Цитогенетический статус и фенотипические свойства лимфоцитов периферической крови у больных иксодовым клещевым боррелиозом

Размещено на http: //www. allbest. ru/

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Цитогенетический статус и фенотипические свойства лимфоцитов периферической крови у больных иксодовым клещевым боррелиозом

Пирогова Н.П., Новицкий В.В., Хлусова М.Ю.,

Воронкова О.В., Карпова М.Р., Лукашева Л.В.

Аннотация

Поступила в редакцию 21.03.2005 г.

У больных иксодовым клещевым боррелиозом с острым и хроническим течением заболевания исследовали субпопуляционный состав и хромосомный аппарат лимфоцитов периферической крови, бласттрансформацию клеток под влиянием Т- и В-митогенов, продукцию мононуклеарными лейкоцитами ИЛ-12 и ИЛ-10. Секреция ИЛ-12 при остром течении болезни увеличивалась, ИЛ-10 - подавлялась, при хроническом течении заболевания выделение обоих цитокинов повышалось. Уровень хромосомных нарушений в Т-лимфоцитах был выше в дебюте острого периода болезни, к исходу острой фазы боррелиоза регистрировалась нестабильность генома В-лимфоцитов. Дефицит цитотоксических лимфоцитов сопровождался накоплением клеток с кариопатологией.

Ключевые слова: лимфоциты, цитокины, хромосомные аберрации, иксодовый клещевой боррелиоз.

Annotation

Cytogenetic status and phenotypic properties of lymphocytes of peripheral blood among patients with the Ixodidea mite borreliosis

Pirogova N.P., Novitsky V.V., Khlusova M.Yu., Voronkova O.V., Karpova M.R., Lukasheva L.V.

Among patients with acute and chronical clinical course of Ixodidea mite borreliosis there was studied a subpopulation structure and chromosome of peripheral blood lymphocytes, blasttransformation of cells under influence of T- and B-mitogens, production by IL-12 and IL-10 mononuclear leucocytes. Secretion of IL-12 at acute clinical course was increased, IL-10 was depressed, and under chronic clinical course the excretion of both cytoxicants was increased. The level of chromosomal abnormalities in T-lymphocytes was higher in debut of acute period of illness. There was registered the instability of B-lymphocytes genome at the end of acute phase of borreliosis. Deficit of cytotoxic lymphocytes was accompanied by accumulation of cells with caryo- pathology.

Key words: lymphocytes, cytotoxicants, chromosome aberrations, Ixodidea mite borreliosis.

Введение

хромосомный клещевой боррелиоз иммунологический

Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ, болезнь Лайма, Лайм-боррелиоз) - инфекционное трансмиссивное природно-очаговое заболевание, имеющее тенденцию к хроническому и рецидивирующему течению, поражающее многие органы и системы (кожу, нервную систему, опорно-двигательный аппарат, сердце и др.) [3, 4, 10, 12, 16]. Итог бактериальной инвазии детерминируется биологическими свойствами возбудителя, исходным уровнем резистентности и реактивности организма человека. Защитные механизмы организма реализуются при сочетанной деятельности двух основных ветвей сохранения гомеостаза: естественной (неспецифической) резистентности и собственно иммунитета. Факт формирования расстройств иммунологического реагирования регистрируется при развитии различных форм патологии как инфекционного, так и неинфекционного генеза [7, 9, 13]. В основе дисрегуляции иммунитета при внедрении инфекционного агента лежат нарушения клеточных и молекулярных взаимодействий между Т- и В-лимфоцитами, макрофагами, естественными киллерами, некоторыми другими клетками и такими молекулами, как антитела, цитокины, интегрины, селектины, хемокины и пр. [7, 11].

Недостаточность иммунных механизмов приводит к пролонгированию течения инфекционных заболеваний, появлению аутоиммунной патологии, аллергических осложнений [9]. Причиной появления иммунных нарушений, учитывая сомнительную роль боррелий в качестве непосредственного инициатора мутагенеза, может явиться повреждение ДНК-лимфоцитов в результате генотоксических влияний некоторых интермедиатов воспаления [2, 5].

Целью настоящего исследования явилось изучение параметров специфической резистентности, уровня и спектра хромосомных аберраций, продукции ИЛ-12 и ИЛ-10 в динамике течения иксодового клещевого боррелиоза.

