Антиаритмические, антикоагуляционные и центральные эффекты комбинированных гетероциклических соединений 2н-1-бензопиран-2-онового ряда (экспериментальное исследование)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

Антиаритмические, антикоагуляционные и центральные эффекты комбинированных гетероциклических соединений 2н-1-бензопиран-2-онового ряда (экспериментальное исследование)

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

кандидата биологических наук

Ивкин Дмитрий Юрьевич

Санкт-Петербург, 2011

Диссертационная работа выполнена на кафедре фармакологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Крауз Владислав Алексеевич

Научный консультант:

доктор химических наук, з.д.н. РФ, профессор Абышев Азад Зиядович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Хныченко Людмила Константиновна

доктор медицинских наук Семенов Евгений Васильевич

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Защита диссертации состоится «27» октября 2011г. на заседании Диссертационного совета Д 001.022.03 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН, 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский проспект, 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН по адресу 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. И.П. Павлова, 12.

Автореферат разослан «….»………………2011 года.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.В. Пучкова

кумариновый антигипоксический фармакологический токсичность

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Блокаторы кальциевых каналов обладают множественными положительными эффектами и применяются при различных патологических процессах. Известно, что они являются альтернативой в-адреноблокаторам в клинической практике при лечении ишемической болезни сердца. Препараты данной группы положительно влияют на диастолическую функцию миокарда, устраняют спазм коронарных артерий, улучшают региональный и коллатеральный кровоток [Князькова И.И., 1999]. Воздействуя непосредственно на миокард, антагонисты кальция ограничивают в сердечной мышце трансмембранный ток кальция, уменьшают кальций-зависимое расщепление АТФ, способствуя экономному превращению химической энергии в механическую работу, уменьшая силу сердечных сокращений, что в свою очередь, снижает потребность сердца в кислороде и повышает переносимость гипоксии [Джанашия П.Х. и соавт., 2008]. Гипоксия стала одной из актуальнейших проблем сегодняшнего дня вследствие того, что любое патологическое состояние прямо или косвенно связано с нарушением кислородного гомеостаза организма [Лукьянова Л.Д., Ушакова И.Б., 2004; Зарубина И.В., Шабанов П.Д., 2004]. Инсульты, инфаркты, ишемические состояния различных органов, инфекционные заболевания - это лишь небольшой перечень патологий, в основе генеза которых лежит гипоксический фактор. Таким образом, очевидно, что защита от гипоксии и её последствий является одной из первостепенных задач медицины, а проблемы, связанные с этим, приобретают социальную значимость. Представляется актуальным поиск новых антигипоксических средств, выбор которых ограничен на современном фармацевтическом рынке.

Помимо заболеваний сердечно-сосудистой системы широко распространены пограничные невротические расстройства. Заболеваемость неврозами в экономически развитых странах составляет около 10%, в Российской Федерации этот показатель значительно выше, например, 33% в Москве и 37% в Санкт-Петербурге. Состояние тревоги возникает у 8,3% населения Земного шара [Александровский Ю.А., 2007; Бобров А.Е., 2006]. Поэтому проблема лечения и профилактики заболеваний центральной нервной системы также актуальна и требует решения.

Тромбоэмболия сосудов различной локализации занимает одно из ведущих мест среди причин инвалидизации, смертности и сокращения продолжительности жизни населения [Баркаган З.С. и соавт., 2003].

Блокаторы кальциевых каналов - сравнительно молодая, большая, весьма неоднородная по химической структуре и фармакологическим свойствам группа лекарственных препаратов [Воронина Т.А., 2000]. Следовательно, изыскание новых препаратов данной группы и изучение их фармакологических свойств является важным направлением современной науки.

Цель исследования. Изучение антиаритмического действия и влияния на систему свёртывания крови, а также центральную нервную систему веществ 2Н-1-бензопиран-2-онового ряда. Оценка эффективности и безопасности соединений в зависимости от их химической структуры.

Задачи исследования:

1. Исследовать антиаритмическое действие субстанций 2Н-1-бензопиран-2-онового ряда на различных моделях.

2. Определить антикоагуляционные эффекты, связанные с кумариновой природой веществ.

3. Оценить антигипоксическую активность 2Н-1-бензопиран-2-онов.

4. Провести анализ анксиолитической активности и влияния на когнитивные функции субстанций АВД - 33, АВД - 6, АВД - 7, АВД - 14.

5. Выявить зависимость фармакологической активности и острой токсичности веществ от их химической структуры.

Положения, выносимые на защиту:

1. Вещества 2Н-1-бензопиран-2-онового ряда обладают антиаритмической активностью, превосходящей в ряде случаев таковую у препарата сравнения.

2. Субстанции АВД-14 и АВД-20 проявляют антикоагуляционный эффект не являясь 4-оксикумаринами.

3. Некоторые субстанции 2Н-1-бензопиран-2-онового ряда оказывают ноотропное (АВД-33) и анксиолитическое (АВД-6 и АВД-7) действие.

4. Применение 2Н-1-бензопиран-2-онов увеличивает продолжительность жизни и выживаемость животных на различных моделях гипоксии. Установлена выраженная корреляция между антигипоксическим и антиаритмическим эффектами соединений АВД-16, АВД-20, АВД-33, АВД-34, АВД-115.

Научная новизна исследования. Впервые изучен комплекс антиаритмических, антикоагуляционных и центральных эффектов 2Н-1-бензопиран-2-онового ряда и взаимосвязь указанного спектра фармакологической активности данных веществ с их химическим строением.

