Особенности полиморфизма генов вирулентности Helicobacter pylori и генов ИЛ-1 при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori

Размещено на http://www.allbest.ru/

Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН

Особенности полиморфизма генов вирулентности Helicobacter pylori и генов ИЛ-1 при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori

Чернова О.А.

Насыбуллина Э.Р.

Для штаммов Helicobacter pylori (H.p.) характерна выраженная генетическая гетерогенность, которая может обусловливать разные клинические последствия персистенции этих бактерий. Подавляющее большинство инфицированных H.p. не имеют клинических проявлений инфекции. Однако у некоторых индивидуумов колонизация слизистой оболочки желудка H.p. может быть причиной возникновения хронического гастрита, язвенной болезни, а также аденокарциномы желудка и первичной В-клеточной лимфомы [12].

Патогенность H.p. связывают с продуктами генов ureI, iceA, cagA, babA2, vacA [16]. При этом не исключено, что на проявление вирулентности H.p. могут влиять сочетанные инфекции (H.p. + Ureaplasma urealyticum) [1]. В литературе имеются данные, свидетельствующие, что распределение генотипов H.p. и связанных с ними заболеваний в разных регионах мира различаются и, таким образом, могут иметь этногеографические особенности [6].

Известно, что патогенез при инфекционных заболеваниях человека зависит от особенностей биологии не только инфекционного агента, но и носителя, являясь производной взаимодействия их сигнальных сетей, в том числе генетически детерминированных, - молекул ГКГС I и II класса, ферментов про- и антиоксидантной защиты, наконец, про- и антивоспалительных цитокинов [3].

За последнее десятилетие было установлено, что генетическая предрасположенность к инфекционным и воспалительным заболеваниям может в значительной степени определяться специфичным набором полиморфных вариантов генов интерлейкинов [4, 10]. Генетический полиморфизм достигается за счет единичных нуклеотидных замен и (или) изменения числа копий повторяющихся последовательностей, обеспечивая экспрессию у разных индивидуумов различных версий продуктов соответствующих генов. Установлено, что аллельное разнообразие генов ИЛ-1 может определять вариабельность восприимчивости и чувствительности к H.p. у представителей разных этнопопуляционных групп населения [8].

Выяснение особенностей полиморфизма генов вирулентности у клинических изолятов H.p., а также генов цитокинов семейства ИЛ-1 (IL-1B, IL-1RN) у носителей хеликобактерий при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки явилось целью данного исследования.

Материал и методы

Группу обследования составил 21 больной с язвенной болезнью желудка (ЯБЖ) и язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБД) в возрасте от 20 до 78 лет. Все обследуемые больные являлись жителями г. Казани. Забор и анализ биоптата слизистой оболочки желудка производились согласно методике, описанной в работе K. Momynaliev с соавт. (2003) [11]. Для экстракции и очистки ДНК использовали набор реагентов «Хеликопол» НПФ «Литех» (г. Москва). Выявление H.p. и Ureaplasma urealyticum (U. urealyti¬cum) проводили с помощью ПЦР с использованием специфичных праймеров на нуклеотидную последовательность этих микроорганизмов. Для генотипирования штаммов H.p. в отношении cagA, vacA, iceA и babA2 использовали набор реагентов НПФ «Литех» (г. Москва). Результаты документировали с помощью видеосистемы для регистрации гелей «DNA Analyzer».

Анализ полиморфных локусов генов IL-1Ra и IL-1b (в положении -511 и +3954) проводили с помощью ПЦР на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Варианты С-511Т, С+3954Т гена IL-1B и VNTR гена IL-1RN (аллели 1 и 2) выявляли по M.A. Garcia-Gonzales с соавт. [8]. Полученные амплифицированные фрагменты обрабатывали рестриктазами AvaI (C511T) и TaqI (C+3954T) («Fermentas», Литва). Длина рестрикционных фрагментов для TaqI (C+3954T) составляла 135 и 114 н.п. при наличии сайта рестрикции (аллель С); 249 н.п. - при отсутствии (аллель Т), а для варианта С-511Т (AvaI) - 190 и 115 н.п. при наличии сайта (аллель С); 305 н.п. - при отсутствии (аллель Т).

Длина IL-1RN*1 (аллель 1 IL-1Ra) соответствует 410 н.п., а IL-1RN*2 (аллель 2 IL-1Ra) - 240 н.п.

Для электронно-микроскопического исследования часть биоптата фиксировали в 2,5%-м растворе глутар¬альдегида, рН 7,2, и 1%-м растворе четырехокиси осмия, приготовленных на фосфатном буфере, обезвоживали и заключали в эпон 812. Ультратонкие срезы, изготовленные на ультрамикротоме LKB III, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, анализировали с помощью трансмиссивного микроскопа «Hitachi» HU-125 («Hitachi», Япония).

