Исследования выполнены на 200 беспородных крысах обоего пола массой 200-300 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Крысы были разделены на следующие группы: I группа - контрольная (подкожное введение физиологического раствора); II группа - животные с токсическим гепатитом; III группа - крысы, которым на фоне развития токсического гепатита вводили «пустые» липосомы, не содержащие сфингомиелин или церамид; IV группа - крысы, которым на фоне развития токсического гепатита внутривенно вводили липосомы, содержащие церамид; V группа - животные, которым на фоне развития токсического гепатита вводили липосомы, содержащие сфингомиелин. Каждая группа состояла из 40 крыс.

Токсический гепатит вызывали подкожным трехкратным введением с интервалом в 4 сут 50%-го масляного раствора ССl4 из расчета 0,45 мл раствора на 100 г массы тела животного. Введение липосом в дозе 0,05 мл на 100 г массы тела животного осуществляли в бедренную вену в течение 5 сут ежедневно, начиная со второй инъекции CCl4. Липосомы получали методом механической дезинтеграции фосфатидилхолиновой пленки в физиологическом растворе, содержащем 0,2 мг/мл церамида или сфингомиелина [12]. В липосомы включалось до 65% церамида или сфингомиелина. Не включенные в липосомы препараты удаляли с помощью многократного ультрацентрифугирования и удаления надосадочной жидкости.

Декапитацию животных осуществляли на 5, 9, 13 и 17-е сут, следующие за последней инъекцией CCl4, что соответствовало развитию острой фазы воспаления. Каждая группа включала 10 крыс (соотношение самок и самцов - 1:1). Для исследований использовали сыворотку крови и печень животных. Функциональное состояние печени определяли, исследуя активность АлАТ и содержание общего билирубина сыворотки крови с помощью наборов реактивов фирмы «Lachema» (Чешская Республика). Для морфологического исследования печень фиксировали в 10%-м нейтральном растворе формалина. Срезы ткани окрашивали гематоксилином с докрашиванием эозином. При оценке выраженности некрозо-воспалительных изменений использовали индекс гистологической активности (ИГА), известный также как индекс Knodell, который учитывает в баллах следующие морфологические компоненты гепатита: перипортальные некрозы гепатоцитов, включая мостовидные (оцениваются от 0 до 10 баллов), внутридольковые фокальные некрозы и дистрофию гепатоцитов (от 0 до 4 баллов), воспалительный инфильтрат в портальных трактах (от 0 до 4 баллов) и фиброз (от 0 до 4 баллов) [15].

Статистическую обработку результатов проводи- ли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

В сыворотке крови крыс с токсическим гепатитом как при введении липосом, так и без такового наблюдалось увеличение активности АлАТ и содержания общего билирубина на 5-е сут исследования (табл. 1).

Таблица 1 Динамика активности аланинаминотрансферазы и содержания общего билирубина сыворотки крови крыс с экспериментальным токсическим гепатитом на фоне курсового введения липосом, содержащих сфингомиелин и церамид

* Достоверное различие по сравнению с контрольной группой (p < 0,05).

** Достоверное различие по сравнению с группой c токсическим гепатитом без липосомальной коррекции (p < 0,05).

При исследовании морфологической картины в группе крыс с токсическим гепатитом без введения липосом было обнаружено, что большинство гепатоцитов находилось в состоянии некроза, наблюдалась жировая и гидропическая дистрофия (рис. 2). Более высокие показатели печеночных проб на начальном этапе воспалительного процесса (табл. 2, рис. 1) в группах крыс с введением липосом на фоне развития воспаления (группы III, IV, V) по сравнению со группой II могут быть обусловлены тем, что фосфатидилхолин, являющийся структурной основой использованных липосом, может в определенной степени увеличивать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) на начальном этапе за счет наличия в его структуре полиненасыщенной жирной кислоты во втором положении.

