Оценка содержания фитоменадиона в надземной части растений семейства гречишные флоры Сибири

Полная исследовательская публикация ______________ Лукша Е.А., Погодин И.С. и Иванова Е.В.

Размещено на http://www.allbest.ru/

104 _____ http://butlerov.com/ ______ ©--Butlerov Communications. 2015. Vol.41. No.3. P.103-108. (English Preprint)

г. Казань. Республика Татарстан. Россия. __________ ©--Бутлеровские сообщения. 2015. Т.41. №3. ________ 103

Оценка содержания фитоменадиона в надземной части растений семейства гречишные флоры Сибири

Лукша Елена Александровна, Погодин Илья Сергеевич

и Иванова Евгения Викторовна

Кафедра фармацевтической, аналитической и токсикологической химии. Кафедра фармацевтической технологии с курсом биотехнологии. ГБОУ ВПО «Омский государственный медицинский университет» Минздрава РФ. Ул. Ленина, 12. г. Омск, 644099. Омская область. Россия. Тел.: (381-2) 370-360. E-mail: chem68@mail.ru

Аннотация

В статье приведены результаты определения содержания фитоменадиона (витамина К₁) в надземной части некоторых растений семейства гречишные сибирской флоры. Показано, что фито-менадион не обнаруживается в растениях семейства после двух лет хранения сырья. Установлено, что фитоменадион присутствует во всех 15 исследуемых образцах, срок хранения которых составляет менее двух лет. Наибольшее содержание фитоменадиона отмечено для представителей рода Persicaria (горец), Polygonum (спорыш), Rumex (щавель). Полученные результаты позволяют сформулировать рекомендации по хранению и оптимальному использованию растительного сырья на основе пред-ставителей семейства гречишные в качестве источника витамина К₁. Количественная оценка содержания фитоменадиона в растениях семейства гречишные флоры Сибири проведена впервые.

фитоменадион витамин флора сибирский

Введение

Фитоменадион (филлохинон), или витамин К₁, по химическому строению является производным 2-метил-1,4-нафтохинона, содержащего в положении 3 фитильный радикал, имеющий 20 атомов углерода [1]:

Рис. 1. Витамин К₁ (фитоменадион, филлохинон). Химическое название:

2-метил-3-[3,7,11,15-тетраметилгексадек-2-ен-1-ил]нафтохинон.

В природе фитоменадион синтезируется клетками цианобактерий и растений. Его био-логический эффект на организм млекопитающих обычно связывают с влиянием на гемостаз - фитоменадион играет важную роль в поддержании свертывающих свойств крови. В последнее десятилетие было обнаружено, что практически во всех тканях организма человека при-сутствуют витамин-К зависимые белки (Gla-белки), функция которых не связана с про-цессами коагуляции: матриксный Gla-белок (MGP), влияющий на процесс кальцификации сосудистой стенки, белок Gas6, обладающий антиапоптотическими свойствами, периостин, участвующий в процессах ремоделирования тканей после повреждения, кератоэпителин, на-рушающий рост и метастазирование опухолевых клеток, галактоцереброзид сульфотранс-фераза (GST) - белок, принимающий участие в синтезе миелина, витамин К-зависимый сократительный белок хвостика сперматозоида и другие [2]. Таким образом, витамин К₁ в организме человека оказывает влияние на многие физиологические процессы в норме и патологии.

Семейство гречишные - Polygonaceae Juss. - единственный таксон порядка Polygonales Lindl., который относится к надпорядку Polygonanae, подклассу Caryophyllidae, класса Magnoliopsida, отдела Magnoliophyta. Семейство насчитывает около 50 родов и свыше 1000 видов, распространенных почти по всей суше земного шара, преимущественно в северных умеренных областях. Жизненные формы представлены однолетними или многолетними травами, реже кустарниками, деревьями или лианами [3, 4]. На территории Сибири произ-растает 84 вида растений