Результаты и обсуждение

В результате тестирования 21 больного на наличие H.p. у всех обследованных пациентов в биоптатах были обнаружены H.p. При этом у 4 (19%) больных в биоптатах были также выявлены микоплазмы - U. urealyticum. В результате генотипирования в двух пробах у пациентов с ЯБД выявлено наличие сразу двух аллелей гена vacA: s1 и s2, что объяснялось присутствием в образцах двух разных штаммов H.p. Данные образцы из дальнейшего анализа были исключены из-за возможных затруднений интерпретации результатов исследований.

Универсальным фактором патогенности H.p. является уреаза [7]. Предполагается, что дополнительный вклад в патогенность H.p. и, соответственно, в клиническую картину инфекции могут вносить продукты других генов этого микроорганизма, в том числе cagA, vacA (s1, s2, m1, m2), iceA (A1, A2), а также babA (A1, A2) [14, 16].

В результате тестирования 19 образцов биоптатов H.p. с cagA+ были обнаружены у 14 (73,7%) пациентов, инфицированных H.p., что несколько ниже значений, полученных в ряде исследований в Европе и Центральной России. Подобный результат может быть следствием высокочастотной изменчивости структуры гена, а также вариабельности генетически детерминированной восприимчивости организма-хозяина к разным штаммам H.p. [15]. Установлено, что наличие одновременно островков патогенности cag и vac у штаммов H.p. препятствует фагоцитированию H.p. и таким образом способствует их персистенции [5].

В 100% случаев cagA+ штаммы H.p. содержали vacA s1. В разных этнопопуляциях распределение аллелей vacA существенно различается. Однако повсе¬мест¬но инфицирование H.p. vacA s1/m1 связано с более выраженным воспалением и активностью. Штаммы H.p. vacA s1/m1 и vacA s1/m2 имеют максимальный или средний уровень секреции цитотоксина, тогда как vacA s2/m2 - незначительный [12]. Действительно, в 94,7% случаев обследованных пациентов с язвенной болезнью были выявлены генотипы vacA s1/m2 независимо от локализации язвенного процесса.

Полагают, что маркером ЯБД, а также аденокарциномы желудка может быть ген babA2 [9]. Пациенты, у которых были выявлены предраковые изменения слизистой желудка, не вошли в обследованную группу, тогда как у 8 (42%) клинических изолятов H.p., инфицирующих больных ЯБД, был обнаружен ген babA2.

Известно, что инфильтрация слизистой желудка полиморфноядерными лейкоцитами более выражена у больных, инфицированных H.p. с iceA1, чем в случае микроорганизмов с другими генотипами, в том числе iceA2. Однако достоверную связь между наличием у H.p. гена iceA1 с развитием язвенной болезни продемонстрировать пока не удалось [14]. В данном исследовании генотипы iceA1 были выявлены в 73,7% случаев, тогда как iceA2 не был обнаружен ни в одном образце.

Неоднозначность каждого из вышеуказанных факторов патогенности H.p. в клинической картине гастродуоденальной патологии определила появление гипотезы об определяющем для патогенеза значении их комбинации [11, 13]. Согласно возможным комбинациям вариантов генов патогенности, у штаммов H.p. может быть 28 генотипов. В наших исследованиях было обнаружено 6 генотипов (таблица). Как следует из данных, представленных в таблице, у обследованных больных наиболее часто выявлялись штаммы H.p. с генотипами vacA s1/m2 iceA1 cagA+, а также vacA s1/m2 iceA1 cagA+babA2.

Особенности генотипов Helicobacter pylori у больных ЯБЖ и ЯБД с различными генотипами ИЛ-1

Однако связь между разновидностью комбинации генов вирулентности H.p. и локализацией язвенных дефектов, а также степенью тяжести патологического процесса в исследованиях не обнаружена [2].

Внедрение микроорганизмов и (или) повреждение тканей обусловливают активацию экспрессии IL-1, - индуцибельного белка воспалительного процесса. Семейство IL-1 включает два антагониста (IL-1a и IL-1b) и их специфический антагонист IL-1Ra. Обнаружено, что гомозиготы IL-1RN*2/2 подвержены различным инфекционным и воспалительным заболеваниям. Восприимчивость же к определенным заболеваниям может быть связана с носительством тех или иных комбинаций аллелей полиморфных генов IL-1b и IL-1Ra [4, 10].

