Княжик сибирский - Atragene speciosa Weinm. сем. Ranunculaceae - многолетнее растение, произрастающее в таежных лесах Сибири. Надземная биомасса его используется в народной медицине для лечения сердечнососудистых, гинекологических и опухолевых заболеваний, как кардиотоническое, противоревматическое, диуретическое, ранозаживляющее, болеутоляющее и общеукрепляющее средства. Исследователями НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН и СибГМУ в княжике сибирском обнаружены фенолоспирты, флавоноиды, антрахиноны, кумарины, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, алкалоиды, тритерпеновые гликозиды, полисахариды, каротиноиды и органические кислоты. Установлено, что экстракт этого растения оказывает ноотропное и противоязвенное действия, обладает противосудорожным, транквилизирующим, стресс-протективным свойствами [1], а также выраженным антистрессорным и противоневротическим действием, не уступая по своей активности диазепаму, но при этом лишен его побочных эффектов. Фракции, полученные из экстракта, проявляют выраженный ноотропный и противоишемический эффекты [2].

Поскольку это вид с разреженным ареалом произрастания, имеются трудности в сборе лекарственного сырья. Жизненная форма княжика сибирского - лиана, поэтому интродукция этого растения невозможна. Интерес к введению его в ассептическую культуру in vitro вызван возможностью получения вышеперечисленных соединений для создания на их основе ноотропного и адаптогенного фитопрепарата.

Метод культуры тканей и клеток лекарственных растений in vitro позволяет получать экологически чистое сырье круглый год, увеличивать выход биологически активных веществ, регулируя их накопление в культуре. Так, в качестве источника алкалоидов успешно культивируются клеточные культуры Atropa belladonna L., Symphytum officinale, Aconitum sp.; алкалоидов и сапонинов - Nigella sp.; витамина Е - Carthamus tinctorius L.; эфирных масел - Lavandula sp., и многие другие растения [3, 4]. Данный метод имеет ряд преимуществ перед использованием интактного растения. Он позволяет получать сырьё независимо от климатических условий, поддерживать рост растений круглый год, что важно для видов, имеющих в цикле своего развития периоды покоя.

На основе изучения биосинтетических процессов можно получить наиболее богатые тканевые клоны биологически действующих веществ, а также заменить интактные растения, природный ареал которых недостаточен для использования в практических целях.

В Томском государственном университете на кафедре физиологии растений и биотехнологии была впервые получена каллусная культура растительных клеток княжика сибирского in vitro в качестве продуцента физиологически активных веществ [5]. Крупномасштабное промышленное оборудование (ферментеры) для культивирования в дальнейшем позволит быстро получать биомассу растительных клеток in vitro.

Получены предварительные данные фитохимического анализа накопления биологически активных веществ каллусной культуры княжика сибирского. Спектрофотометрическим методом определена сумма флавоноидов. Методом тонкослойной хроматографии обнаружены фракции высокополярных тритерпеновых гликозидов (сапонинов), в том числе длительно пассируемых штаммов (32 и 44 субкультивирований) каллусной культуры княжика сибирского. Результаты позволяют говорить о способности клеточной культуры сохранять синтез соединений, характерных для интактных растений.

В настоящее время потребность в препаратах, содержащих микроэлементы, значительно возросла. Микроэлементы в растениях могут стимулировать действие их биологически активных соединений [6]. Известно содержание микроэлементов в дикорастущем княжике сибирском.

княжик сибирский каллусная культура элемент клетка

Нашей задачей явилось исследование элементного состава каллусной культуры клеток in vitro и сравнение с таковым дикорастущего княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.).

Объекты и методики исследования

Объектом исследования явилась каллусная культура клеток княжика сибирского, полученная при использовании в качестве экспланта сегментов черешков молодых листьев интактных растений из республики Хакасия (Ширинский район) [7].

Данная культура на протяжении 44 субкультивирований в темноте выращивалась на питательной среде Мурасиге - Скуга [8] с модифицированным гормональным составом. Ауксин 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота и цитокинин 6-бензиламинопурин в концентрациях 0,6 и 0,3 мг/л соответственно, оказывающие наиболее эффективное действие на пролиферацию каллусной культуры княжика сибирского, добавлялись в питательную среду.

Исследовали качественный и полуколичественный состав микроэлементов в каллусной культуре Atragene speciosa Weinm. В ходе атомно-эмиссионного анализа биологических образцов одним из основных этапов является озоление.