1. Материал и методы

В работе обобщены и проанализированы результаты исследования функционального статуса и цитогенетических изменений лимфоцитов периферической крови у 32 лиц мужского и женского пола в возрасте от 18 до 55 лет, больных иксодовым клещевым боррелиозом (острое течение, безэритемная форма, средняя и тяжелая степень заболевания), обследованных на 5-7-е (стадия разгара) и 25-30-е (стадия клинического выздоровления) сутки от начала заболевания, а также 14 человек из этой группы, которые через 6 мес вновь обратились в стационар с хроническим течением ИКБ. Диагноз устанавливался на основе данных анамнеза (факт присасывания клеща), клинической картины заболевания, серологического подтверждения наличия специфических противоборрелиозных антител (НРИФ, ИФА). Контрольную группу составили 20 здоровых доноров с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту.

Материалом исследования являлась венозная кровь. Субпопуляции лимфоцитарных клеток периферической крови определяли с помощью моноклональных антител («Сорбент», г. Москва) в лимфоцитотоксическом тесте [6]. Результаты учитывали, вычисляя относительное (%) и абсолютное (109/л) содержание погибших клеток. Спонтанный лизис клеток составлял 4-5%. Для проведения реакции бласттрансформации лимфоцитов периферической крови в суспензию клеток вносили фитогемагглютинин (ФГА, «Difco», Германия) в концентрации 0,01 мг/мл культуры или липополисахарид (ЛПС) (LPS from E. coli 026:B6, «Sigma») в той же концентрации с последующей инкубацией при 37 С в течение 72 ч. Результаты анализа выражали количеством бластных форм лимфоцитов (%) [6]. Продукцию ИЛ-12 и ИЛ-10 определяли в супернатантах. Выделенные в градиенте плотности фиколла-урографина (1077) мононуклеарные клетки культивировали в среде RPMI-1640 («Sigma») с добавлением 10%-й инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 0,3 мг/мл L-глутамина, 5 мМ Hepes, 100 мкг/мл гентамицина при 37 С и 5%-го СО2 в течение 24 ч [1]. Стимулировали продукцию цитокинов добавлением в среду ЛПС (LPS from E. coli 026:B6, «Sigma»). Концентрацию цитокинов в супернатантах определяли твердофазным иммуноферментным «сэндвичевым» методом (ELYSA) в соответствии с описанием в приложении к тест-системе («Cytimmune», USA). Оптическую плотность растворов регистрировали на ридере ultra microplate BIO-TEC, ELX-808 (Финляндия) при длине волны 492 нм. Цитогенетический анализ проводили по методу, описанному ранее [8]. Статистическую обработку результатов производили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни и корреляционной статистики Пирсона r.

Результаты и обсуждение

Известно, что лимфоциты обладают уникальными свойствами (высокой изменчивостью, деформируемостью, инвазивностью и способностью к рециркуляции), обеспечивающими возможность иммунологического надзора, распознавание и координацию работы лимфоидных органов. В то же время лимфоидные элементы, будучи мигрирующими клетками, способны отражать изменения, происходящие в организме при внедрении патогенного антигена [6].

Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у больных ИКБ в период разгара заболевания позволило выявить статистически значимое снижение численности общей популяции Т-(CD3+)-клеток и CD8+-лимфоцитов. Количество клеток с поверхностным фенотипом CD16+, осуществляющих контроль за генетически нестабильными элементами, увеличивалось и отрицательно коррелировало с количеством CD8+-лимфоцитов (r = -0,95, р < 0,01), на фоне повышения удельной доли аберрантных клеток усиливалась бласттранформация лимфоцитов под влиянием Т- и В-митогенов (табл. 1, 2). Карио- патические нарушения в период разгара клинической симптоматики затрагивали преимущественно Т-кло- ны лимфоцитов (r = 0,96 между ФГА-стимулированными и аберрантными лимфоцитами, р < 0,001).

Таблица 1 Субпопуляционный состав и пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови у больных иксодовым клещевым боррелиозом (X m)

Примечание. ИКБ - иксодовый клещевой боррелиоз; РБТЛ - реакция бластной трансформации лимфоцитов; ФГА - фитогемагглютинин; ЛПС - липополисахарид; бластн. - бластные, перех. - переходные, неизм. - неизмененные формы лимфоцитов.

Здесь и в табл. 2, 3 * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 - достоверность различия показателей по сравнению с показателями в контроле; + - р < 0,05, ++ - р < 0,01 - достоверность различия показателей по сравнению с аналогичными в разгаре заболевания; - р < 0,05 - достоверность различия показателей у больных хроническим ИКБ по сравнению с аналогичными в стадии клинического выздоровления.