Впервые показано антикоагуляционное действие кумариновых соединений, не являющихся 4-оксикумаринами. Для некоторых веществ выявлены анксиолитический и ноотропный эффекты, сравнимые с таковыми у нимодипина.

Практическое значение работы. Результаты работы по изучению взаимосвязи «фармакологический эффект-химическое строение» могут служить основой для разработки новых высокоэффективных блокаторов кальциевых каналов.

Данные об антиаритмическом действии субстанции АВД-34 легли в основу заявки на изобретение № 2010108315/15 РФ от 05.03.2010 (Антиаритмическое средство на основе 4-метил-7,7'-этилендиокси-2Н-1-дибензопиран-2,2'-диона/А.З. Абышев, В.А. Крауз, Д.Ю. Ивкин. Патент № 2427368 от 27 августа 2011 года).

Материалы диссертации используются в учебном и лекционном процессе Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии на дисциплинах фармакология, клиническая фармакология и фармацевтическая химия.

Личный вклад соискателя. Автором самостоятельно проведён аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме. Фармакологические исследования, анализ, интерпретация и изложение полученных данных выполнены автором лично.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждались на заседаниях кафедры фармакологии СПХФА (2008-2011); на секционном заседании «Проблемы и перспективы развития фармацевтической науки и практики» в рамках IX Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2009), Межвузовской научной конференции студентов и молодых учёных «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», посвященной 90-летию СПХФА (Санкт-Петербург, 2009), конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2010), Международной научной конференции, посвящённой 80-летию Азербайджанского медицинского университета (Баку, 2010), конференции молодых учёных, посвящённой 120-летнему юбилею Научно-исследовательского института экспериментальной медицины СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2010), ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2010), Пятой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Здоровье-основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения» (Санкт-Петербург, 2010) .

Апробация диссертации прошла на совместном межкафедральном заседании кафедр фармакологии, физиологии и патологии, биохимии, фармацевтической химии и лаборатории фармакологических исследований СПХФА 18 мая 2011 года.

Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии. Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ кафедры фармакологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии «Изучение эффектов лекарственных средств растительного и синтетического происхождении на адаптационные возможности организма при экстремальных и патологических состояниях», № госрегистрации 01200955008.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном перечнем ВАК; получен патент на изобретение.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 18 таблицами, библиографический указатель содержит 143 источника, из них 85 отечественных и 58 зарубежных.

Материалы и методы исследования

Для проведения экспериментальных исследований использовали самцов белых беспородных мышей массой 18-20 г (n=460) и белых беспородных крыс массой 180-200 г (n=840), полученных из питомника РАМН Рапполово. Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе со свободным доступом к воде и пище.

Изучаемые вещества. В работе изучена фармакологическая активность 22 комбинированных гетероциклических соединений, 19 из которых относятся к 2Н-1-бензопирановому ряду, а остальные 3 содержат соответствующие заместители, что позволяет судить о зависимости фармакологической активности и безопасности исследуемых веществ от их химического строения. Данные вещества получены в ходе многолетнего синтеза и отбора доктором химических наук профессором А.З. Абышевым и его сотрудниками. Химические формулы и номенклатурные названия веществ представлены в таблице 1 и в дальнейшем упоминаются под кодами АВД-№. Данные соединения разбиты на 5 подгрупп по особенностям строения и присоединения различных радикалов.

Таблица 1. Структура изучаемых соединений

Препараты сравнения. При исследовании антиаритмических свойств в качестве референс-препаратов использовали верапамил и диуманкал (модели хлоридкальциевая и оуабаиновая) и нифедипин (модель аритмии перевязки левой коронарной артерии), гемокоагулометрических показателей - варфарин, центральных эффектов - нимодипин («Нимотоп»), антигипоксической активности - препарат «Гипоксен» и триметазидин. Указанные препараты вводились в терапевтических дозах, пересчитанных на животных [Хабриев Р.У., 2005] .

Методы исследования. Определение острой токсичности (ЛД ₅₀) осуществляли по методу Прозоровского на белых беспородных мышах-самцах массой 18-20 г. Исследуемые вещества вводили внутрибрюшинно в различных дозах и по таблице определяли острую токсичность [Прозоровский В.Б,1978].

В качестве скриннингового исследования антиаритмической активности субстанций, являющихся по факту блокаторами кальциевых каналов, использовали модель хлорид кальциевой аритмии. Соединения в выбранных дозах (на аналогичной модели на мышах с последующим пересчётом на крыс) вводили 22 группам белых беспородных крыс-самцов массой 180-200 г (10 особей в каждой) в хвостовую вену. Контрольной группе белых крыс вводили равновеликий объём воды для инъекций с добавлением твина-80. Через 2 минуты после этого животным внутривенно вводили 10% раствор хлорида кальция в дозе 330 мг/кг. Препаратами сравнения были выбраны верапамил (10мг/кг) и диуманкал (0,1мг/кг). Электрокардиограмму регистрировали во II стандартном отведении, учитывая процент крыс с аритмией, с нарушением проводимости, длительность аритмии и процент гибели животных. Эффективные на данной модели вещества исследовали на оуабаиновой модели аритмии и аритмии перевязки левой коронарной артерии.

При моделировании оуабаиновой аритмии изучаемые соединения вводили внутривенно за 2 минуты до инъекции оуабаина в дозе 0,3 мг/кг. Электрокардиограмму регистрировали во II стандартном отведении каждые 2 минуты в течение получаса. Эффективность исследуемых веществ оценивали по их способности предупреждать гибель животных по сравнению с таковой в группе контроля.