Озоление. Использовали традиционный способ озоления биологических проб, время озоления 2-3 сут [9]. Для приготовления зольного остатка брали навеску 1 г измельченной воздушно-сухой массы растительного сырья (клеток каллусной культуры), помещали ее в предварительно прокаленный до постоянной массы фарфоровый тигель и равномерно распределяли по дну. Навеску сырья в тигле осторожно обугливали над слабым пламенем горелки.

После полного обугливания сырья тигли переносили в муфельную печь для полного прокаливания остатка при температуре 550-650°С, избегая сплавления золы и спекания ее со стенками тигля. Дальнейшее высушивание проводили до постоянной массы при температуре 400-450°С в течение 3 сут до образования серой золы постоянной массы. Для этого массу зольного остатка периодически взвешивали, предварительно охладив в эксикаторе. Определение общей золы в каллусе проводили в соответствии с методикой ГФ XI (1990).

Процентное содержание общей золы (X) в абсолютно сухом сырье вычисляли по формуле

X = (m₁ 100 Ч 100) ч (m₂ (100 - w)),

где m₁ - масса золы, г; m_{2 -} масса навески, г; w - потеря в массе сырья при высушивании, %.

Зольный остаток использовали для обнаружения минеральных элементов.

Эмиссионная спектрометрия. Определение микроэлементов проводилось спектрографически на спектрографе из золы исследуемых образцов методом эмиссионной спектрометрии [9]. Этот метод применяется для исследования элементного (качественного и количественного) состава вещества по спектру излучения его атомов.

Результаты и обсуждение

Количество золы в растительном сырье колеблется в определенных пределах и зависит от специфики самого сырья и условий его сушки. В зольном остатке растений чаще всего содержатся следующие элементы: K, Na, Mg, Ca, Fe, C, Si, P; реже и в меньшем количестве - Cu, Mn, Al и др. Эти элементы обнаруживаются в виде оксидов или солей угольной, фосфорной, серной и других кислот.

Полученный нами зольный остаток клеток каллусной культуры составил 0,15 г от навески 1 г воздушно-сухой массы. Процентное содержание общей золы в абсолютно сухой массе клеток in vitro составило 17,38. Процент общей золы каллусной культуры клеток Atragene speciosa Weinm.16, 20, что в 2 раза превышает аналогичный показатель дикорастущего растения. Методом эмиссионной спектрометрии установлено наличие 18 элементов. Из них макроэлемент - марганец, 6 микроэлементов и 11 ультрамикроэлементов.

Исследования показали, что качественный состав элементов, обнаруженных в каллусе и дикорастущем растении, идентичен, тогда как количественное содержание существенно отличалось. В дикорастущем княжике сибирском обнаружены следующие элементы: Mn; Ni; Cr; Mo; V; Pb; Zn; Ag; Cu; Si; Bi; Co; Na; Mg; Sn; Al; Ca; Fe [6, 10-12].

На основании данных спектрографического анализа составлен ряд предпочтительного накопления элементов клетками каллусной культуры Atragene speciosa Weinm.: Mg>Zn>Fe>Ag>Mn>Cu>Cr>W=Cd>Ta>Ti>Al>V>Mo>Ni>Sn> >Pb>Bi. Отличительным свойством каллусной культуры является ее способность накапливать следующие микроэлементы: серебро, цинк, медь, хром, свинец, марганец, магний, железо, молибден, никель. В клетках in vitro наблюдали содержание Mg и Fe в концентрациях на порядок ниже, чем в надземной биомассе дикорастущих особей в период плодоношения. Высокие концентрации этих элементов в дикорастущем растении, возможно, связаны со способностью накапливать их при переходе в очередную фазу онтогенеза либо являются ответом на геохимическую ситуацию данного района.

Необходимо отметить, что содержание серебра (0,24 мг % на 100 г воздушно-сухой массы клеток каллусной культуры) и цинка (0,51 мг %) значительно превышает таковое дикорастущего Atragene speciosa Weinm. - 0,045 и 0,256 мг % соответственно. Однако дикорастущий княжик сибирский в значительном количестве содержит магний, железо, марганец, никель, молибден, ванадий, свинец, алюминий и висмут. Возможно, наличие высоких концентраций некоторых элементов в клетках каллусной культуры объясняется способностью аккумулировать их в процессе 44 субкультивирований на питательной среде Мурасиге - Скуга с содержанием микроэлементов по прописи, приведенной в табл.1.

Впервые методом эмиссионной спектрометрии определено содержание 8 элементов в клетках каллусной культуры княжика сибирского, из которых макроэлемент - марганец, 6 микроэлементов и 11 ультрамикроэлементов.

Литература