Изучение состава нового органопрепарата из селезенки свиней методом высокоэффективной хроматографии и электрофоретического анализа

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изучение состава нового органопрепарата из селезенки свиней методом высокоэффективной хроматографии и электрофоретического анализа

Заико Марина Валерьевна

Кафедра организации фармацевтической деятельности Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова. г. Москва, Россия

Аннотация

Статья посвящена изучению химического состава нового органопрепарата из селезёнки свиньи. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс- и УФ-спектрофотометрическим детектором и электрофоретического анализа обнаружены три белковых фракции с молекулярной массой более 13 кДа.

Ключевые слова: селезёнка свиньи, высокоэффективная жидкостная хроматография, электрофоретический анализ.

Введение

Одной из актуальнейших проблем современного здравоохранения является широкое распространение иммунодефицитных состояний человека [1]. В связи с этим перед эмпириической фармакологией и фармацией стоит важная задача - поиск новых биологически-активных веществ и разработка лекарственных препаратов на их основе, повышающих функцию иммунитета и/или предотвращающих её снижение 2.

Одним из путей стимуляции иммунного ответа по возможности не нарушаемых механизмов функционирования иммунной системы является использование органопрепаратов, приготовленных на основе селезёнки домашнего скота [1, 3].

Известно, что в селезёнке, вырабатываются иммунологически активные вещества, а именно белковые факторы, обуславливающие усиление гуморального иммунного ответа и ингибирование его. Это позволяет считать, что селезёнка играет важную роль в регуляции иммуногенеза [3].

В связи с этим во многих странах уже долгие годы с успехом проводятся работы по изысканию и внедрению препаратов селезёнки из крупного рогатого скота и свиней 4.

В странах ЕС разработаны и внедрены препараты: «Спленотрат» (Германия), «Солкосплен» (Швейцария), «Полиегра» (Англия). В 1945 году в СССР был разработан и внедрён в медицинскую практику препарат «Спленин», но в настоящее время российская фармацевтическая промышленность препараты этого типа не производит 5.

В 1990 году разработан российский препарат «Спленопид» и технология его получения из селезёнки свиней и крупного рогатого скота. Дальнейшее совершенствование и модернизация «Спленопида» привели к созданию нового препарата из селезёнки свиней с условным названием - «Спленактив». В экспериментах in vitro он достоверно активизировал синтез в иммунокомпетентных клетках все виды цитокинов и интерферонов, что свидетельствовало о иммунотропной активности препарата «Спленактив».

Вместе с тем, до настоящего времени не имелось подробных данных о составе препарата.

Целью настоящей работы было определение качественного состава нового органопрепарата из селезёнки свиньи («Спленактив») методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофоретического анализа.

Экспериментальная часть

Объект исследования: препарат «Спленактив», который представляет собой сухой экстракт селезёнки свиньи.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Определение структуры соединения проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе Waters MSD SQD-ESI, укомплектованного УФ-спектрофотометрическим детектором и масс-спектрометром. Детектирование осуществлялось при длине волны 220 нм на колонке Waters Acquity 1.7 µm 2.1х50 mm при температуре элюирования 40 ?С в течение 15 мин. В качестве подвижной фазы использовалась система растворителей вода - ацетонитрил - муравьиная кислота в соотношении 50 : 50 : 0.1. Скорость потока элюента - 0.4 мл/мин 8.

Электрофоретический анализ. Исследуемые препараты лизата клеток селезенки анализировали методом вертикального электрофореза в денатурирующих условиях по Лэмли [9] как в редуцирую-щих, так и в нередуцирующих условиях, в пластинах полиакриламидного мини-геля размером 100х80х1 мм (Mini-PROTEAN II Electrophoretic Cell, «BIO-RAD»), а так же в пластинах макси-геля размером 165х220х1,5 мм (Adjustable slab gel System, «C.B.S. Scientific company, Inc.»). Концентрация акриламида в верхнем геле составляла 5%, в разделяющем - 12.5%.