Модель аритмии желудочкового типа воспроизводили путём нарушения кровоснабжения миокарда. Исследование проводили по методике острой окклюзии коронарной артерии у крыс. Наркотизированную эфиром крысу фиксировали на препаровальном столике и вскрывали грудную клетку в 4 подреберье слева. Под левую коронарную артерию подводили лигатуру, концы нити выводили наружу и зашивали послойно мышцы и кожу. Через 3 дня снимали ЭКГ во II стандартном отведении до и после затягивания нити. Субстанции и препараты сравнения вводили за 2 минуты до ишемизации миокарда. Наблюдали развитие признаков ишемии миокарда: снижение вольтажа зубца R, подъём интервала ST. Каждая группа животных состояла из 10 белых беспородных крыс-самцов. После проведения эксперимента животных вскрывали с целью подтверждения правильности операции [Хабриев, 2005].

Для оценки гемокоагуляционных эффектов использовали готовые тест-системы к гемокоагулометру марки «Сoagulometr-1» «Тех-Фибриноген-тест», «Тромбо-тест», «Техпластин-тест», «АПТВ-тест», выпускаемые ООО «Технология-стандарт» [Баркаган З.С., 2001], проводили подсчёт тромбоцитов в камере Горяева [Луговская С.А. и соавт., 2006], оценивали общее состояние, ЭКГ и гистологические срезы внутренних органов животных. Крыс разделили на группы по 5 особей в каждой: 1-контрольная-интактные животные, получавшие очищенную воду с добавлением твина-80, 2-крысы, получавшие варфарин в дозе 0,43 мг/кг, остальные-крысы, получавшие субстанции вновь синтезированных производных диуманкала и диуманкал соответственно. Субстанции и препарат сравнения (варфарин) вводили перорально, предварительно эмульгировав твином-80 в воде очищенной. Животные получали соответствующие вещества в течение 7 дней, после чего проводились запись ЭКГ во 2ом стандартном отведении с помощью прибора «Heart Mirror-3» [Хабриев, 2005] и забор крови из губы с определением тромбоцитов и дальнейшим двукратным центрифугированием (1000 и 3000 об/мин) с целью получения плазмы и отделения форменных элементов. Состояние животных оценивали визуально, отслеживали летальность в ходе эксперимента. Крыс забивали и проводили гистологию внутренних органов.

Оценка протромбинового времени. Определение протромбинового времени использовали для тестирования факторов протромбинового комплекса (II - протромбина, V, VII, Х) и контроля за лечением антикоагулянтами непрямого действия.

Определение активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ). АПТВ-ЕI-тест предназначен для выполнения базовой методики исследования системы гемостаза - определения активированного парциального (частичного) тромбопластинового времени (АПТВ или АЧТВ).

Определение фибриногена (хронометрический метод по Clauss). Принцип метода заключается в определении времени свертывания разбавленной цитратной плазмы избытком тромбина. Время свертывания при этом пропорционально концентрации фибриногена.

Определение тромбинового времени. Позволяет диагностировать нарушения конечного этапа свертывания. [Луговская С.А.,2006]

Антигипоксический эффект соединений исследовали на белых мышах- самцах массой 18-20 г на гемической, гистотоксической и гиперкапнической моделях гипоксии по сравнению с Гипоксеном и триметазидином. Использование двух референс-препаратов (гипоксен и триметазидин) даёт возможность сравнивать эффективность субстанций на фоне абсолютно различных механизмов действия. Так, триметазидин оптимизирует обмен энергии кардиомиоцитов в условиях кислородного голодания, препятствуя повреждающему действию свободных радикалов, сохраняя целостность клеточных мембран и поддерживая сократительную функцию миокарда за счёт предотвращения снижения внутриклеточного АТФ. Гипоксен же, сочетает в себе как антигипоксическое, так и антиоксидантное действие (за счет наличия тиосульфатной группы). Обладает электронно-акцепторными свойствами (обусловлены полифенольной структурой), шунтирует митохондриальную цепь переноса электронов и повышает эффективность тканевого дыхания, препятствует развитию реакций свободнорадикального окисления и образованию перекисей липидов, стимулирует разрушение продуктов перекисного окисления. В постгипоксическом периоде способствует быстрому окислению накопленных восстановленных эквивалентов - никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ, НАДФН2), оптимизирует работу митохондрий и улучшает тканевое дыхание. Поддерживает высокий уровень тканевого дыхания и аэробных процессов в митохондриях, нивелирует негативные последствия гипоксии, увеличивает толерантность к физическим и умственным нагрузкам. Субстанции в определённых ранее дозировках и препараты сравнения в соответствующих дозах вводили внутрибрюшинно, предварительно эмульгируя в воде добавлением твина 80. Результаты интерпретировали по продолжительности жизни животных, а также по проценту выживаемости.

Модель гемической гипоксии воспроизводили путем введения исследуемых субстанций за 30 минут до инъекции 2%-го раствора натрия нитрита в дозе 200 мг/кг. Данный опыт позволяет смоделировать взаимодействие ядовитых веществ с гемоглобином крови, вследствие которого затрудняется перенос кислорода к тканям и органам.

Модель гистотоксической гипоксии получали путём введения раствора нитропруссида натрия в дозе 20 мг/кг в тех же условиях. Данный агент обеспечивает снижение утилизации кислорода тканями организма.

