Особенности нарушения апоптоза эозинофилов при тяжелой терапевтически-резистентной бронхиальной астме

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Бронхиальная астма (БА) характеризуется широким спектром клинических проявлений от эпизодических и относительно легких симптомов до сложной (терапевтически-резистентной) формы с жизнеугрожающими эпизодами, требующими интенсивной терапии [3, 8, 10]. Доля тяжелой БА в общей структуре заболевания составляет 5-10% [5, 6]. При этом стоимость терапии, включающая медицинскую помощь (в том числе экстренную), длительные периоды нетрудоспособности, достигает 80% от общих затрат на заболевание [5, 6].

Тяжелое течение астмы сопровождается высоким риском смерти, развитием обострений. В последнее десятилетие мировой показатель смертности по причине БА увеличился до 180 тыс. случаев в год (ВОЗ). Особенно важной представляется проблема терапевтической резистентности при тяжелой БА.

Терапевтически-резистентной названа астма, при которой сохраняются симптомы заболевания, варьирующая бронхиальная обструкция, потребность в 2-агонистах короткого действия, возникают обострения, несмотря на использование адекватной базисной терапии (2 000 мкг/сут по беклометазону дипропионату) в течение 6 мес [8]. Вопрос о природе тяжелой терапевтически-резистентной астмы, патофизиологических механизмах персистирующего воспаления при данной форме болезни в настоящее время остается открытым.

Основной эффекторной клеткой хронического воспаления при БА является эозинофил [11, 13]. Избыточное накопление эозинофилов в дыхательных путях при БА связано с нарушением гомеостаза этих клеток. Процесс удаления эозинофилов из тканей осуществляется посредством апоптоза - запрограммированной клеточной гибели [1, 2, 14]. Согласно данным A.M. Vignola и соавт. [16], в биоптатах бронхов больных БА количество апоптотически измененных эозинофилов меньше, чем у больных хроническим бронхитом и здоровых, и прогрессивно уменьшается с нарастанием степени тяжести астмы. Таким образом, можно предположить, что важным механизмом персистирующего воспаления при тяжелой БА является нарушение регуляции апоптоза эозинофилов. В связи с этим актуальным представляется исследование экспрессии одного из ведущих регуляторов апоптоза р53, про- и антиапоптотических эффекторов в эозинофилах пациентов с тяжелой БА, а также экспрессии важнейшего провоспалительного цитокина интерлейкина-5 (ИЛ-5), обладающего выраженным антиапоптотическим действием [4, 7]. Каковы особенности изменений программируемой гибели эозинофилов при резистентной к терапии форме заболевания? Возможен ли регресс дисбаланса в системе апоптоза на фоне базисной терапии в дозах, рекомендуемых современными руководствами?

Цель данного исследования - изучить динамику экспрессии гена транскрипционного фактора p53, а также проапоптотических (bax, bcl-XS) и антиапоптотических (bcl-2, bcl-XL) эффекторов и ИЛ-5 в эозинофилах периферической крови пациентов с терапевтически-чувствительной и терапевтически-резистентной тяжелой БА на фоне базисной терапии.

Материал и методы

Объект исследования

В исследование включено 60 пациентов в возрасте от 18 до 60 лет.

Критериями для включения в исследование были:

- соответствие показателям тяжелой БА: объем форсированного выдоха за 1-ю секунду (ОФВ1) не более 60% от должной величины; объем терапии (дозы по беклометазону дипропионату) более 1 000 мкг/сут, или при сохраняющихся симптомах на фоне проводимой терапии; необходимость постоянного (в течение не менее 6 мес до проведения исследования) применения системных кортикостероидов в любой дозе (с ингаляционными кортикостероидами (ИКС) или без них);

- доказанная обратимость бронхиальной обструкции: повышение ОФВ1 более чем на 200 мл и на 12% относительно исходных значений, а также отсутствие сочетания ОФВ1/ФЖЕЛ (форсированная жизненная емкость легких) менее 70% и ОФВ1 менее 80% от должного показателя после применения бронходилататора (400 мкг сальбутамола при помощи спейсера);

- способность пациентов адекватно оценивать свое состояние;

- отсутствие сопутствующей патологии в стадии декомпенсации;

- подписанное пациентом информированное согласие;

- отсутствие адекватной степени тяжести базисной противовоспалительной терапии (GINA, 2002) в течение 4 нед до включения в исследование.

