HLDF прямо коррелирует с САД (R=0,24 p=0,017) и ДАД (R=0,27 p=0,007), что еще раз подтверждает предположение о том, что ауто-АТ к HLDF вовлечены в регуляцию АД.



Рис.11. Прямая корреляционная зависимость титра антиидиотипических антител к HLDF от величины систолического и диастолического артериального давления во всех группах обследованных пациентов.

Дальнейшие исследования кардиологических показателей продемонстрировали, что уровень аи-АТ к HLDF также взаимосвязан с выраженностью СН у пациентов с ГК (рис.12). На данном рисунке показано, что уровень аи-АТ к HLDF у пациентов, страдающих выраженной СН, статистически значимо превышает таковой у пациентов, не имеющих СН или страдающих СН умеренной степени.

*р0,05 по сравнению с группой пациентов с отсутствующей и умеренно выраженной сердечной недостаточностью

Рис.12. Взаимосвязь титра аи-АТ к HLDF с выраженностью сердечной недостаточности у пациентов с гипертоническим кризом.

Полученные результаты демонстрируют, что длительное протекание ГБ приводит к снижению концентрации белка HLDF и повышению титра АТ к HLDF в крови пациентов, страдающих как ГБ, так и ее осложнениями относительно контрольной группы. Обнаруженное в работе снижение содержания HLDF при длительно протекающей ГБ и при выраженном стенозе МАГ позволяет предположить протективную роль белка HLDF для сердечно-сосудистой системы и взаимосвязи данного фактора с другими системами регуляции АД (эндотелиновая, ренин-ангиотензиновая) при развитии ГБ. Повышение титра АТ к HLDF и аи-АТ к HLDF при увеличении длительности ГБ и прогрессировании ИБС и СН может расцениваться как модуляция защитной функции HLDF по мере прогрессирования заболевания; компенсаторное повышение уровня ауто-АТ к HLDF указывает на дисбаланс иммунологической сети, регулирующей биологическую активность фактора HLDF. Выявленная обратная корреляция уровня аи-АТ к HLDF с САД и ДАД свидетельствует о вовлеченности данных ауто-АТ в регуляцию АД, причем роль аи-АТ к HLDF может сводиться не только к участию в деятельности иммунологической сети, но и состоять в функциональной замене самого фактора дифференцировки в условиях его сниженной концентрации для поддержания гомеостаза сердечно-сосудистой системы. В целом, выявленные взаимосвязи содержания HLDF и уровня ауто-АТ к HLDF с АД, длительностью протекания ГБ, выраженностью ИБС и СН, степенью стеноза МАГ подтверждают предположение о вовлеченности данных иммунобиохимических факторов в механизмы функционирования сердечно-сосудистой системы и формирование гипертонии.

Для выяснения возможной прогностической значимости изучаемых иммунобиохимических показателей в работе проведено разделение пациентов, перенесших ОИИ, на подгруппы с благоприятным и неблагоприятным исходом заболевания. Согласно клиническим наблюдениям, все пациенты с летальным исходом ОИИ демонстрировали статистически значимо более выраженную неврологическую симптоматику (рис.13) и больший объем инфаркта мозга (рис.14), а при благоприятном исходе наблюдалось угашение данных показателей. При этом у пациентов с благоприятным исходом было установлено статистически значимое повышение титра АТ к HLDF в течение периода обследования, причем их титр приближался к уровню контрольной группы, в то время как при неблагоприятном исходе титр АТ к HLDF изначально был ниже и имел тенденцию к дальнейшему снижению (рис.15).

Учитывая разнонаправленную динамику титра АТ к HLDF при благоприятном и неблагоприятном исходе ишемического инсульта и взаимосвязь динамики АТ к HLDF с изменениями неврологического статуса, можно полагать, что увеличение титра АТ к HLDF является одним из показателей положительного прогноза исхода ОИИ.

Таким образом, полученные в работе результаты расширяют существующие в настоящее время представления о дизрегуляции взаимодействия нервной, сердечно-сосудистой и иммунной систем при цереброваскулярной патологии, осложняющей ГБ. Иммунобиохимические показатели, определяемые в критические периоды развития церебральных осложнений ГБ, отражают функциональное состояние сердечно-сосудистой и нервной систем, а также гуморального звена иммунитета пациентов, и участвуют в развитии ЦВЗ при ГБ. Выявленные особенности систем факторов S100b, HLDF и идио/антиидиотипических ауто-АТ к ним могут быть использованы в практических целях для разработки новых прогностических подходов к изучению развития цереброваскулярных осложнений ГБ.

выводы

1. Развитие гипертонической болезни и ее цереброваскулярных осложнений (церебральный гипертонический криз, острый ишемический инсульт) сопровождается повышением содержания белка S100b и уровня идиотипических аутоантител к S100b в сыворотке крови пациентов. Наиболее выраженная продукция идиотипических аутоантител к S100b наблюдается при гипертоническом кризе и ишемическом инсульте, который также характеризуется резким повышением содержания белка S100b.

2. Развитие гипертонической болезни и ее цереброваскулярных осложнений (церебральный гипертонический криз, острый ишемический инсульт) сопровождается снижением содержания белка HLDF и уровня идио/антиидиотипических антител к HLDF в сыворотке крови пациентов. Наиболее снижена продукция антиидиотипических аутоантител к HLDF при гипертоническом кризе и ишемическом инсульте.

3. Содержание белка S100b и уровни идио/антиидиотипических антител к S100b положительно коррелируют с выраженностью неврологической симптоматики у пациентов с церебральными осложнениями гипертонической болезни, а также с объемом инфаркта мозга при остром ишемическом инсульте.

4. Содержание белка HLDF отрицательно коррелирует с продолжительностью гипертонической болезни у пациентов всех групп и со степенью стеноза магистральных артерий головы у пациентов с ишемическим инсультом. Уровни идио/антиидиотипических антител к HLDF положительно коррелируют с величиной артериального давления, продолжительностью гипертонической болезни у пациентов всех групп, с выраженностью ишемической болезни сердца и сердечной недостаточности у пациентов с гипертоническим кризом.

5. Выявленные особенности систем факторов S100b, HLDF и идио/антиидиотипических аутоантител к ним при гипертонической болезни, церебральном гипертоническом кризе и остром ишемическом инсульте могут быть использованы в разработке новых подходов для прогноза развития цереброваскулярных осложнений гипертонической болезни.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

гипертонический болезнь инсульт

Грудень М.А., Шерстнев В.В., Ефремова Н.М., Елистратова Е.И., Стаховская Л.В., Скворцова В.И. Нейротрофические факторы и антитела к ним: участие в развитии нейроиммунных реакций при различных нарушениях нервной системы. // Материалы X конференции «Нейроиммунология». - 2001. - Т.2 - С.49.

Елистратова Е.И., Грудень М.А., Давыдова Т.В., Шерстнев В.В. Особенности иммунобиохимических показателей у пациентов с различными цереброваскулярными заболеваниями гипертонического генеза. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2011. - №3. - С.25-28.

Елистратова Е.И, Грудень М.А., Шерстнев В.В. Нейроиммунные механизмы нарушений мозгового кровообращения // Материалы 1-й Международной междисциплинарной конференции «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций». - 2010. - С.183-184.

Елистратова Е.И., Грудень М.А., Шерстнев В.В. Новые нейроиммунные маркеры цереброваскулярных осложнений гипертонической болезни. // Патогенез. - 2010. - №1. - С.38.

...