Модель гипоксии с гиперкапнией позволяет оценить состояние организма, находящегося в замкнутом пространстве с повышающейся долей углекислого газа и снижением процентного содержания кислорода в воздухе. Мышей, получивших за полчаса до этого определённые субстанции, помещали в закрытые герметично стеклянные банки объёмом 250 мл, которые переворачивали вверх дном и опускали в поднос с водой для избежания попадания воздуха.

При моделирование хронической невротизации крыс (модель “конфликт афферентных возбуждений”) в качестве стрессоров использовали экстероцептивные раздражители - свет электрической лампочки мощностью 300 вт, звук электрического звонка интенсивностью 60 дб и электрический ток пороговой величины. Раздражители действовали в соответствии с программой, составленной Ф.П. Ведяевым [Ведяев Ф.П., 1977]. Цикл предъявления раздражителей длился 8 мин. Время действия каждого раздражителя, применяемого отдельно, а также в сочетании с другими раздражителями, во всех случаях программы различно и интервалы между ними также неодинаковы. Модель создавали в течение 1 месяца, ежедневно помещая животных на 2 часа в условия невротической ситуации. Экспериментальную невротизацию каждый день проводили в различное время суток, для того чтобы предотвратить адаптацию животных к стрессовым воздействиям.

В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) оценивали анксиолитическую активность субстанций. В течение эксперимента определяли время, проведённое животными в открытых и закрытых рукавах, число заходов в открытые и закрытые рукава, количество свешиваний и выглядываний с открытого рукава, количество стоек, груминг, время нахождения на центральной площадке, латентный период первого захода в открытый рукав, число уринаций и дефекаций. Увеличение числа заходов крыс в открытые рукава, времени пребывания в них по сравнению с контролем в тесте ПКЛ свидетельствует о наличии анксиолитической активности у исследуемых веществ, а относительные показатели характеризуют степень селективности анксиолитика [Воронина Т.А., 2000].

В тесте «условная реакция пассивного избегания» (УРПИ) оценивали влияние веществ на когнитивные функции [Буреш Я. и соавт., 1991].

Воспроизведение УРПИ проводили через 24 часа, на 3-е, 4-е, 5-е, 7-е и 10-е сутки после обучения. Животное помещали в светлую камеру и в течение 3 минут регистрировали латентный период (ЛП) первого захождения крысы в тёмную камеру, время нахождения её в освещённой и тёмной камере и число зашедших в тёмную камеру животных. Незахождение крысы в тёмную камеру расценивали как сохранение навыка пассивного избегания, а укорочение времени её нахождения в освещённой камере и заход животного в тёмную камеру - как амнезию навыка [Хабриев, 2005].

Статистическая обработка результатов исследования. Экспериментальные данные подвергнуты статистической и аналитической обработке с помощью программы BIOSTAT 4.03 [Гланц С., 1999]. Для статистической оценки использовали одно-, двух- и многофакторный дисперсионный анализ. Статистический метод анализа двух выборок применяли для попарного сравнения групп. Достоверность различий также выявляли с помощью теста Стьюдента или непараметрических критериев Манна - Уитни - Уилкоксона. Числовые данные приведены как среднее значение ± ошибка среднего. Различия считали значимыми при p < 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

До изучения фармакологической активности соединений кумаринового ряда нами в предварительных опытах было проведено определение их острой токсичности при однократном внутрибрюшинном введении растворов данных веществ. Градация степеней токсичности осуществлялась по Hodge и Sterner [Хабриев, 2005] умножением полученных для крыс доз на коэффициент 10,0 с целью перевода на пероральные дозы с поправкой пересчёта на мышей 1:2.

Группа №1 представлена комбинированными с аденином производными 2Н-1-бензопиран-2-она, а также замещёнными производными аденина, не имеющими в структуре 2Н-1-бензопиранового цикла. Соединение АВД-2, являющееся комбинацией аденинового и бензопиранового циклов, проявляет острую токсичность, схожую с таковой у соединений АВД-114 и АВД-121, являющихся хлоралкил - замещёнными производными аденина с различной длиной боковой цепи. В то же время, замена в структуре АВД-2 бензопиранового цикла на меркаптотетразолил, повышает токсичность соединения (АВД-33) практически вдвое, а введение по 4-ому положению бензопиранового цикла метильной группы (АВД-5) лишь на 15% изменяет величину данного показателя. LD₅₀ варьирует от 1380,0 до 2100,0 мг/кг. Следовательно, вещества данной группы относятся к практически нетоксичным.

Вещества группы №2 являются комбинированными производными бензопиранового и меркаптотетразолилового циклов, соединённых по различным возможным положениям, с введением или без дополнительных боковых радикалов. LD₅₀ этих соединений лежит в пределах 560,0 - 780,0 мг/кг, что позволяет отнести вещества к малотоксичным. Если сравнивать соединения данной группы с АВД-33, можно сделать вывод о том, что введение в их структуру кумаринового цикла вместо аденинового, повышает острую токсичность почти вдвое. АВД-7 и АВД-10 обладают несколько меньшей токсичностью, чем АВД-6, что обусловлено отсутствием в их структуре метильного радикала по 4-ому положению.

