Новые подходы к стандартизации травы душицы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Новые подходы к стандартизации травы душицы

Целью исследования была разработка быстрого метода количественного определения действующих веществ в траве душицы. Испытания проводились на траве душицы обыкновенной, заготовленной в республиках Татарстан и Башкортостан. В результате проведенных экспериментов были подобраны условия экстракции флавоноидов - одной из основных групп действующих веществ данного сырья, при которых в течение 10 минут извлекалось 94% этих соединений. Расчет истинного содержания их в растительном сырье проводился с использованием коэффициента на неполноту экстракции. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии было показано, что доминирующим флавоноидом этого сырья является цинарозид, удельный показатель которого в комплексе с хлоридом алюминия предлагается использовать для расчетов. Достоверность методики была проверена статистически, ошибка метода не превышает 2.48%.

Душица обыкновенная (Origanum vulgare L., сем. Lamiaceae) одно из популярных лекарственных растений современной медицины, применяющаяся как противовоспалительное и отхаркивающее средство при заболеваниях верхних дыхательных путей. Душица обыкновенная включена в отечественную [1] и Европейскую фармакопеи [2]. Обе фармакопеи оценивают качество травы душицы по содержанию эфирного масла. По Европейской фармакопее трава душицы должна содержать не менее 2.5% эфирного масла, в котором суммарное содержание тимола и карвакрола должно быть не меньше 75%. Отечественная фармакопея нормирует содержание эфирного масла в траве душицы на уровне не менее 0.1% (то есть в 25 раз ниже) и не предусматривает определение в нем тимола и карвакрола. В отличие от европейский стран на территории России массово произрастает один из 4-х хемотипов O.vulgare, отличающийся низким содержанием эфирного масла и отсутствием в нем тимола и карвакрола. Подобное положение побудило отечественных исследователей к поиску для стандартизации травы душицы других групп природных соединений, и выбор здесь пал, прежде всего, на флавоноиды.

Согласно фармакопейной статье предприятия ОАО «Красногорсклексредства» трава душицы, выпускаемая этим производителем должна стандартизоваться помимо эфирного масла и по содержанию суммы флавоноидов [3]. Подобный подход использован и разработчиками проекта фармакопейной статьи на траву душицы для XII издания Российской Фармакопеи [4]. В обоих случаях количественное определение проводят методом дифференциальной спектрофотометрии, после полуторочасовой экстракции флавоноидов из сырья 60% эта-нолом, измеряя оптическую плотность их комплексов с хлоридом алюминия. Расчет суммарного содержания флавоноидов проводится в пересчете на лютеолин.

На наш взгляд возможности усовершенствования методики определения флавоноидов в траве душицы лежат в области оптимизации довольно продолжительной процедуры экстракции флавоноидов (1.5 часа), когда можно отказаться от режима исчерпывающей экстракции определяемых веществ и ввести в расчетную формулу поправочный коэффициент на неполноту экстракции. Кроме этого, использование в качестве референтного соединения при определении суммарного содержания флавоноидов - лютеолина, является, по меньшей мере, спорным, поскольку никакие источники не показывают доминирование этого соединения в общей сумме флавоноидов душицы обыкновенной.

Экспериментальная часть

Объектами исследования являлись высушенные образцы травы душицы обыкновенной (Herba Origani vulgaris), заготовленные в июле 2012-2013 годов в республиках Татарстан и Башкортостан. Запись электронных спектров производили на спектрофотометре LAMBDA 25 (Perkin Elmer, США), определение оптических плотностей полученных растворов проводили на спектрофотометре ПЭ-5300В (НПО «Экрос», Россия) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

ВЭЖХ-анализ проводили на жидкостном хроматографе LC-20 Prominence (Shimadzu, Япония), колонка Supelco С18 (длина 25 см, внутренний диаметр 4.6 мм, зернение сорбента 10 мкм). Режим элюирования - изократический, в качестве подвижной фазы использовали смесь 1% раствора уксусной кислоты и ацетонитрила в соотношении 80:20, скорость потока 1 мл/мин. Детекцию осуществляли при аналитической длине волны бmax = 360 нм.

Результаты и их обсуждение

Поскольку при определении флавоноидов в траве душицы методика фармакопейной статьи предусматривает однократную экстракцию, нами была проверена полнота извлечения флавоноидов при таком режиме экстракции. Для этого выполнялась методики определения флавоноидов по фармакопейной статье и вариант, когда проводилась трехкратная экстракция (40 мл + 30 мл + 30 мл) по 30 минут каждая спиртом той же концентрации. Полученные результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1. Содержание флавоноидов в траве душицы, %

лекарственный растение хроматография

Таким образом, можно констатировать, что однократная экстракция сырья для травы душицы не обеспечивает исчерпывающего извлечения флавоноидов, оставляя в сырье 9% от их общего содержания. При дальнейших расчетах за истинное содержание флавоноидов в сырье душицы принимались результаты, полученные при дробной трехкратной экстракции.

На следующем этапе исследований была изучена динамика выхода флавоноидов из сырья в зависимости от времени экстракции. Попутно проверялась, является ли оптимальной концентрация спирта, используемая в фармакопейной методике. Во всех случаях использовалось соотношение сырья и растворителя 1:100. Зависимость выхода флавоноидов от концентрации спирта и времени экстракции проверялась в экспериментах минимум в 4-х повторностях. Поскольку в фармакопейной методике для экстракции используется 60% этиловый спирт, проверялась эта концентрация и крайние концентрации, которые используются для экстрагирования флавоноидов - 40% и 95%. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2. Динамика извлечения флавоноидов из душицы в зависимости от времени экстракции при разных концентрациях спирта (при соотношении сырье/экстрагент 1:100), %

Полученные результаты свидетельствуют о том, что 60% концентрация этилового спирта является в изученном диапазоне оптимальной. Основная масса флавоноидов при этом извлекается растворителем уже на начальном этапе экстракции.