В отечественной официнальной медицине в качестве лекарственного растительного сырья применяется шесть растений семейства: горец птичий (Polygonum aviculare L), горец перечный (Persicaria hydropiper (L.) Delarbre), горец почечуйный (Polygonum persicaria L.), горец змеиный (Polygonum bistorta L.), горец мясокрасный (Polygonum carneum С. Koch) ревень дланевидный тангутский (Rheum palmatum L. var tanguticum Maxim.). Анализ литературных данных свидетельствует о том, что растения семейства гречишные содержат вещества, обладающие гемостатическим эффектом [5, 6]. Одним из компонентов суммы биологически активных веществ, проявляющим гемостатический (коагуляционный) эффект, является фитоменадион (филлохинон, витамин К₁). Наличие витамина К₁ было установлено в различные периоды времени для некоторых официнальных и неофицинальных видов гречишных без указания сведений о его количественном содержании в данных растениях [6]. Оценка содержания фитоменадиона в гречишных является актуальной не только с научной, но и с практической точки зрения, так как позволит спрогнозировать эффективность анти-коагулянтной терапии при возможном совместном приеме препаратов-антагонистов витамина К (непрямых антикоагулянтов) и комплексов биологически активных соединений на основе указанных растений. Количественная характеристика фитоменадиона в растительном сырье является важной составляющей для оценки сердечно-сосудистого риска при восполнении дефицита витамина К растительными средствами, полученными на основе данного сырья.

Экспериментальная часть

Растительное сырье. Материалом для исследования служила высушенная надземная часть фармакопейных и нефармакопейных видов растений семейства гречишные, имеющих обширный ареал произрастания на территории Сибири: Aconogonon divaricatum (L.) Nakai ex Mori. - таран растопыренный, Bistorta major S. F. Gray - змеевик большой, Вistorta vivipara L. - змеевик живородящий, Persicaria hydropiper (L.) Spach - горец перечный, Persicaria lapathifolia (L.) S.F. Gray - горец развесистый, Persicaria maculata (Rafin.) S. F. Gray - горец пятнистый, или почечуйная трава, Persicaria minor (Huds) Opiz - горец малый, Persicaria scabra (Moench) Mold. -

горец шероховатый, Polygonum aviculare L. - спорыш птичий, Polygonum calcatum Lindm. - спо-рыш вытаптываемый, Rheum compactum L. - ревень густоцветковый, Rumex confertus Willd. - щавель конский, Rumex crispus L. - щавель курчавый, Rumex thyrsiflorus Fingerh. - щавель пирамидальный, Rumex ucranicus Fisch. ex Spreng. - щавель украинский. Образцы были собраны в экологически чистых районах Омской, Новосибирской, Томской, Кемеровской, Иркутской области, Алтайского и Красноярского края в фазу цветения и начала плодоношения в период с 2012 по 2014 годы. Анализ сырья на содержание витамина К₁ проводили в период с сентября 2014 г по февраль 2015 г.

Качественный анализ. Определение фитоменадиона проводили методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) с диодно-матричным детектором на приборе Shimadzu LC-20 Prominence в изократическом режиме по разработанной ранее методике с некоторыми модификациями [7]. Условия хроматографирования: аналитическая колонка, заполненная сорбентом PerfectSil 300 ODS C18, 4.6х250 мм, с размером частиц 5 мкм; состав подвижной фазы: ацетонитрил-изопропанол-вода в соотношении 75:20:5; детектирование при длине волны 254 нм; температура колонки - комнатная; скорость подвижной фазы 1 мл/мин; объем вводимой пробы 20 мкл.

Количественную оценку содержания фитоменадиона проводили по сопоставлению величин «время удерживания» (t_r) и «площадь пика» (S) рабочего стандартного образца (t_r=20.00±2.00 мин.) и гексанового извлечения из объектов исследования. Обработку результатов производили с использованием программного обеспечения LC Solutions. В качестве рабочего стандартного образца (РСО) фитоменадиона использовали препарат Конакион 10 мг/мл (Konakion (Fitimenadione (vitamina K₁) sintetica), производитель - Roche, Франция (серия F3192F02)).

Методика выделения фитоменадиона и проведения анализа: аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0.5 мм. Около 1.0 г (точная навеска) измельченного сырья (аналитический образец) помещали в коническую колбу вмес-тимостью 50 мл, заливали 25 мл гексана, закрывали пробкой и перемешивали на механическом встряхивателе в течение 60 минут. Извлечение фильтровали через бумажный фильтр в грушевидную колбу и отгоняли гексан на ротационном испарителе. Остаток количественно переносили в мерную колбу на 5 мл (пикнометр) с помощью 4 мл 95% этанола. Доводили объем раствора до метки тем же растворителем и перемешивали. 0.02 мл раствора вводили в хроматограф.