Вещества группы №3 содержат только кумариновые циклы и являются моно- или димерами замещённых производных 2Н-1-бензопиран-2-она. Так, АВД-15 - кумарин, АВД-16 - умбеллиферон, АВД-20 - разработанный и зарегистрированный в Российской Федерации профессором А.З. Абышевым и соавторами, разрешённый к применению высокоэффективный антиаритмический препарат диуманкал (анкардин), субстанции АВД-34 и АВД-125 - производные диуманкала, моно- и диметилзамещённые по 4 и 4,4'-положениям. Наиболее токсичным соединением является АВД-15, при введении гидрокси-группы по 7-ому положению (АВД-16) токсичность уменьшается более чем в 2 раза, а при димеризации - почти в 4 раза. АВД-15 и АВД-16 являются малотоксичными, а АВД-20,34,125 - практически нетоксичными соединениями. Сохраняется тенденция к тому, что замещённые по 4ому положению метильными группами бензопираны более токсичны, чем незамещённые.

Группа №4 представлена тремя производными 2Н-1-бензопиран-2-она, конденсированными с пиридиниобромидом. АВД-115 - комбинация кумарина с пиридиниобромидом через этиленовый мостик (С₂), токсичность - минимальная в группе. С увеличением длины углеродной цепочки с С₂ до С₄ и введением метильного радикала по 4-ому положению кумаринового цикла токсичность несколько возрастает, однако варьирует от 1790,0 до 2100,0 мг/кг, что позволяет отнести вещества группы к практически нетоксичным.

Группа № 5 представлена шестью производными 2Н-1-бензопиран-2-она. АВД-14 и АВД-18 - кумарины, соединённые по 4-ому положению с имидазольным циклом через С₂ и С₃ соответственно, в АВД-51 оба цикла соединены по 7-ому положению кумаринового ядра, АВД-41 и АВД-87 представляют собой дикумарины, так или иначе замещённые по 4,4'-положениям. АВД-23 - бензопиран, замещённый по 4-ому положению остатком уксусной кислоты, а по 7-ому - метокси-группой. Сравнивая АВД-14, АВД-18 и АВД-51, обладающие максимальной токсичностью в группе, можно говорить о том, что замена атома водорода по 4-ому положению на другую функциональную группу повышает токсичность соединения, как и увеличение длины мостика с С₂ до С₃. АВД-41 и АВД-87 являются более токсичными соединениями, нежели АВД-20, 34, 125, конденсированные по 7,7'-положениям. 4,7-замещённый монокумарин АВД-23 более токсичен, чем дикумарины. АВД-14, 18, 23, 51 можно отнести к малотоксичным, а АВД-41 и АВД-87 к практически нетоксичным соединениям.

Таким образом, введение в структуру исследуемых соединений кумаринового цикла делает вещество более токсичным, чем аденинового, пиридинового, менее, чем имидазольного и меркаптотетразолилового. Димеры кумаринов менее токсичны, чем мономеры. Увеличение длины кондесационного мостика повышает токсичность. Замещение атома водорода по 4-ому положению кумаринового цикла приводит к увеличению острой токсичности. Исследованные вещества относятся к малотоксичным или практически нетоксичным соединениям.

По проведенным ранее исследованиям [Абышев А.З. и соавт., 2003] можно сделать вывод о том, что эффективная антикальциевая доза для соединений, синтезированных профессором А.З.Абышевым лежит в пределах 0,1-1,0 мг/кг. Поэтому, скрининг-тестом, определяющим эффективные дозы нами была выбрана модель хлоридкальциевой аритмии у мышей. Показателем к выбору той или иной дозы вещества для дальнейшей работы служил процент смертности среди мышей при введении летальной дозы кальция хлорида (ЛД₁₀₀). Изучаемые вещества относятся к классу блокаторов кальциевых каналов, поэтому выбор данной модели представлялся нам целесообразным. Дозы, оптимальные по результатам эксперимента, представлены в таблице 2.

Таблица 2.Эффективные дозы исследуемых веществ.

Таким образом, были определены эффективные по основному механизму действия дозы (ED ф.-фактические), в дальнейшем экстраполированные на крыс по коэффициенту 2:1 ( ED р.-расчётные).

Данные по всем проведённым нами исследованиям представлены в таблице 3.

Эффекты изучаемого нами класса соединений можно назвать плейотропными. Данный термин употребляется в научных дискуссиях в основном для статинов, однако, его возможно использовать и при описании множественных положительных эффектов блокаторов кальциевых каналов. В мировой медицинской практике для лекарственных препаратов, полученных на основе природных и синтетических производных 2Н-1-бензопиран-2-онового ряда, доказана выраженная спазмолитическая (вибелин, димидин, карбокромен), гипотензивная, антилейкодермическая (аммифурин, бероксан, псорален), противоопухолевая (гейпарварин, пеуцеданин), антиаритмическая (диуманкал), антикоагуляционная (неодикумарин, синкумар, варфарин), адренолитическая активность, что обуславливает их применение при лечении широкого спектра заболеваний [Клюев М.А. и соавт., 1995; Машковский М.Д., 2000]. Для субстанций, синтезированных в течение последних десятилетий профессором А.З. Абышевым и его сотрудниками, обнаружены также кальцийантагонистическое, иммуномодулирующее, противовирусное, антимикробное, синаптотропное и другие эффекты [Абышев А.З. и соавт.,2003].

Нас же интересовали в большей степени антиаритмическое действие, антикоагуляционные, антигипоксические и центральные эффекты, которые можно объяснить способностью воздействия субстанций на кальциевые каналы. В ходе исследования было отмечено, что эффективные соединения зачастую обладают комплексом полезных свойств, поэтому нам показалось целесообразным объединить результаты, в таблицу 3. В данной таблице изучаемые вещества расположены по группам в соответствии с химическим строением, а эффективность рассматривается по сквозной строке. Указан также класс токсичности.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таблица 3 Спектр фармакологической активности исследуемых соединений 2Н-1-бензопиран-2-онового ряда.