Для проверки оптимума поглощения продуктов реакции флавоноидов душицы с хлоридом алюминия нами были записаны электронные спектры самого извлечения на фоне растворителя - 95% спирта, продуктов реакции флавоноидов с хлоридом алюминия на фоне 95% спирта и на фоне самого извлечения (дифференциальный спектр). Длинноволновый максимум дифференциального спектра находился на отметке 395 нм, что отличалось от аналитической длины волны (400 нм) при которой проводились измерения в фармакопейной методике. Но поскольку отклонения не превышали диапазона 5 нм, а сам дифференциальной спектр в области максимума поглощения имел плосковыпуклый характер и различия в значениях оптических плотностей в указанном диапазоне не имели существенного характера, было решено в целях унификации методик, измерения проводить при аналитической длине указанной в методике фармакопейной статьи - 400 нм.

Как уже отмечалось, в методике фармакопейной статьи в качестве референтного флавоноида, в пересчете на который производится определение суммы флавоноидов травы душицы выбран лютеолин. Лютеолин является агликоном, в отличие от гликозидных форм флавоноидов, агликоны редко накапливаются в значительных количествах в растениях и еще реже являются доминирующими соединениями в сумме флавоноидов. Из-за значительной разницы в молекулярных весах агликонов и гликозидов флавоноидов у них существенно различаются значения удельных показателей поглощения, которые используются в расчетных формулах, что при соответствующем неверном выборе референтного соединения приведет к большой ошибке в конечных результатах. В работах [5, 6] при определении суммарного содержания флавоноидов в траве душицы предлагается в качестве референтного соединения использовать не лютеолин, а его 7-глюкозид - цинарозид. Однако, предположение о доминировании цинарозида в составе флавоноидов душицы обыкновенной делается только на основе визуальной оценки тонкослойных хроматограмм спиртовых извлечений из этого сырья. Для уточнения природы доминирующего флавоноида травы душицы нами было проведено исследование флавоноидного состава душицы обыкновенной методом ВЭЖХ.

Рисунок 1. Хроматограмма спиртового извлечения из травы душицы

Достоверность идентификации пиков на хроматограммах подтверждали использованием в методике анализа соответствующих внутренних стандартных веществ - рутина, гиперозида, цинарозида и лютеолина.

Из результатов, представленных на рисунке видно, что основным флавоноидом травы душицы является цинарозид.

Из табл. 2 видно, что при экстракции травы душицы 60% спиртом в течение 10 минут извлекается 94% всех содержащихся в ней флавоноидов. Порог в не менее 90% был принят нами в качестве минимального уровня извлечения флавоноидов для возможности перехода к методикам количественного определения без исчерпывающей экстракции определяемых соединений и введением в расчетные формулы поправочного коэффициента, учитывающего неполноту экстракции. Попра-вочный коэффициент рассчитывался как частное при делении значения содержания флавоноидов при исчерпывающей экстракции (1.13) на значение, полученное при 10-минутной экстракции (1.06). Все изложенное позволило предложить нам методику экспрессного определения флавоноидов в траве душицы, приведенную ниже.

Экспресс-метод количественного определения флавоноидов в траве душицы. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 60% спирта, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 минут с момента закипания растворителя. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды и фильтруют через бумажный фильтр в мерный цилиндр вместимостью 100 мл (раствор А).

1 мл Раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 3 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводят объем раствора 95% спиртом до метки; через 40 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 400 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют следующий раствор: 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 каплю разведенной хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора 95% спиртом до метки.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора; 345 - удельный показатель поглощения комплекса цинарозида с алюминия хлоридом при 400 нм; V - объем раствора А в мерном цилиндре; m - масса сырья в граммах; 1.07 - поправочный коэффициент на неполноту экстракции флавоноидов; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Для определения метрологических характеристик разработанной методики провели 10 параллельных определений. Содержание флавоноидов в исследованных образцах сырья составило 1.80 ± 0.10. Ошибка метода не превышает 2.48% (при доверительной вероятности 95%).

Выводы

1. Разработана экспрессная методика количественного определения суммы флавоноидов в траве душицы обыкновенной на основе дифференциальной спектрофотометрии, ошибка определения не превышает 2.48%.

2. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии показано, что доминирующим флавоноидом травы душицы обыкновенной является цинарозид (лютеолин-7-глюкозид), который должен использоваться в качестве референтного соединения при суммарном определении флавоноидов этого сырья.

Литература

1.Трава душицы: [фармакоп. ст.]. Государственная Фармакопея СССР. 11-е изд.: в 2 вып. МЗ СССР. Вып. 2. М.:Лекарственное растительное сырье. 1989. С.328.

2.European Pharmacopoeia. 7th ed. Sup. 7. Strasbourg: European Department for the Quality of Medicines. 2010.

3.ФСП 42-8012-06 «Душицы трава» ОАО «Красногорсклексредства» Введ. 16.10.2006. М. 2006. 23с.

4.Проекты фармакопейных статей для включения в Государственную фармакопею Российской Федерации XII издания. Режим доступа:http://www.rosminzdrav.ru/ministry/61/11/materialy-po-deyatelnosti-deparatamenta/stranitsa-856. (дата обращения: 16.05.2014)

5.Боков Д.О., Морохина С.Л., Пятигорская Н.В., Попов Д.М. Современные подходы к изучению химического состава лекарственного растительного сырья представителей рода Origanum L. и разработка методов его стандартизации. Бутлеровские сообщения. 2013. Т.35. №7. С.94-101.

Размещено на Allbest.ru