Исследование возможностей лазерного корреляционного анализатора для определения концентраций основных белков и нереферентных частиц в слюне с использованием биологических меток с молекулярной массой 0,5-2 МДа

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Исследование возможностей лазерного корреляционного анализатора для определения концентраций основных белков и нереферентных частиц в слюне с использованием биологических меток с молекулярной массой 0,5-2 МДа

В.М. Мушта, ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, А.В. Иванов ДЦ «КРОНШТАДТ»

лазерный белок слюна онкологический

Существует несколько способов определения размеров частиц, взвешенных в жидкости. Мы определяем размеры частиц по спектру рассеяния лазерного излучения (по ширине центральной поляризованной Релеевской линии рассеянного света) - Лазерный корелляционный анализ (ЛКА) [1]. Такой метод вносит наименьшее возмущение в изучаемую среду биологических жидкостей и позволяет исследовать их в нативном состоянии.

Такой метод успешно применяется при исследовании и определении размеров частиц и их относительного распределения в биологических жидкостях (сыворотке крови, слюне и т.д.) для решения задач полисистемного саногенетического мониторинга населения [1]. В основе их метода лежит выявление высокомолекулярных ассоциаций частиц в биологических жидкостях. Однако, на наш взгляд, методика исследования образцов при комнатной температуре существенно снижает чувствительность и специфичность при определении риска онкозаболевания.

Применяемый нами модифицированный метод ЛКА [2, 3], позволяет за счёт исследования образцов при температурах 60-90⁰С устранять случайные несвойственные организму ассоциации, образовавшиеся при заборе, хранении, подготовке образца, а также при разбавлении его в водной среде.

Спектр лазерного излучения, рассеянный биологическими жидкостями, состоящими из полидисперсных частиц весьма сложен. Для обработки корреляционной функции используется метод регуляризации по Тихонову [4], который даёт возможность построить гистограмму распределения интенсивности по временам когерентности и, по ней, гистограмму распределения интенсивности рассеяния на частицах (ГРИРЧ) с данным размером.

Восстановление размеров сферических монодисперсных неорганических частиц, при корректной подготовке жидкой среды и выборе концентрации их в среде, при измерении ЛКА по меньшей мере не уступает методу просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ). Для частиц имеющих диаметры 10-500нм. На рис. 1 представлены, для примера, сравнительные измерения частиц ТЕМ и ЛКА. На Рис. 1 представлено восстановленное распределение частиц по размерам из ГРИРЧ (Рис. 1).

Рис. 1 Сравнение измерений размеров частиц SiO₂, покрытых Au ТЕМ и ЛКА.

Однако, восстановление размеров и определение относительной массовой концентрации частиц в таких полидисперсных биологических жидкостях, какими являются сыворотка крови и слюна, без учёта структуры их водно-белкового матрикса не корректно и поэтому существенно снижает диагностическую ценность измерений с помощью ЛКА.

Исследование морфологических структур сыворотки крови и слюны [5, 6, 7] показывает кристаллическую структуру их природы. У здоровых пациентов это высокоупорядоченная структура, которая существенно искажена у пациентов с различными патологиями.

В обзоре [8] по свойствам клеточной воды показано, что все биологические жидкости - пленочные структуры с характерной межплёночной толщиной порядка 100 нм. В таком межплёночном пространстве в вводно-белковом матриксе и находятся белково-неорганические соединения биологических жидкостей.

В [7] нами показано, что слюна - многослойная высокоорганизованная периодическая жидкокристаллическая структура и что характерное расстояние между слоями вводно-белкового матрикса составляет 20-50мкм. Результаты этих исследований позволяют определять структуру частиц слюны для определения относительной массовой концентрации нереферентных частиц после восстановления из измеренных ГРИРЧР с помощью ЛКА.

Рис. 2 Распределение рассеянного лазерного излучения образцов слюны, измеренное ЛКА.

На рисунке 2 приведены ГРИРЧР различных образцов, а на рисунках 3 восстановленное распределение частиц слюны, этих образцов.

Рис. 3

В таб. 1 приведены значения относительных массовых долей частиц различных размеров в образцах слюны. Такие значения в относительном массовом распределении по размерам частиц позволяет выделять в исследуемых группах здоровых пациентов и группы риска онкозаболеваний.

При выявлении диагностических признаков у некоторой части образцов необходимо определить абсолютную концентрацию нереферентных частиц в слюне, что обусловлено существенным отличием концентрации белков в надосадке слюны здоровых пациентов и онкобольных [9]. Поэтому для неявно выраженных по спектру распределения частиц (Рис. 2, 3) необходимо определять абсолютное значение массовой концентрации нереферентных частиц.