Примечания. ХКА - хлоридкальциевая модель аритмии, ОА - оуабаиновая модель аритмии, АП - аритмия перевязки левой коронарной артерии, ГемГ - гемическая модель гипоксии, ГисГ - гистотоксическая модель гипоксии, ГипГ - модель гипоксии с гиперкапнией в гермообъёме, ПН - практически нетоксично, МТ - малотоксично, «0» - не проявляет эффекта, «±» - эффект ниже, чем у препарата сравнения, «+» - эффект сравним с таковым у референс-препарата, «-» - эффект не определяли, «++» - эффект, превышающий таковой у препарата сравнения, (Н) - ноотропный, (А) - анксиолитический.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Как видно из таблицы 3, в группе 1 четыре субстанции из пяти (АВД-2, 33, 114, 121) обладают выраженным антикальциевым действием. Вещество АВД-2 эффективно на фоне хлоридкальциевой и оуабаиновой моделях аритмии, не оказывает действия на модели аритмии перевязки, равно как и антикоагуляционного эффекта. Антигипоксическое действие слабое. Вещество АВД-33 эффективно на всех воспроизведённых моделях аритмий, проявляет также антигипоксическую активность, превышающую на двух моделях из трёх таковую у триметазидина, обладает ноотропным действием. АВД-114, несмотря на антикальциевую активность (интерпетируемую нами по результатам хлоридкальциевой модели), эффективно лишь на модели аритмии перевязки. АВД-121 эффективно на хлоридкальциевой модели. АВД-5 не проявляет ни одного из изученных эффектов.

Резюмируя результаты, полученные по веществам из группы 1, можно говорить о том, что антикальциевая активность не всегда однозначно тождественна эффективности при строфантиновой модели аритмии и модели аритмии перевязки левой коронарной артерии, проявлению антигипоксической активности. В то же время, можно сделать вывод о некоторой корреляции данных между результатами по модели аритмии перевязки левой коронарной артерии и эффективностью на модели гипоксии с гиперкапнией, что может быть связано с антиишемическим действием. Все субстанции группы практически нетоксичны. Нет субстанций, обладающих антикоагуляционным действием.

В группе 2 нами исследовались три малотоксичных вещества. АВД-6, проявляя активный антикальциевый эффект, оказывало также анксиолитическое действие. АВД-7, эффективное на всех трёх моделях аритмии, обладало анксиолитическим действием, превосходившим таковое у препарата сравнения. Субстанция АВД-10 представляется нам слабым антиаритмическим средством. Антигипоксическое действие у веществ группы практически не выражено, что позволяет связать эффективность субстанции АВД-7 на модели аритмии перевязки левой коронарной артерии как раз с блокадой кальциевых каналов (в отличие от веществ группы 1). Веществ, обладающих антикоагуляционным действием в группе нет.

В группе 3 субстанция АВД-15 имеет слабое антикальциевое и анигипоксическое действие, АВД-125 - также, но обладает некоторой антикоагуляционной активностью. Вещества АВД-16, 20, 34 эффективны на всех воспроизведённых моделях аритмии и гипоксии, проявляют антикоагуляционную активность, причём у субстанции АВД-20 (диуманкал) влияние на систему свёртывания крови более выраженое, чем у варфарина. Эффективность субстанций АВД-16 и АВД-34 на модели перевязки левой коронарной артерии можно объяснить как антикальциевой активностью, так и антигипоксической, тогда как у АВД-20 антикальциевое действие ниже, чем у верапамила. В то же время АВД-20 чрезвычайно эффективен при перевязке левого коронара, что, по-видимому, объясняется выраженным антигипоксическим действием. Вещества группы малотоксичны или практически нетоксичны.

В группе 4 исследовалась эффективность трёх практически нетоксичных веществ. АВД-56 и АВД-94 малоэффективны или неэффективны, АВД-115 проявляет умеренную эффективность в отношении аритмий и гипоксии. В данной группе нет субстанций, обладающих антикоагуляционным действием.

В группе 5 только две субстанции из шести обладают антиаритмическим и антигипоксическим действием (АВД-23 и АВД-87). У веществ АВД-14, 41, 51 выявлено антикоагуляционное действие, у субстанции АВД-14 по совокупности показателей (влияние на протромбиновое, тромбиновое, активированное частичное тромбопластиновое время, концентрацию фибриногена; безопасность) - действие, превышающее таковое у варфарина. Вещество АВД-18 неэффективно вовсе. Можно сделать вывод о том, что влияние на систему свёртывания крови не связано с антикальциевым действием, так как у многих веществ, активных на хлоридкальциевой модели аритмии, оно отсутствует. Все вещества группы малотоксичны или практически нетоксичны.

Необходимо отметить, что антиаритмическая активность некоторых соединений (АВД-20-диуманкал и АВД-16-умбеллиферон) была изучена до нас [Абышев А.З, Дьячук Г.И., 1998] и лишь подтверждена в наших исследованиях, однако другие аспекты фармакологической активности (например, антикоагуляционное действие) выявлены впервые. Изучению центральных эффектов представленных веществ также был посвящён ряд работ, вследствие чего нами были рассмотрены влияния на ЦНС лишь АВД-33 (ноотропное действие), АВД-6 и АВД-7 (анксиолитическое действие) и АВД-14 (отсутствие анксиолитического и ноотропного эффектов).