Перед исследованием указанные навески препаратов растворяли в рассчитанном количестве фосфатно-солевого буфера с рН 7.2, чтобы достичь одинаковых концентраций (20 мг/мл).

Результаты и их обсуждение

лекарственный иммунитет селезенка свинья

Методом ВЭЖХ с использованием УФ-спектрофотометрического и масс-спектрометрического детектирования исследован препарат «Спленактив». Хроматограмма и масс-спектр препарата представлены на рис. 1а,б.

а)

б)

Рис. 1. Хроматограммы препарата «Спленактив», зарегистрированные УФ-спектрофотометрическим детектором (а) и масс-спектрометрическим детектором (б)

Рис. 2. Электрофорез лизатов клеток селезенки, окраска серебром. М - трек белкового маркера молекулярного веса (от 10 до 200 кДа); 1, 2 - препараты СПЛ+ДГК и СПЛ соответственно (исходная концентрация 20 мг/мл), по 4 мкл, с добавлением DTT; 3, 4 - препараты СПЛ+ДГК и СПЛ соответственно (исходная концентрация 20 мг/мл), по 4 мкл, без DTT; 5, 6 - препараты СПЛ+ДГК и СПЛ соответственно (исходная концентрация 20 мг/мл), по 2 мкл, с добавлением DTT; 7, 8 - препараты СПЛ+ДГК и СПЛ соответственно (исходная концентрация 20 мг/мл), по 2 мкл, без DTT.

На хроматограмме присутствуют три пика, зарегистрированные УФ-спектрометрическим детектором, с молекулярными масссами 13.827 кДа, 14.161 кДа, 15.278 кДа соответственно. Указанные пики свидетельствуют о наличии трех групп веществ белковой природы в достаточно высокой концентрации. Помимо этого были обнаружены неиндентифицированные пики в следовых количествах.

Окрашивание геля после электрофореза осуществляли нитратом серебра с использованием коммерческого набора реактивов фирмы «Fermentas», по протоколу фирмы изготовителя. Результат документировали фотографированием окрашенного геля в гель-документирующем комплексе BioDocIt фирмы «UVP» с использованием инвертора длинно-волнового УФ в белый свет (рис. 2) 8.

Данные электрофоретического анализа свидетельствуют о наличии в препарате трех белков с молекулярным весом более 13 кДа.

Выводы

1. В новом органопрепарате из селезёнки свиней - «Спленактив» методом ВЭЖХ было обнаружено три белковых фракции с молекулярными массами более 13 кДа, что подтверждается данными, полученными в результате электрофоретического анализа.

2. Фармакологический эффект препарата «Спленактив», а именно стимуляция синтеза иммунокомпетентных биологически активных веществ, по всей видимости связан с наличием в нём вышеуказанных веществ белковой природы.

Литература

1. Алиев М.А. Использование гомогената ксеноселезёнки в лечении гнойных ран и трофических язв. Медодические рекомендации. Махачкала. 1994. С.69.

2. Васильченко А.В. Применение экстракорпорального подключения донорской селезёнки свиньи и спленоперфузата в комплексном лечении хронических язв двенадцатиперстной кишки: Автореф. дис. . канд.мед.наук. М. 1996. С.171.

3. Винницкий Л.И., Бунатян К.А. Иммунологические проблемы в хирургической клинике. Иммунологиченский мониторинг патологических состояний и иммунореабилитация. Тез. док. Всероссийской конференции. М. 1995. С.143-144.

4. Геворкян С.К. Влияние экстрактов селезёночных клеток на иммуногенез у необлучённых и облучённых мышей. Автореферат канд. мед. Наук. 1997. С.134.

5. Георгиевский В.П. Новые подходы к стандартизации суммарных лекарственных препаратов растительного и животного происхождения. 1998. С.100-104.

6. Плетенёва Т.В. Токсикологическая химия. Эксмо. 2008. С.356.

7. J.W. Hadden. Immunostimulants. Immonol. Today. 1993. Vol.14. P.275-280.

Размещено на Allbest.ru