Дизайн исследования

После периода скрининга (первый визит к вра-чу) всем пациентам было назначено лечение ФП 1 000 мкг/сут. В качестве симптоматической терапии был использован сальбутамола сульфат (вентолин, GSK) в дозе 100 мкг в режиме по требованию. Продолжительность лечебного периода составила 24 нед (рис. 1).

Рис. 1. Дизайн исследования: скрининговый визит - применение критериев включения, мониторинг ПСВ пациента; первый визит - рандомизация пациента, назначение терапии согласно рандомизационной группе, исследование ФВД, БГР, уровня общего IgE в сыворотке крови, определение экспрессии генов р53, bcl-2, bcl-XL, bax, bcl-XS, ИЛ-5; второй визит и третий визит - исследование ФВД, БГР, экспрессии генов р53, bcl-2, bcl-XL, bax, bcl-XS, ИЛ-5

Методы исследования

Оценка пиковой скорости выдоха (ПСВ) в течение всего исследования (скрининг, лечебный период) проводилась с использованием пикфлоуметров «Mini Write» (Великобритания). Исследование функции внешнего дыхания (ФВД) выполнялось на аппарате «MasterScope» фирмы «Jaeger» (Германия) с определением обратимости ОФВ1 по стандартной методике (АТS, 1995) с использованием сальбутамола сульфата (вентолин, GSK) в дозе 400 мкг через спейсер. Для исследования уровня бронхиальной гиперреактивности (БГР) в провокационном тесте с метахолином был использован аппарат «MasterScope» и небулайзер «APS pro» фирмы «Jaeger» (Германия).

Всем пациентам исследуемой группы были проведены кожные аллергопробы (КАП) аллергенами производства ФГУП «Аллерген» (г. Ставрополь), определен уровень общего иммуноглобулина (IgE) в сыворотке крови методом ИФА.

Для оценки про- и антиапоптотических факторов эозинофилы выделяли из гепаринизированной периферической крови. Тотальную РНК выделяли с помощью набора «Trizol™» (GibcoBRL, Life Technologies). Поли-A-РНК получали на колонках с олиго-dT целлюлозой (ICN, США) и проводили обратную транскрипцию набором «Реверта» («ПЦР-сервис», г. Москва) в течение 1 ч при температуре 37 C; кДНК амплифицировали с праймерами, синтезированными на ДНК-синтезаторе ASM 800 специфичными для:

bcl-2 (5'-GATGTCCAGCCAGCTGCACCTG;

3'-CACAAAGGCATCCCAGCCTCC),

bcl-xL/S (5'-TTGGACAATGGACTGGTTGA;

3'-GTAGAGTGGATGGTCAGTG),

bax (5'-GGACCCGGTGCCTCAGGA;

3'-CAAAGATGGTCACGGTCTGC),

ИЛ-5 (5'-ATGCGCCTTTGCACTAATGGC;

3'-GCAAATTGCACGATCTGAC),

р53 (5'-CGACACTGCGTGAATGAA;

3'-GCTGTGACGCACTTACTT),

ГАФДГ (5'-GAAGCTCACTGGCATGGCCTTCC;

3'-CATGTGGGCCATGAGGTCCA).

Участок гена глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназы (ГАФДГ) использовали как положительный контроль экспрессии мРНК. Показатели экспрессии выражали в процентах относительно активности ГАФДГ, которая принималась за 100%. Детекцию продуктов амплификации проводили в 1,2%-м агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Для оценки специфичности продуктов амплификации использовали метод nested-ПЦР.

В качестве контрольных были использованы данные, полученные от 30 здоровых добровольцев (возраст от 18 до 60 лет). В эту группу были включены лица, не имеющие БА и других атопических заболеваний, гельминтных инвазий. Все пациенты из группы контроля имели отрицательные результаты кожных аллергопроб, уровень IgЕ в сыворотке крови менее 100 МЕ/мл, нормальные показатели ФВД и отрицательные результаты теста с метахолином.

Cтатистическая обработка проводилась при помощи пакета программ Statistica for Windows 6.0. Данные представлены в виде X m, где Х - среднее арифметическое, m - ошибка среднего. Для оценки различия средних в попарно несвязанных выборках применяли U-критерий Манна-Уитни, в связанных - критерий Вилкоксона. Для сравнения показателей в трех несвязанных группах проводили дисперсионный анализ ANOVA Краскалла-Уоллиса, в трех связанных - анализ Фридмана. Степень взаимосвязи между признаками оценивали, вычисляя коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Разницу считали значимой при р < 0,05.