Резюмируя вышеизложенное, можно сказать о том, что некоторые из исследованных субстанций обладают суммой положительных эффектов, что при внедрении в медицинскую практику чрезвычайно актуально и позволит избежать полипрагмазии. В частности, представляются перспективными комбинации антиаритмического и анксиолитического эффектов у АВД-6 и АВД-7, антиаритмического, антигипоксического и ноотропного у АВД-33, антиаритмического и антигипоксического у многих исследованных субстанций, антиаритмического, антикоагуляционного и антигипоксического у АВД-20 (диуманкала). Возможно, это позволит уменьшить количество лекарственных препаратов, потребляемых пациентами с заболеваниями сердечно-сосудистой системы, учитывая в особенности качественно низкую токсичность исследуемых соединений.

Из 22 исследованных соединений 19 относятся к кумаринам, а 3 содержат определённые заместители, позволяющие сделать выводы о связи «строение-эффект». Кумарины являются производными орто-гидроксикоричной (о-кумаровой) кислоты, в основе их структуры лежит 9,10-бензо-2-пирон. Цис-форма орто-гидроксикоричной кислоты (кумариновая кислота) неустойчива и подвергается лактонизации с образованием соответствующего лактона-кумарина. Была высказана гипотеза [Абышев А.З., 2006], что на фармакологические свойства веществ данной группы влияет их полярность или неполярность. Кумарины - неполярные соединения, но, в зависимости от наличия некоторых функциональных групп, могут приобретать полярность. Наименее полярными являются ацилокси- и алкоксикумарины, наиболее полярны - оксикумарины и их гликозиды, что повышает их растворимость в воде. Кроме того, все без исключения кумарины растворимы в жирах и эфирных маслах. Таким образом, по нашему мнению, полярность того или иного изученного соединения характеризует не фармакологический эффект, а его биодоступность. Наличие же той или иной фармакологической активности зависит от пространственного строения вещества.

Известно, что кумариновый цикл сам по себе не влияет на свертывание крови, но может быть метаболизирован в 4-гидроксикумарин, затем, в процессе брожения - в дикумарол, обладающий высокой антикоагуляционной активностью. При наличии рацемической смеси один из энантиомеров может быть гораздо активнее других. К примеру, для варфарина S-форма в 5 раз активнее R-формы по отношению к противосвертывающей системе.

В то же время, из группы 4-гидроксикумаринов всё реже используют в клинике синкумар и неодикумарин. Фенилин, отличающийся от препаратов данной группы по строению, но близкий по механизму действия, и варфарин, широко применяемый в медицинской практике, обладают массой противопоказаний и побочных действий. В арсенале лечения патологий, связанных с образованием тромбов, помимо антикоагулянтов непрямого действия имеются антикоагулянты прямого действия (гепарин, надропарин, эноксапарин, гирудин), антиагреганты (тиклопидин, клопидогрел, ацетилсалициловая кислота, дипиридамол, комбинации клопидогрела и аспирина), фибринолитики прямого (фибринолизин) и непрямого (стрептокиназа и альтеплаза) действия. Это говорит о многообразии возможностей влияния на систему свёртывания крови. Антикоагуляционная эффективность субстанции АВД - 20 могла бы быть связана с активным антикальциевым действием диуманкала, исходя из того, что ион кальция является одной из ключевых точек каскада реакций, приводящих к образованию тромба. Однако, не менее эффективное вещество АВД -14, не обладает выраженной способностью к блокаде кальциевых каналов. Кроме того, эффективность веществ наблюдалась только in vivo при пероральном приёме, что говорит о непрямом механизме их действия.

Для препарата «Прадакса» (Boehringer Ingelheim) описан еще один вариант механизма антикоагуляционного действия. Прадакса (дагибатрана этексилат) - антикоагулянт, непрямой ингибитор тромбина (пероральный), низкомолекулярное пролекарство, не обладающее фармакологической активностью. После приема внутрь быстро всасывается и путем гидролиза, катализируемого эстеразами, превращается в дагибатран, являющийся активным, конкурентным, обратимым прямым ингибитором тромбина и оказывающим действие в основном в плазме крови. Так как тромбин (сериновая протеаза) превращает в процессе коагуляции фибриноген в фибрин, то угнетение его активности препятствует образованию тромба. Дагибатран ингибирует свободный тромбин, фибринсвязывающий тромбин и вызванную тромбином агрегацию тромбоцитов. Доказано, что дагибатран удлиняет активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ). Субстанции АВД - 20 и АВД - 14 также оказывают влияние на этот показатель. Дагибатрана этексилат - безусловно эффективный препарат. Однако, в Российской Федерации показания к его применению ограничены профилактикой венозной тромбоэмболии у больных после ортопедических операций. Кроме того, он не применяется у пациентов с почечной недостаточностью, которая не является противопоказанием к применению большинства блокаторов кальциевых каналов.

Опосредование эффекта антикальциевой активностью было замечено нами при изучении антигипоксического действия исследуемых веществ. Нитрит натрия и углекислый газ являются ингибиторами цитохромоксидазы-терминального фермента дыхательной цепи. В результате их воздействия развивается ишемия. Известно, что в условиях гипоксии концентрация кальция в нервных клетках и клетках миокарда значительно повышается, в то время как в среде с существенно сниженным уровнем ионов кальция гипоксическое повышение его внутриклеточного уровня резко снижается [Зарубина И.В., Шабанов П.Д., 2004]. Взяв за основу утверждение о том, что гипоксия вызывает изменения активности плазменной кальциевой - АТФ-азы с последующим повышением внутриклеточного уровня иона кальция, мы предположили, что вещества 2-Н-1-бензопиран-2-онового ряда, являясь активными блокаторами кальциевых каналов, станут эффективно предупреждать развитие гипоксии, что и было подтверждено в ходе эксперимента..