Результаты анализа данных распределения генотипов полиморфных генов ИЛ-1 (IL-1B-511, IL-1B+3954, IL-1RN) у пациентов с ЯБЖ и ЯБД (см. таблицу) свидетельствуют, что у инфицированных H.p. больных при ЯБЖ и ЯБД наиболее часто встречается комбинация аллелей IL-1B-511*T/IL-1B+3954*C/IL-1RN*2. Не исключено, что у носителей иных комбинаций аллелей ИЛ-1 при инфицировании разными штаммами H.p. развитию язвенной болезни могут способствовать другие факторы, в том числе сочетанные инфекции [1], - например, U. urealyticum + H.p. (см. таблицу, рис. 1). ген вирулентность язвенный микоплазма

По результатам исследований M.A. Garcia-Conzales с соавт. [8], комбинации аллелей IL-1B-31*T/IL-1B-511*С/IL-1B+3954*C/IL-1RN*2 у европеоидов определяют риск развития язвы двенадцатиперстной кишки. Расхождение данных этих авторов и полученных в представленной работе в отношении IL-1B-511 может быть связано с особенностями выборок и (или) этногеографическими аспектами.

Рис. 1. Особенности эпителиоцитов слизистой оболочки желудка больного ЯБЖ при инфицировании H.p. и микоплазмами: а - H.p. в клетке эпителия; б - фрагмент пикнотичного ядра (Я) эпителиоцита слизистой оболочки желудка при язвенной болезни, ассоциированной с H.p.;

в, г - контакт микоплазм (Мп) с митохондриями (Мх) в клетках эпителия слизистой оболочки желудка при сочетанной (H.p. + U. urealyticum) инфекции. H.p. локализована рядом с ядром, что может свидетельствовать о проникновении микроорганизма в эпителиальную клетку. Пикнотичное ядро является неблагоприятным исходом конденсации хроматина. Микоплазмы (U. urealyticum) локализуются внутри эпителиоцитов, взаимодействуют с органеллами клетки и вызывают изменение их ультраструктуры.

Попытки выявить корреляцию особенности течения заболевания и наличия соответствующих генотипов H.p. у больных ЯБЖ и ЯБД (см. таблицу) оказались безуспешными. Это может свидетельствовать о наличии дополнительных факторов, определяющих проявление вирулентности штаммов H.p., связанных с особенностями как микробиоценозов в очагах патологии, так и полиморфизмом разнообразных генов, детерминирующих специфические и неспецифические сигнальные сети системы паразит - хозяин, которые еще предстоит выявить.

Выводы

1. В биоптатах слизистой оболочки желудка больных ЯБЖ и ЯБД превалируют клинические изоляты H.p. с генотипами vacA s1/m2 iceA1 cagA+ и vacA s1/m2 iceA1 cagA+ babA2.

2. Больные ЯБЖ и ЯБД, инфицированные различными штаммами H.p., наиболее часто являются носителями комбинации аллелей IL-1B-511*T/IL-1B+3954*C/IL-1RN*2.

3. Корреляция между соответствующими генотипами у клинических изолятов H.p. и особенностью язвенной патологии не обнаружена.

4. В 19% биоптатов больных ЯБЖ и ЯБД (в том числе не являющихся носителями комбинации аллелей IL-1B-511*T/IL-1B+3954*C/IL-1RN*2) обнаружены микоплазмы U. urealyticum.

5. В биоптатах больных ЯБЖ и ЯБД при сочетанной инфекции (H.p. + U. urealyticum) выявлены изменения ультраструктуры инфицированных эпителиоцитов, связанные с непосредственным воздействием микоплазм на органеллы клеток.

Литература

1. Абдулхаков Р.А., Чернова О.А., Насыбуллина Э.Р., Чернов В.М. Инфекция Helicobacter pylori: синергенты, генотипы, полиморфизм и иммунореактивность // Педиатрия. 2002. № 2. С. 19-21.

2. Насыбуллина Э.Р., Абдулхаков Р.А., Чернова О.А. и др. Распределение генотипов Helicobacter pylori среди паци-ентов с гастродуоденальной патологией // Эксперим. и клинич. гастроэнтерология. 2004. № 1. С. 126-132.

3. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000. 582 с.

4. Фрейдин М.Б., Пузырев В.П., Огородова Л.М. и др. Полиморфизм генов интерлейкинов и их рецепторов: популяционная распространенность и связь с атопической бронхиальной астмой // Генетика. 2002. Т. 38. № 12. С. 1-9.

5. Шкитин В.А., Шпирна А.И., Старовойтов Г.Н. Роль Helicobacter pylori в патологии человека // Клинич. микробиология и антимикроб. терапия. 2002. Т. 4. № 2. С. 128-145.