Приготовление рабочего стандартного образца: 4 мкл Конакиона (0.00004 г) помещали в мерную колбу на 5 мл (пикнометр). Доводили объем раствора до метки 95% этанолом, перемешивали. 0.02 мл раствора вводили в хроматограф.

Содержание фитоменадиона (X) в абсолютно сухом сырье в мг% вычисляли по формуле:

где S_o - площадь пика на хроматограмме раствора РСО фитоменадиона; S - площадь пика фитоменадиона на хроматограмме испытуемого раствора; m_o- навеска РСО фитоменадиона,

в г; m - навеска сырья, в г; W - потеря в массе при высушивании сырья, в %.

Определение витамина К₁ проводили в трех повторностях, используя одну и ту же аналити-ческую пробу растительного образца.

Статистический анализ. Обработку результатов выполняли с использованием программы STATISTICA 8.0. Для описания полученных результатов для каждого объекта приводили значение минимального (X_min), максимального (X_max) и среднего (X_ср) результата, доверительного интервала среднего (x_ср), ошибки среднего (E) при уровне значимости б=0.05

Результаты и их обсуждение

Предварительно был проведен хроматографический анализ конакиона для оценки целе-сообразности использования его в качестве РСО фитоменадиона (рис. 2). Было установлено, что спектральные и хроматографические характеристики конакиона представлены референт-ным хроматографическим пиком (20.71 мин.) и характеристическими максимумами (л_max) при 247 нм, 262 нм и 271 нм, соответствующими природному фитоменадиону [8, 9].

Рис. 2. Хроматографические и спектральные характеристики РСО фитоменадиона в составе препарата Конакион (пик №6 с t_r = 20,71 мин. и л_max 247 нм, 262 нм, 271 нм соответствует фитоменадиону)

При исследовании растительного материала установлено, что во всех образцах, сбор которых был произведен в 2012 году, фитоменадион отсутствует. Для 15 видов из 6 родов растений семейства гречишные, заготовленных в 2013-2014 г, было установлено присутствие витамина К₁ в надземной части. Количественное содержание фитоменадиона в исследуемых объектах представлено в табл. 1.

Табл. 1. Содержание фитоменадиона (витамина К₁)

в некоторых растениях семейства гречишные флоры Сибири

Содержание фитоменадиона находилось в пределах от 0.0102 (Rheum compactum) до 1.25 мг% (Polygonum aviculare). Наибольшее количество витамина К₁ (свыше 1 мг%) обнаружено в спорыше птичьем, щавеле конском и горце развесистом. Минимальное количество (менее 0.1 мг%) - в змеевике большом, горце пятнистом, горце малом и ревене густо-цветковом. Минимальное среднее значение отличается от максимального в 123 раза.

Возможно, установленное неравномерное присутствие фитоменадиона в исследуемых образцах свидетельствует о неустойчивости соединения при хранении сырья, что было подтверждено при анализе содержания фитоменадиона в растениях по годам сбора (рис. 3). Следовательно, для получения более объективной информации о количестве витамина К₁, и для применения растений семейства гречишные в качестве источника указанного витамина, необходимо использовать свежесобранное сырье в срок, не позже одного года после даты сбора.

Рис. 3. Содержание фитоменадиона в растениях семейства гречишные в зависимости от даты сбора сырья

На основании установленных фактов, актуальным является дальнейшее исследование динамики содержания фитоменадиона при хранении образцов растений семейства гречишные. По сравнению с другими биологически активными веществами растений, фитоменадион отличается нестабильностью, что определяет короткий срок хранения растительного сырья - источника природного витамина К₁. Исследование представляет интерес в сравнительном аспекте с другими растениями, накапливающими фитоменадион в значительных количествах, и традиционно используемых для получения витамин-К содержащих препаратов.

С учетом известной установленной нормы физиологической суточной потребности витамина К для взрослых - 0.120 мг [10], на примере исследованных образцов, были определены эквивалентные количества растительного сырья, содержащего указанную норму (табл. 2).

Табл. 2. Эквивалент суточной нормы витамина К₁ (надземная часть растений семейства гречишные)

* экстрагент - гексан; ** масса воздушно-сухого сырья.