Для определения массовой концентрации белков мы подобрали естественный биопрепарат с молекулярной массой 1,5 МДа, выдерживающий нагревание T=80^oC, совместимый со слюной и определили его ГРИРЧ при концентрации 1мг/мл (Рис.10). Добавив фиксированное количество его в образец слюны (Рис. 2), мы получили их ГРИРЧ (Рис. 3). Из восстановленных распределений 13, 14, 15 получено значение массовой концентрации белка в слюне образца (Рис. 4) равное 1,7мг/мл, что близко полученным концентрациям белка в надосадке слюны. Исходя из этого, и значительной массовой доли для образца слюны женщины 42 года (табл. 1) мы получили значения массовых долей для размеров частиц 90-300 нм равное 56 мкг/мл; 400-5000нм равное 4,6нг/мл и 6000-10000нм равное 0,1нг/мл.

Табл.1

Рис. 4 Распределение рассеянного лазерного излучения образцов декстрана, слюны и слюны с декстраном, измеренное ЛКА.

Рис. 5 Восстановленное распределение частиц для образцов соответственно

Выводы

1. Использование биологических меток, совместимых со слюной при её нагреве, имеющих молекулярную массу, близкую к молекулярной массе наиболее крупных и имеющих наибольшую концентрацию белков-муцинов, позволяет определять только методами ЛКА абсолютную массовую концентрацию белков в образце слюны (надосадке). Которые находятся в нативном состоянии, с высокой точностью (10%).

2. Учет характера структуры слюны и организация её воднобелкового матрикса позволяет восстанавливать относительные массовые распределения нереферентных частиц в слюне относительно её основных частиц с неопределенностью менее 10^-8 .

3. Учет:

- характера и закона светодинамического рассеяния на частицах, имеющих не сферическую форму;

- структуры слюны в норме и при отклонении от нормы;

- относительные массовые доли нереферентных частиц в образце слюны;

- абсолютной массовой концентрации частиц в образце слюны, - позволяет определять абсолютную массовую концентрацию нереферентных частиц с неопределенностью менее 0,1 нг/мл.

Разработанные нами методики, модели исследуемой среды и модифицированный технические средства ЛКА позволяют нам обеспечивать при анализе сыворотки крови и слюны специфичность более 95%, чувствительность более 90% при определении риска онкозаболеваний.

Литература

1. Комаров Г.Д., Кучма П.Р., Носкин Л.А. Полисистемный саногенетический мониторинг. М: МИПКРО, 2001.-343с

2. Мушта В.М., Доненко Ф.В., Иванов А.В. и др. Основные результаты пилотных клинических испытаний модифицированного метода ЛКА -- диагностики злокачественных новообразований по сыворотке крови. Сборник научных трудов XVIII Международной научно-технической конференции «Лазеры в науке, технике, медицины», 2008, с.74-85

3. В.М. Уткина, А.В.Иванов, Мушта и др. Особенности выявления скринговый приоритетных групп риска ранней диагностики злокачественных новообразований модифицированным методом ЛКА слюны. Сборник научных трудов XVIII Международной научно-технической конференции «Лазеры в науке, технике, медицины», 2008, с.86-91

4. Брагинская Т.Г., Клюбин В.В. Решение обратной задачи спектроскопии оптического смешения методом регуляризации Тихонова. Препринт №855. АНСССР Ленинградский институт ядерной физики им Б.П.Константинова. 1983.

5. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н. Морфология биологических жидкостей человека. М: Хризостом, 2001.-304с.

6. Харченко С.В., Корнеева Г.А., Ветров А.А. Кристаллические структуры ротовой жидкости, природа и свойства Известия. АН СССР серия биологическая № 3. 1988. с.450-454.

7. Мушта В.М., Старикова Т.А. Международный форум «Интегративной медицины» 2009, сб. Научных трудов выпуск 4, «Слюна -- биоинформационная среда, эффективно определяющая интегративное состояние организма» с.171-179.

8. Н.А. Гамалей, А.Б.Каулин, А.С.Трошин Свойства клеточной воды. Цитология. 1977. Том ХIХ. №12. с.1309-1321.

9. Харченко С.В., Шпаков А.А. Известия. Изучение регуляции активности РНКаз ротовой жидкости у здоровых людей и при раке желудка АН СССР серия биологическая № 1. 1989.с.58-63.

10. Железная Л.А. Структура и функции гликопротеинов слизи муцинов. Рос. ж. гастро-энтер., гепатол., колопрокт.1998. № 1.с. 30-37.

Размещено на Allbest.ru