Рис. 1 Высокая некрозо-воспалительная активность в печени крысы (ИГА - 14,5 балла) - 5-е сут после инъекции тетрахлористого угле- рода на фоне введения липосом, содержащих cфингомиелин. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 600

Рис. 2 Умеренная некрозо-воспалительная активность в печени крысы (ИГА - 8,5 балла) - 9-е сут после инъекции тетрахлористого углерода. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 600

Это может приводить к усилению активности воспалительного процесса [8].

К 17-м сут исследования в группах животных с вызванным гепатитом, которым вводились липосомы, содержащие компоненты сфингомиелинового цикла (группы IV, V), выявлена нормализация как печеночных проб, так и морфологической картины печени (см. рис. 4).

Установленное корригирующее влияние инъекций липосом на воспалительный процесс может быть обусловлено непосредственным включением вводимых с липосомами липидов в цикл сфингомиелина, участвующего в регуляции активности фосфолипазы А2 - ключевого фермента воспаления [3, 7].

Таблица 2 Оценка морфологической картины ткани печени исследованных групп животных в динамике воспалительного процесса по индексу гистологической активности (индекс Knodell), балл

Примечание. 1-3 балла - минимально выраженный воспалительный процесс; 4-8 баллов - слабо выраженный воспалительный процесс; 9-12 баллов - умеренно выраженный воспалительный процесс; 12 баллов - сильно выраженный воспалительный процесс.

* Достоверное различие по сравнению с контрольной группой (p < 0,05).

Следует отметить, что в группе крыс с токсическим гепатитом, которым вводили липосомы, содержащие сфингомиелин, существенное уменьшение активности некрозо-воспалительного процесса (ИГА = 2,5) наблюдалось уже на 13-е сут (табл. 2, рис. 3), в то время как в группе животных, которым вводили липосомы, содержащие церамид, этот показатель достигал

Рис. 3 Слабая некрозо-воспалительная активность в печени кры- сы (ИГА - 3 балла) - 13-е сут после инъекции тетрахлористого углерода на фоне введения липосом, содержащих церамид. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 600

уровня контрольной группы лишь к 17-м сут эксперимента (рис. 4). Такие различия в эффекте двух типов липосом, по-видимому, обусловлены тем, что сфингомиелин является начальным компонентом сфингомиелинового цикла и лучше встраивается в этот цикл с образованием эндогенного церамида (в отличие от экзогенного церамида), что приводит к более интенсивному образованию сфингозина и сфингозин-1-фосфата [1]. Церамид, синтезированный из сфингомиелина под действием сфингомиелиназы, обладает проапоптотической и антипролиферативной активностью в большей степени по сравнению с его экзогенным аналогом [1].

Рис. 4 Минимальная некрозо-воспалительная активность в печени крыс (ИГА - 1 балл) - 17-е сут после инъекции тетрахлористого углерода на фоне введения липосом, содержащих сфингомиелин. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 600

Одним из эффектов церамида является ингибирование цитохрома Р-450, повышение активности которого является начальным звеном в развитии воспалительного процесса [11]. В связи с этим увеличение содержания церамида будет приводить к снижению воспалительного процесса (рис. 4). В свою очередь, образующийся впоследствии сфингозин-1-фосфат угнетает активацию цАМФ, аденилат-киназу и фосфохолин-стимулированное накопление цАМФ [14]. Можно предположить, что эти эффекты сфингозин-1-фосфата в группах животных с липосомальной коррекцией являются причиной гибели гепатоцитов, возможно, путем апоптоза, альтернативным некрозу способом гибели клеток, что и приводит к снижению активности воспалительного процесса.

Таким образом, в ходе настоящего исследования было установлено снижение активности некрозо-воспалительного процесса в печени, нормализация печеночных проб и существенное улучшение морфологической картины (ИГА = 1) у крыс при введении липосом на фоне развития токсического гепатита. Наиболее выраженные эффекты наблюдались в группах животных, которым производилось введение липосом, содержащих компоненты сфингомиелинового цикла. Следует отметить, что наиболее корригирующее действие на воспалительный процесс в печени оказало введение липосом, содержащих сфингомиелин.