Таким образом, взаимосвязь «антикальциевая» - антигипоксическая активность была замечена нами по результатам исследования веществ 2Н-1-бензопиран-2-онового ряда.

Если сравнивать вещества под лабораторными шифрами АВД с группой антагонистов ионов кальция 1,4 - дигидропиридинового ряда, необходимо сказать следующее.

Кальций-антагонистическая активность нифедипина (3,5-диметиловый эфир 1,4-дигидро-2,6-диметил-4-(2-нитрофенил)-3,5-пиридинкарбоновой кислоты) обусловлена наличием в его структуре 4-фенил-1,4-игидропиридина, нитрогруппы во втором положении цикла «А» и карбоксиметильных групп в цикле «В». Эти химические особенности позволяют воздействовать преимущественно на кардиомиоциты и сосуды сердца, препарат не проходит гематоэнцефалический барьер. Нимодипин же более избирательно воздействует на сосуды головного мозга (в 100 раз сильнее, чем на сосуды сердца), что связывается некоторыми авторами с наличием в структуре нимодипина в положениях 3 и 5 карбоксиэтилметоксильной и карбоксиизопропильной групп соответственно [Абышев А.З. и соавт., 2009]. АВД-33 действует и на сердце, и на головной мозг, что и обуславливает наличие выраженного антиаритмического и ноотропного эффектов.

Противоаритмическая активность умбеллиферона (АВД-16) была установлена в дозе 1 мг/кг и отражена в работах Абышева А.З., Бродского И.В., Денисенко П.П., Дьячука Г.И., Мельника Ю.К.[1990-2004]. На хлорид кальциевой модели аритмии этими авторами описывалось предупреждение гибели животных умбеллифероном, восстановление синусового ритма в 100% случаев и большая активность субстанции по сравнению с хинидином, новокаинамидом и лидокаином. Нами получены сопоставимые данные по эффективности данного вещества в дозе 0,5 мг/кг, с той лишь разницей, что референс-препаратом служил верапамил, активность которого была существенно меньше. В то же время острая токсичность LD₅₀ АВД - 16, равная 235,0 мг/кг для умбеллиферона не соответствовала полученным нами данным (920,0 мг/кг).

На основании результатов проведённых нами исследований получен патент по соединению АВД - 34 (представлен в приложении диссертации).

Выводы

1. Среди комбинированных гетероциклических соединений 2Н-1-бензопиран-2-онового ряда выявлены субстанции АВД-7, 16, 20, 33, 34, 115 обладающие антиаритмическим действием.

2. Вещества АВД-14 и АВД-20 оказывают антикоагуляционное действие, сравнимое качественно и количественно с таковым у варфарина.

3. У соединений АВД-16,20,33,34, с выраженной антикальциевой активностью, выявлены антигипоксические свойства, выгодно отличающие их от других блокаторов кальциевых каналов. На модели окклюзии левой коронарной артерии установлена корреляция между антигипоксической активностью исследованных соединений и их антиаритмическим действием.

4. Вещество АВД-33 проявляет ноотропные свойства, а субстанции АВД-6 и АВД-7 - анксиолитическое действие.

5. Существует зависимость фармакологической активности исследованных веществ от их химической структуры. Так, в большей степени на эффективность субстанций влияет природа заместителей и положение их присоединения, а в меньшей - гидро- и липофильность.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Оценка антиаритмического действия новых комбинированных гетероциклических соединений, их эффективности и безопасности / В.А. Крауз, А.З. Абышев, Д.Ю. Ивкин, В.Г. Лужанин //Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова. - 2009. - №4(33). - С. 154-156.

2. Ивкин, Д.Ю. Оценка острой токсичности и антигипоксического действия комбинированных гетероциклических соединений 2Н-1-бензопиранового ряда / Д.Ю. Ивкин // Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении». - Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2009. - Т.25 - №1, прил. часть II.- С. 467.

3. Антиаритмическое средство на основе 4-метил-7,7'-этилендиокси-2Н-1-дибензопиран-2,2'-диона: патент РФ 24273686: МПК А61К 31/352/ А.З. Абышев, В.А. Крауз, Д.Ю. Ивкин; опубл. 27.08.2011.

4. Ивкин, Д.Ю. Изучение фармакологической активности 4-метил-7,7'-этилен-диокси-ди-2Н-1-бензопиран-2,2'-диона / Д.Ю. Ивкин // Медицинский академический журнал. - 2010. - № 5(10). - С. 159.

5. Ивкин, Д.Ю. Изучение острой токсичности и антиаритмических свойств новых комбинированных гетероциклических соединений кумариновой природы / Д.Ю. Ивкин // Тезисы докладов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство» 6-10 апреля 2009 г. - М., 2009. - С.59.

6. Ивкин, Д.Ю. Изучение антиаритмического эффекта гетероциклических соединений кумариновой природы / Д.Ю. Ивкин // Тезисы докладов межвузовской научой конференции студентов и молодых учёных «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», посвящ. 90-летию СПХФА 23-24 апреля 2009 г. - СП...