Результаты

По окончании 24-недельного лечебного периода участники исследования, у которых не удалось достичь хорошего и полного контроля астмы согласно критериям GOAL [9], были отнесены в группу сложной (терапевтически-резистентной) БА в соответствии с определением рабочей группы ERS (European Respiratory Society, 1999) [8]. Пациенты, у которых контроль астмы был достигнут, сформировали группу терапевтически-чувствительной тяжелой БА.

В табл. 1 представлена сравнительная клинико-функциональная характеристика вышеуказанных групп тяжелой БА. Исходно показатели обеих групп были сопоставимы. Однако уже по окончании 4-недельного периода лечения обращают на себя внимание достоверно более низкие показатели ФВД (ОФВ1, ПСВ), более выраженная бронхиальная гиперреактивность, более интенсивные симптомы заболевания при терапевтически-резистентной БА в сравнении с терапевтически-чувствительной.

Анализ экспрессии гена ИЛ-5 выявил отсутствие какой-либо динамики этого показателя в группе терапевтически-резистентной БА. Экспрессия изучаемого интерлейкина оставалась стабильно высокой вне зависимости от продолжительности терапии и достоверно отличалась от контрольных значений (визиты второй и третий).

Таблица 1. Сравнительная клинико-функциональная характеристика тяжелой БА в обследованных группах в зависимости от чувствительности к проводимой терапии

Примечание. n - количество обследованных; * - p < 0,01 по сравнению с показателем группы терапевтически-чувствительной БА на том же визите; # - p < 0,01 по сравнению с показателем на первом визите; - p < 0,01 на втором визите.

Напротив, у пациентов с терапевтически-чувствительной тяжелой БА назначение адекватной базисной терапии сопровождалось достоверным по сравнению с исходным значением снижением активности экспрессии ИЛ-5 уже через 4 нед лечения (рис. 2).

Пациенты с чувствительной и резистентной к терапии тяжелой астмой отличались также и по профилю экспрессии про- и антиапоптотических эффекторов в эозинофилах периферической крови. Исходно в обеих группах уровни экспрессии антиапоптотических факторов bcl-2 и bcl-XL были повышены, однако на фоне проводимого лечения отмечено статистически значимое снижение данных показателей к концу 4-й нед терапии (визит второй) при терапевтически-чувствительной форме болезни и только через 24 нед - при терапевтически-резистентной БА (табл. 2).

Рис. 2. Экспрессия гена ИЛ-5 в эозинофилах периферической крови при различном течении тяжелой БА, ПЦР: 1 - p = 0,002 по сравнению с терапевтически-резистентной БА на том же визите; 2 - p < 0,001 по сравнению с терапевтически-резистентной БА на том же визите; 3 - p = 0,02 по сравнению с показателем на первом визите; 4 - p = 0,001 по сравнению с показателем на первом визите; 5 - p < 0,05 по сравнению с показателем группы контроля

клинический бронхиальный астма эозинофил

Таблица 2. Экспрессия генов про- и антиапоптотических факторов в эозинофилах периферической крови

Примечание. n - количество обследованных. * - p = 0,001 по сравнению с группой терапевтически-резистентной БА на том же визите; - p = 0,024 по сравнению с показателем на первом визите; - p = 0,038 на втором визите; - p = 0,018 на первом визите; -p = 0,001 на первом визите; - p = 0,029 на втором визите; - p < 0,001 на первом визите; # - p = 0,049 на первом визите; - p = 0,015 по сравнению с группой терапевтически-резистентной БА на том же визите; - p = 0,001 по сравнению с показателем на первом визите; - p = 0,003 по сравнению с группой терапевтически-резистентной БА на том же визите; - p = 0,018 с группой неконтролируемой БА на том же визите.

На протяжении всего периода исследования группа терапевтически-резистентной БА характеризовалась отсутствием достоверных изменений активности экспрессии проапоптотических факторов bax и bcl-XS, тогда как при терапевтически-чувствительной форме болезни статистически значимое увеличение этих показателей по сравнению с исходными значениями происходило уже через 4 нед терапии (см. табл. 2).

Анализ экспрессии гена транскрипционного ядерного фактора р53 у пациентов с тяжелой БА в зависимости от чувствительности к проводимой терапии выявил достоверное увеличение этого показателя к моменту окончания 24-недельного лечебного периода в группе терапевтически-чувствительной БА. У пациентов с терапевтически-резистентной астмой было установлено парадоксальное снижение уровня экспрессии данного фактора к третьему визиту, достоверно отличавшегося от показателя группы сравнения (рис. 3).