Литература

1. Алесенко А.В. Функции сфингомиелина в клеточной пролиферации и смерти // Биохимия. 1998. Т. 63. № 1. С. 75-82.

2. Алесенко А.В., Бойков П.Я., Дробот Л.Б. и др. Изменение уровня сфингозина в ядрах печени крыс при индуцированной суперэкспрессии онкогенов циклогесемедином // Биохимия. 1994. Т. 59. № 7. С. 1076-1087.

3. Алесенко А.В., Зубова Е.С., Дудник Л.Б. и др. Изменение активности нейтральной и кислой изоформ сфингомиелиназы в гепатоме-22, в регенирирующей и ишемизированной печени // Вопр. мед. химии. 1999. Т. 45. № 6. С. 472-481.

4. Алесенко А.В., Пантаз Э.А., Пушкарева М.Ю. и др. Изменение уровня эндогенного сфингозина в ядрах регенерирующей печени крыс // Биохимия. 1993. Т. 58. № 3. С. 461-470.

5. Бабенко Н.А. Регуляция активности сфингомиелиназы и фосфолипазы с плазматических мембран клеток печени крыс разного возраста // Биохимия. 1991. Т. 56. № 2. С. 346-353.

6. Дудник Л.Б., Цюпко А.Н., Хренов А.В., Алесенко А.В. Влияние билирубина на перекисное окисление липидов, активность сфингомиелиназы и апоптоз, индуцированный сфингозином и УФ-облучением // Биохимия. 2001. Т. 66. № 9. С. 1252-1262.

7. Дятловицкая Э.В. Сфинголипиды и злокачественный рост // Биохимия. 1995. Т. 60. № 6. С. 843-849.

8. Зиямутдинова З.К., Холмухамедова Н.М. Изменение процессов перекисного окисления липидов и содержания индивидуальных ганглиозидов, фосфолипидов в печени крыс с токсическим экспериментальным гепатитом // Вопр. мед. химии. 1992. Т. 38. № 5. С. 16-18.

9. Краснопольский Ю.М., Степанов А.Е., Швец В.И. Некоторые аспекты технологии получения липосомальных форм лекарственных препаратов // Хим.-фарм. журн. 1999. № 10. С. 20-23.

10. Романенко Е.Б., Пушкарева М.Ю., Алесенко А.В. и др. Влияние сфингомиелина и продуктов его ферментативного гидролиза на гетерологичное метилирование ДНК тимуса теленка цитозин-ДНК-метилтрансферазой EcoR II // Биохимия. 1991. Т. 56. № 2. С. 295-300.

11. Саратиков А.С., Венгеровский А.И. Влияние гепатопротекторов, содержащих фосфолипиды, на зависимую от цитохрома Р-450 антитоксическую функцию печени при экспериментальном токсическом гепатите // Бюл. эксперимент. биологии и медицины. 1999. Т. 127. № 4. С. 392-394.

12. Серов В.В. Современная классификация хронических гепатитов // Рус. мед. журн. 1996. Т. 4. № 3. С. 180-182.

13. Хавинсон В.Х., Рыбакина Е.Г., Малинин В.В. и др. Влияние коротких пептидов на реакцию бласттрансформации тимоцитов и процесс сигнальной трансдукции по сфингомиелиновому пути // Бюл. эксперимент. биологии и медицины. 2002. Т. 133. № 5. С. 578.

14. Шпигель С., Кувилье О., Эдзаль Л. и др. Роль сфингозин-1-фосфата в росте, дифференцировке и смерти клеток // Биохимия. 1998. Т. 63. № 1. С. 83-87.

15. Hannun Y.A. Functions of ceramide in coordinating cellular responses to stress // Science. 1996. V. 274. P. 1855-1859.

16. Поступила в редакцию 08.12.2004 г.

Размещено на Allbest.ru