Результаты, представленные в табл. 2, позволяют оценить эффективность антикоагу-лянтной терапии при приеме препаратов-антагонистов витамина К и растений семейства гречишные. Целесообразно провести данную оценку на примере официнальных видов сырья - спорыше птичьем, горце перечном и горце почечуйном. Указанные растения широко применяются в народной и научной медицине, в том числе, в рамках ответственного самолечения. Перечисленные растения являются производящими для лекарственного растительного сырья - травы, реализуемого через аптеки и предназначены для изготовления водных настоев в домашних условиях. Обычно рекомендуется использовать 10 г сырья для приготовления 200 мл настоя, который принимают в течение дня. Анализ данных из таблицы 2 свидетельствует о том, что, потенциально, только трава спорыша птичьего может снизить эффективность непря-мых антикоагулянтов, так как 9.6 г травы спорыша содержит суточную норму витамина К. Но следует учесть тот факт, что данные в таблице представлены для неполярного растворителя - гексана, в который жирорастворимый витамин К₁ перейдет из растительного материала в большем количестве, по сравнению с полярным растворителем водой, следовательно, в водном настое реальное содержание витамина К₁ будет меньше табличного. Таким образом, исследованные в данной работе растения семейства гречишные не будут влиять на активность непрямых антикоагулянтов в случае использования водных настоев из растений в терапевтических дозах. Но данный факт не следует экстраполировать на все растительные объекты семейства без предварительной оценки содержания витамина К₁ и последующего определения эквивалентного количества сырья, содержащего суточную норму, для каждого образца.

Заключение

Проведенные исследования свидетельствуют, о том, что растения семейства Polygona-ceae сибирской флоры являются источниками фитоменадиона. Установлено, что фитоменадион в исследуемых растениях разрушается полностью через два года после заготовки. Целесообразно провести изучение динамики снижения количества фитоменадиона в течение одного года для обоснования сроков использования сырья с максимальным содержанием витамина К₁.

Выводы

1. Методом обращено-фазовой ВЭЖХ проведено качественное обнаружение и количест-венное определение филлохинона в надземной части растений семейства Polygonaceae флоры Сибири.

2. Полученные данные свидетельствуют о том, что содержание витамина К₁ в надземной части растений семейства гречишные зависит от времени сбора и сроков хранения расти-тельного сырья.

3. На основании оценки содержания фитоменадиона в надземной части исследуемых рас-тений семейства гречишные флоры Сибири определены эквивалентные количества расти-тельного сырья, содержащего норму физиологической суточной потребности витамина К для взрослых.

Литература

[1] Абышев А.З. Трусов С.Н., Котова Н.И., Блинова М.П. Синтез, свойства и контроль качества витаминных препаратов и витаминоподобных веществ: учебно-методическое пособие. СПб.: Изд-во СПФХА. 2010. 136с.

[2] Топанова А.А. Якубова И.Ш., Вавилова Т.В., Загородникова К.А., Мурзина А.А., Базилевская Е.М., Клименкова О.А. Витамин К - метаболизм и физическая роль в организме человека. Вопросы детской диетологии. 2012. Т.10. №4. С.21-29.

[3] Тахтаджян А.Л. Система магнолиофитов. Л.: Наука. 1987. 439с.

[4] Цвелев Н.Н. Сем. 56. Гречиховые - Polygonaceae Juss. Сосудистые растения Советского Дальнего Востока. Л.: Наука. 1989. Т.4. С.12-25.

[5] Дикорастущие полезные растения России. Отв. ред. А. Л. Буданцев, Е. Е. Лесиовская. СПб.: Издательство СПХФА. 2001. 663с.

[6] Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т. 1. Семейства Magnoliaceae - Juglandaceae, Ulmaceae, Moraceae, Cannabaceae, Urticaceae. Отв. ред. А.Л. Буданцев. СПб.; М.: Товарищество научных изданий КМК. 2008. 421с.

[7] Лукша Е.А., Погодин И.С., Калинкина Г.И., Коломиец Н.Э., Величко Г.Н. Разработка методики количественного определения филлохинона (витамина К₁) в растительных объектах. Современные проблемы науки и образования. 2014. №3; URL: www.science-education.ru/117-13736 (дата обращения: 30.03.2015).

[8] Europeian Pharmocopoeia. 7^th ed., Vol. 2. France: Council of Europe 2008. 01/2008:1036. Phytomenadione. P.2728-2729.

[9] Цеплина С.Н., Цеплин E.E. , Хвостенко O.Г. Возбужденные электронные состояния и интеркомбинационная конверсия в филлохиноне. Бутлеровские сообщения. 2013. Т.35. №8. С.1-8.

[10] Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации. Методические рекомендации МР 2.3.1.2432-08.

Размещено на Allbest.ru