Рис. 3. Экспрессия гена p53 в эозинофилах периферической крови при различном течении тяжелой БА, ПЦР: 1 - p = 0,002 по сравнению с группой терапевтически-резистентной БА на том же визите; 2 - p = 0,031 по сравнению с показателем на первом визите; 3 - p = 0,046 по сравнению с показателем на втором визите; 4 - p < 0,05 по сравнению с показателем группы контроля

На всех этапах исследования экспрессия р53 была достоверно ниже показателя группы контроля.

Обсуждение.

Результаты настоящего исследования свидетельствуют, что персистирующий характер воспаления воздухоносных путей при тяжелой терапевтически-резистентной БА отчасти является следствием нарушения регуляции гомеостаза основных эффекторных клеток - эозинофилов. Увеличение продолжительности жизни последних обусловлено нарушением механизмов реализации апоптоза, важнейшим регулятором которой служит транскрипционный ядерный фактор р53 [1, 2, 14]. У пациентов с терапевтически-резистентным течением заболевания на фоне проводимой адекватной (GINA, 2002) базисной терапии в течение 24 нед установлено парадоксальное снижение экспрессии гена р53 в эозинофилах периферической крови. При сохраненной чувствительности к терапии имеет место достоверное, по сравнению с исходным, увеличение данного показателя в те же сроки. Гипотетическая схема, объясняющая вариабельность экспрессии фактора р53, представлена на рис. 4. Согласно опубликованным данным, существуют три возможных пути регуляции экспрессии p53 в эозинофилах пациентов с тяжелой БА, не получающих противовоспалительную терапию. Во-первых, характерная для тяжелой БА гиперэкспрессия ядерного транскрипционного провоспалительного фактора NFB может приводить к некоторому повышению экспрессии гена р53 [14, 17]. Во-вторых, 2-агонисты, использующиеся для симптоматической терапии астмы, способны увеличивать экспрессию р53, скорее всего, опосредованно, через активацию митоген-активированной протеинкиназы и цАМФ-зависимой протеинкиназы А [12]. Однако действию вышеперечисленных стимулирующих экспрессию р53 факторов при тяжелой БА, вероятно, противостоят цистеиновые лейкотриены (cys-ЛТ), активно продуцируемые клетками воспаления [15]. Таким образом, низкий уровень экспрессии гена р53 и связанное с этим угнетение процессов апоптоза эозинофилов при тяжелой БА в отсутствие базисной терапии могут быть следствием суммарного действия всех вышеприведенных факторов с преобладанием подавляющего экспрессию р53 эффекта cys-ЛТ.

Рис. 4. Механизмы регуляции экспрессии р53 при тяжелой БА без базисной терапии

При терапевтически-резистентной БА, в большинстве случаев обусловленной формированием вторичной, т.е. приобретенной, кортикостероидной резистентности, парадоксальное снижение уровня р53 может быть результатом событий, представленных на рис. 5. Можно предположить, что у пациентов с терапевтически-резистентной астмой на фоне лечения кортикостероидами происходит конкурентное связывание глюкокортикостероидов (ГКС) с неактивным кортикостероидным рецептором (КСР-) и NFkB. При этом ГКС подавляют гиперэкспрессию NFkB, но не способны самостоятельно стимулировать внутриклеточную экспрессию р53. Таким образом, на первый план выходит негативное влияние cys-ЛТ, чем и объясняется более выраженное снижение экспрессии р53 при терапевтически-резистентной БА.

В настоящей работе показано, что следствием парадоксального снижения экспрессии гена p53 в эозинофилах периферической крови на фоне проводимой базисной терапии при терапевтически-резистентной астме являются соответствующие изменения механизмов регуляции апоптотического каскада. Так, при наличии терапевтической резистентности вне зависимости от продолжительности лечения не происходило увеличения экспрессии проапоптотических факторов. В то же время уменьшение активности экспрессии антиапоптотических эффекторов было статистически значимым только к концу 24-недельного курса терапии (см. табл. 2). Вышеуказанные изменения экспрессии ведущих регуляторов апоптоза эозинофилов при терапевтически-резистентной БА были сопряжены с выраженной клинической симптоматикой заболевания: частые симптомы, большая потребность в бронхолитиках, частые курсы СКС, низкие показатели ФВД, высокая гиперреактивность дыхательных путей (см. табл. 1).

Следует отметить стабильно высокую экспрессию ИЛ-5 на протяжении всего лечебного периода, выявленную у пациентов с терапевтически-резистентной БА. Вероятно, данный феномен играет ключевую роль в реализации дистантного антиапоптотического действия на эозинофилы периферической крови из очага воспаления в бронхах.