6. Anderson H. et al. Association of cagA and vacA genotypes of Helicobacter pylori with gastric diseases in Estonia // J. Clin. Microbiol. 2002. V. 40. № 1. P. 298-300.

7. Fan X., Gunasena H., Cheng Z. et al. Helicobacter pylori urease binds to class II MHC on gastric epithelial cells and induces their apoptosis // J. Immunol. 2000. № 165. P. 1918-1924.

8. Garcia-Gonzalez M.A., Lanas A., Savelkoul P.H.M. et al. Association of interleukin 1 gene family polymorphisms with duodenal ulcer disease // Clin. Exp. Immunol. 2003. № 134. P. 525-531.

9. Gerhard M., Lehn N., Neumayer N., Boren T. et al. Clinical relevance of the Helicobacter pylori gene for blood-group antigen binding adhesin // Gastroenterol. 1998. V. 115. № 1. P. 58-66.

10. Machado J.C., Figueiredo C., Canedo P. et al. A proinflammatory genetic profile increases the risk for chronic atrophic gastritis and gastric carcinoma // Gastroenterol. 2003. V. 125. P. 364-371.

11. Momynaliev K., Smirnova O., Kudryavtseva L., Govorun V. Helicobacter pylori genotypes in Russia // Eur. J. Clin. Microbiol. Infec. Dis. 2003. V. 22. № 9. P.

12. Van Doorn L.-J., Figueiredo C., Sanna R., Pena S. Expanding allelic diversity of Helicobacter pylori vacA // J. Clin. Microbiol. 1998. № 36. P. 2597-2603.

13. Yamaoka Y., Graham D.Y. Disease-specific H.pylori virulence factors: the role of cagA, vacA, iceA, babA2 alone or in combination // Helicobacter. 2000. P. 37-42.

14. Yamaoka Y., Kodama T., Gutierrez O. et al. Relationship between Helicobacter pylori iceA, cagA and vacA status and clinical outcome: studies in four different countries // J. Clin. Microbiol. 1999. № 37. P. 2274-2279.

15. Yamaoka Y., Kodama T., Kashima K. et al. Variants of the 3'region of the cagA gene in Helicobacter pylori isolates from patients with different H.pylori-associated diseases // J. Clin. Microbiol. 1998. № 36. P. 2258-2263.

16. Zhongming Ge, Taylor E.D. Contribution of genome sequencing to understanding the biology of Helicobacter pylori // Annu. Rev. Microbiol. 1999. № 53. P. 353-387.

Аннотация

Исследовали особенности распределения генов вирулентности (iceA, cagA, babA2, vacA) и генов ИЛ-1 в клинических изолятах Helicobacter pylori (H.p.), полученных от пациентов с эндоскопически подтвержденными диагнозами язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (ЯБД) и язвенной болезни желудка (ЯБЖ). Обнаружено, что в биоптатах превалируют штаммы H.p. с генотипом vacA s1/m2 iceA1 cagA+ и vacA s1/m2 iceA1 cagA+ babA2. При этом у больных ЯБЖ и ЯБД наиболее часто встречается комбинация аллелей IL_1B_511*Т/IL_1B +3954*C/IL-1RN*2. У 4 пациентов в биоптатах обнаружены микоплазмы (Ureaplasma urealyticum). Связь между разновидностью комбинации генов вирулентности H.p., генов ИЛ-1 и особенностью течения язвенной болезни не установлена.

Ключевые слова: факторы вирулентности Helicobacter pylori, цитокины семейства ИЛ-1, генотипирование, язвенная болезнь, персистенция, Ureaplasma urealyticum.

The prevalence of H.pylori virulence genes (iceA, cagA, babA2, vacA) as well as the distribution of the IL-1 genes was studied in patients with H.pylori-associated gastric and duodenal ulcer disease. VacA s1/m2 iceA1 cagA+ и vacA s1/m2 iceA1 cagA+ babA2 genotypes of H. pylori were shown to be prevalent in the clinic isolates. Four patients were found to be infected with Ureaplasma urealyticum. The combination of the IL_1B _511*Т / IL_1B +3954*C / IL-1RN*2 alleles was shown to be prevalent among the patients with gastric and duodenal ulcer disease. The correlation between the H. pylori genotypes, the IL-1 genes and the peculiarities of ulcer disease was not found.

Key words: Helicobacter pylori virulence factors, IL-1 cytokines, genotyping, ulcer disease, persistence, Ureaplasma urealyticum.

Размещено на Allbest.ru