Таблица 2 Цитогенетические нарушения в лимфоцитах периферической крови у больных иксодовым клещевым боррелиозом (X m)

Структурные нарушения хромосом лимфоцитов на данном этапе наблюдения были представлены в основном аберрациями хроматидного типа (одиночные фрагменты и изохроматидные разрывы), частота которых в 2,5 раза превышала частоту аберраций хромосомного типа (табл. 2). Полученные данные свидетельствуют о понижении супрессорного потенциала CD8+-клеток, выполняющих прямую киллерную функцию при наличии пермиссивного эффекта секретируемых цитокинов Т-хелперов (ИНФ-, ИЛ-10 и др.) [9, 14]. Анализ цитокинового профиля мононуклеарных лейкоцитов периферической крови выявил увеличение базальной и стимулированной продукции основного иммунорегуляторного цитокина ИЛ-12 по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров, обратную корреляционную зависимость между выделением ИЛ-12 и количеством CD72+-лимфоцитов (r = -0,76, р < 0,05), индекс стимуляции ИЛ-12 не возрастал (табл. 3). Известно, что ИЛ-12, секретируемый моноцитами, индуцирует активное выделение ИФН- NK-клетками и Тh1, ИЛ-10 Тh2 и, таким образом, обеспечивает раннюю защиту от возбудителя [7, 9]. Однако секреция ИЛ-10 в стимулированных и нестимулированных образцах крови больных ИКБ на стадии разгара болезни достоверно снижалась, чем, возможно, объясняется отрицательная корреляционная связь между ИЛ-12 и количеством лимфоцитов, несущих поверхностный маркер CD72+, и отсутствие стимуляции В-клеточного звена иммунитета (табл. 3).

В фазу клинического выздоровления показатели бласттрансформации и нестабильности хромосомного аппарата лимфоцитов периферической крови у больных ИКБ сохранялись на высоком уровне (см. табл. 1, 2). Негативная динамика изменений была выявлена в иммунном статусе макроорганизма: количество CD3+-лимфоцитов по сравнению с контролем было снижено, обращало на себя внимание также прогрессирующее уменьшение числа CD8+-клеток по сравнению с уровнем этого показателя как у здоровых лиц, так и у больных в предыдущий период болезни, что свидетельствует о подавлении активации Т-клона для иммунного ответа на внедрение в организм боррелий. При этом процент клеток с фенотипом CD16+ оказался ниже их содержания в период разгара заболевания, однако абсолютное количество CD16+ сохранялось высоким. Выявленный по итогам исследования факт повышения количества CD72+-лимфоцитов к 30-м сут наблюдения за больными является феноменологическим подтверждением запаздывания антимикробного иммунитета при Лайм-боррелиозе за счет выделения иммуноглобулинов. Однако в этот период болезни цитогенетические нарушения обнаруживались в В-лимфоцитах (коэффициент корреляции r между количеством CD72+-клеток и долей аберрантных лимфоцитов составил 0,87, р < 0,01).

Спустя 6 мес наблюдения, когда диагностировалось хроническое течение ИКБ, на фоне повышенного абсолютного количества лимфоцитов относительное содержание CD3+- и CD8+-клеток сохранялось на низком уровне (см. табл. 1). Однако ФГА-стимулированная пролиферация лимфоцитов, параметры которой продолжали оставаться высокими на протяжении всех этапов обследования больных, положительно коррелировала с абсолютным количеством лимфоцитов и CD8+-клеток (r = 0,84, р < 0,05 и r = 0,78, р < 0,05 соответственно). Процентное содержание CD16+-лимфоцитов уменьшалось по сравнению с таковым в период разгара ИКБ, относительное - оставалось повышенным по сравнению с контролем. Корреляционный анализ показал высокую степень зависимости между уровнем CD16+-лимфоцитов и числом клеток, несущих поверхностный маркер CD3+ (r = 0,94, р < 0,01).

Таблица 3 Продукция цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови у больных иксодовым клещевым боррелиозом (пг/мл 2,5 106 /л, X m)

Примечание. БПЦ - базальная продукция цитокина, СПЦ - стимулированная продукция цитокина, ИС - индекс стимуляции.