Таким образом, резистентное к терапии течение тяжелой БА ассоциировано с изменениями механизмов регуляции апоптоза эозинофилов. Результаты настоящей работы свидетельствуют, что ведущим механизмом этих изменений является угнетение экспрессии ядерного проапоптотического фактора р53 и высокая транскрипционная активность гена ИЛ-5. Полученные данные позволяют предположить, что в основе парадоксально низкой чувствительности экспрессии гена р53 к воздействию кортикостероидов при терапевтически-резистентной астме лежит вторичная кортикостероидная резистентность. Этот феномен, являющийся следствием длительно текущего цитокинопосредованного воспаления, достаточно широко распространен и составляет до 64% в структуре тяжелой бронхиальной астмы (данные национального исследования бронхиальной астмы тяжелого течения - НАБАТ-2002).

Рис. 5. Механизмы регуляции экспрессии р53 при тяжелой терапевтически-резистентной БА на фоне лечения

Терапевтическая резистентность - это не только низкая чувствительность к проводимой терапии, но также значительно худшее клиническое течение с большой частотой обострений и обращений за неотложной помощью, она представляет собой большую клиническую проблему. Совокупность данных, включая полученные в настоящем исследовании, о механизмах, лежащих в основе измененной экспрессии р53, дает еще один повод для рекомендаций максимально агрессивной терапии тяжелой астмы, которая потенциально способна предотвратить развитие терапевтической резистентности или вернуть утраченную чувствительность к кортикостероидам.

Литература

1. Белушкина Н.Н., Али Х.Х., Северин С.Е. Молекулярные основы апоптоза // Вопр. биол. мед. и фарм. химии. 1998. № 4. С. 15-23.

2. Невзорова В.А., Суворенко Т.Н., Коновалова Е.Н. Апоптоз и воспаление при бронхиальной астме // Терапевт. архив. 2001. № 12. С. 92-96.

3. Чучалин А.Г. Бронхиальная астма. М.: Русский врач. 2001. 144 с.

4. Adachi T., Motojima S., Hirata A. et al. Eosinophil apoptosis caused by theophylline, glucocorticoids, and macrolides after stimulation with IL-5 // J. Allergy Clin. Immunol. 1996. V. 98. P. 207-215.

5. Asthma in America, 1998. Asthma in America survey: Executive summary. http://www.asthmainamerica. com/ execsum_over.htm

6. Asthma insights and reality in Europe: Executive summary. http://www.asthma.ac.psiweb.com/executive/mn_exec_summary_index.html

7. Busse W.W. Mechanisms of persistent airway inflammation in asthma // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 1998. Vol. 152. P. 388-393.

8. Chung K.F., Godard P., Adelroth E. Difficult/therapy-resistant asthma // Eur. Respir. J. 1999. V. 13. P. 1198-1208.

9. Gaining Optimal Asthma Control (GOAL) web site [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.asthma GOAL.com

10. Global Initiative for asthma. Global Strategy for Asthma Management and Prevention [Электронный ресурс]. 2002. Режим доступа: http://www.ginasthma.com

11. Hegele R.G., Hogg J.C. The pathology of asthma: an inflammatory disorder // Severe asthma: Pathogenesis and Clinical management / Ed. by S.J. Szefler, D.Y.M. Leung. N. Y.: Marcel Dekker, 1996. P. 61-76.

12. Luo Y., Lai W., Xu J. Role of salbutamol in inducing apoptosis of cultured human airway smooth muscle cells // Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2001. V. 24. № 4. P. 219-224.

13. Rothenberg M.E. Eosinophilia // Engl. J. Med. 1998. V. 338. P. 1592-1599.

14. Simon H.-U., Alam R. Regulation of eosinophil apoptosis: transduction of survival and death signals // Intern. Arch. of Allergy and Immunol. V. 118. P. 7-14.

15. Spinozzi F., Russano A.M., Piattoni S. et al. Biological effects of montelukast, a cysteinyl-leukotriene receptor-agonist, on T lymphocytes // Clin. Exp. Allergy. 2004. V. 34. № 12. P. 1876-1882.

16. Vignola A.M., Chanez P., Chiappara G. Evaluation of apoptosis of eosinophils, macrophages and T lymphocytes in mucosal biopsy specimens of patients with asthma and chronic bronchitis // J. Allergy Clin. Immunol. 1999. V. 103. P. 563-573.

17. Vignola A.M., Chiaparra G., Siena L. et al. Proliferation and activation of bronchial epithelial cells in corticosteroid-dependent asthma // J. Allergy Clin. Immunol. 2001. V. 108. № 5. P. 738-746.