Известно, что NK-клетки, секретирующие ИНФ-, индуцируют дихотомию дифференцировки (immune deviation) CD4+ Т-лимфоцитов в пользу Тh1, имеющих поверхностные маркеры Т-лимфоцитов [13, 15]. ИЛ-12 стимулирует процесс дифференцировки CD4+-клеток в Тh1, ИЛ-10 лимитирует эффекторные функции Тh1. У больных ИКБ с хроническим течением процесса увеличивалась базальная и стимулированная продукция ИЛ-12 и ИЛ-10 по сравнению с уровнем выделения этих цитокинов у здоровых доноров и у больных с острым течением болезни. По-видимому, увеличение выделения ИЛ-12 в 2,6 раза от контрольного уровня индуцировало функциональную активацию Тh2, секретирующих ИЛ-10 (r = 0,77, р < 0,05). ИЛ-10 относится к супрессорным факторам и продуцируется не только Т-лимфоцитами, но и В-клетками, макрофагами, подавляет функции Th1-клеток, что дает основание предполагать его возможную роль в определении класса иммунных реакций, направленных на отдельный антиген. ИЛ-10 индуцирует специфическую толерантность к антигену путем подавления продукции провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО-, ИНФ- и ГМ-КСФ, является хемотаксическим фактором для клеток с фенотипом CD8+, подавляет презентацию антигена макрофагами и В-клетками путем снижения экспрессии антигена основного комплекса гистосовместимости II класса [6, 9].

Анализ цитогенетических нарушений лимфоцитарных клеток у больных с хроническим течением ИКБ выявил возрастание в 2 раза доли аберрантных лимфоцитов по сравнению с их количеством в предшествующие периоды болезни и в 10 раз по сравнению с контролем (см. табл. 2). Число хромосомных аберраций на клетку оставалось высоким (почти в 10 раз превышающим показатели здоровых доноров) как при остром, так и при хроническом течении ИКБ. Соотношение частоты аберраций хромосомного и хроматидного типов на 100 клеток при хроническом течении ИКБ было практически равным, при этом хроматидные аберрации были представлены только одиночными фрагментами, не встречались изохроматидные разрывы и разрывы по центромерному участку хромосом, хромосомные аберрации были представлены парными фрагментами, дицентрическими хромосомами, появлялись кольцевые хромосомы, отсутствовали разрывы по центромере.

Заключение

Таким образом, иммунорегуляторные нарушения при ИКБ характеризуются различными феноменологическими проявлениями в зависимости от характера течения патологии. При остром течении ИКБ в период разгара клинической симптоматики заболевания регистрировался дисбаланс Т-клеточного звена иммунитета, коррелирующий с увеличением числа Т-аберрантных лимфоцитов. Запаздывание гуморального ответа в раннем периоде болезни, возможно, было связано с функциональной неполноценностью Th2 и, следовательно, с подавлением продукции ИЛ-10. Активация В-клеточного звена иммунитета обнаруживалась к исходу острого периода болезни и коррелировала с количеством В-аберрантных клеток. Дефицит цитотоксических лимфоцитов, развившийся при ИКБ, сопровождался накоплением клеток с нестабильным геномом, наиболее выраженным при хроническом течении патологии.

Литература

1. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры тканей в гематологии. Томск, 1992.

2. Ильинских Н.Н., Новицкий В.В., Ванчугова Н.Н. и др. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность. Томск, 1991.

3. Коренберг Э.И., Горелова Н.Б., Postic D. и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1999. № 2. С. 3-5.

4. Лобзин Ю.В. Болезнь Лайма - клещевой боррелиоз. СПб., 1996.

5. Москалева Е.Ю., Федоров Н.А., Кизенко О.А., Караулов А.В. // Вест. РАМН. 1993. № 4. С. 12-17.

6. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. // Иммунология. 1994. № 6. С. 6-9.

7. Покровский В.И., Гордиенко С.П., Литвинова В.И. Иммунология инфекционного процесса. М., 1993.

8. Рязанцева Н.В., Жукова О.Б., Новицкий В.В. и др. // БЭБиМ. 2002. Т. 134. № 11. С. 547-550.

9. Фрейдлин И.С., Назаров П.Г. // Вест. РАМН. 1999. № 5. С. 28-32.

10. Barbour A.G. // Am. J. Med. Sci. 1996. V. 311. P. 34-40.

11. Fliegert F.G., Tscherning T., Pabst R. // Exp. Lung. Res. 1996. V. 22. P. 677-690.

12. Ganapamo F., Dennis V.A., Philipp M.T. // Infect. Immun. 2000. V. 68. P. 7162-7165.

13. Kalter E.S. // Resuscitation. 1984. V. 11. P. 133-140.

14. Keane-Myers A., Nickell S.P. // J. Immunol. 1995. V. 155. P. 2020-2028.

15. Lim L.C.L., England D.M., Glowacki N.J. et al. // Infect. Immun. 1995. V. 63. P. 4818-4825.

16. O'Connell S., Granstrцm M., Gray J.S. et al. // Zentralbl. Bakteriol. 1998. V. 287. P. 229-240.

Размещено на Allbest.ru