Использование гидролаз некрахмалистых полисахаридов. Антиоксидантная активность полученных извлечений

Исследование особенностей применения ферментных препаратов "Целлюкласта" и "Шеарзима", содержащих гидролазы некрахмалистых полисахаридов, при получении водных извлечений чаги. Анализ особенностей антиоксидантной емкости полученных водных извлечений.

Рубрика Медицина
Вид статья
Язык русский
Дата добавления 05.12.2018
Размер файла 258,4 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Файл не выбран
РћР±Р·РѕСЂ

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Полная исследовательская публикация ______ Сысоева М.А., Хабибрахманова В.Р., Гамаюрова В.С., Муллина Д.В.,

Кузнецова О.Ю., Зиятдинова Г.К. и Будников Г.К.

Размещено на http://www.allbest.ru/

38 _________________ http://butlerov.com ______________________________________ ©-- Butlerov Communications. 2005. Vol.7. No.4. 36.

36 __________________ г. Казань. Республика Татарстан. Россия. __________________________ ©--Бутлеровские сообщения. 2005. Т.7. №4.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГИДРОЛАЗ НЕКРАХМАЛИСТЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ. АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ

Сысоева Мария Александровна, Хабибрахманова Венера Равилевна,

Гамаюрова Валентина Семеновна,1Муллина Дарья Вячеславовна,Кузнецова Ольга Юрьевна, Зиятдинова Гузель Камилевна и Будников Герман Константинович

Резюме

Исследовано применение ферментных препаратов «Целлюкласта» и «Шеарзима», содержащих гидролазы некрахмалистых полисахаридов, при получении водных извлечений чаги. Показана эффективность их использования с целью увеличения выхода основного действующего вещества полифенолоксикарбонового комплекса и углеводов, обеспечивающих терапевтический эффект водных извлечений чаги. Определена антиоксидантная ёмкость полученных водных извлечений и полифенолоксикарбонового комплекса.

Ключевые слова: чага, экстрактивные вещества, гидролазы некрахмалистых полисахаридов, целлюлоза, гемицеллюлозы, ферментные препараты, антиоксидантная активность.

полисахарид чага препарат ферментный

Введение

Водные извлечения чаги издавна используются в народной медицине, а препараты на их основе - в афицинальной медицине. Они применяются в качестве вспомогательных средств при лечении гастритов различной этиологии, предраковых и раковых заболеваний [1]. Предполагается, что основным действующим веществом извлечений является полифенол-оксикарбоновый комплекс (ПФК). Однако, следует отметить, что водой из чаги извлекается широкий спектр и других биологически активных соединений, таких как флавоноиды, полисахариды и другие [1-3]. Особое внимание уделяется содержанию зольных элементов получаемых извлечений. Их количество может составлять от 25 до 40% от сухого остатка. Известно, что снижение количества зольных элементов в препаратах на основе чаги благоприятно сказывается на терапевтическом эффекте при лечении гастритов [4, 5]. Оценка биологической активности получаемых извлечений и ПФК in vivo может быть проведена по их антиоксидантной активности, поскольку раковые заболевания относят к свободнорадикальным патологиям [6].

Актуальной проблемой является повышение выхода экстрактивных веществ из природного сырья. Эта проблема может решаться различными способами - химическими, физическими, технологическими. Последнее время в практике работы с растительным и другим сырьём природного происхождения применяют и биологические способы, в частности использование ферментов различного действия. Их применение позволяет целенаправленно проводить деградацию определённых соединений, например, белков, полисахаридов или липидов сырья. Это приводит к высвобождению из сырья большего количества соединений, по сравнению с экстракцией. Такое целенаправленное воздействие на сырьё чаще всего позволяет выделить больший спектр биологически активных соединений и повысить их выход.

Выбор ферментов для этих целей диктуется структурой и свойствами сырья, наличием соответствующих ферментных препаратов на отечественном рынке и совпадением оптимума их катализа с условиями проведения экстракции.

Чага является дереворазрушающим грибом, растущим преимущественно на берёзах. Этот гриб является бесплодной формой трутовика Inonotus obliquus [7-16].

Рис. 1. Трутовый гриб Inonotus obliquus - чага.

Чага вызывает в древесине белую гниль или вернее коррозионный тип гниения (по Фальку), поскольку обладает набором ферментов, позволяющим разрушать и использовать все элементы древесины, как клетчатку, так и лигнин [7]. Основным исходным строительным материалом этого гриба являются продукты окисления сахаров и сами сахара, а также ароматические соединения, высвобождающиеся при распаде молекулы лигнина. Грибы белой гнили обладают способностью связывать высвобождающиеся лигниновые мономеры в высокополимерные соединения типа гуминовых кислот. Соединения такого рода несвойственны грибам, вызывающим декструктивный распад древесины [17]. Хотя Бондарцев А.С. по морфологической картине разрушения рассматривает чагу как декструктивную гниль [18]. По Кэмпбеллу чагу относят к третьей группе дереворазрушающих грибов, так как для нее характерен одновременный распад лигнина и клетчатки. Некоторые авторы предлагают называть такой тип гнили - коррозионно-декструктивным [19-21].

Согласно приведённым данным по биологии гриба, а также химическому составу (в чаге содержатся целлюлоза - 2.09% и гемицеллюлозы - 12.50% [2]), для увеличения выхода экстрактивных веществ в водных извлечениях чаги выбраны ферментные препараты способные проводить гидролиз некрахмалистых полисахаридов.

Известно, что нативную целлюлозу, особенно целлюлозу, содержащую лигнин, ферментами гидролизовать невозможно [22]. Поэтому нативную целлюлозу для проведения гидролиза целлюлазами подвергают предобработке. Удаление лигнина - очень важный шаг в предобработке нативной целлюлозы и целлюлозосодержащих материалов. Целлюлоза, содержащаяся в чаге, прошла предварительную биологическую предобработку. Она очищена от лигнина в процессе метаболизма гриба, то есть, с теоретической точки зрения гидролиз целлюлазами возможен. Для сравнения: берёза, на которой растет гриб, содержит - целлюлозы 39.4%, гемицеллюлоз 26.5%, лигнина 19.7% и зольных элементов 0.4%; верховой торф, прошедший природную обработку (степень разложения 15-20%) содержит гемицеллюлоз 16-36%, целлюлозы 20-24%, не содержит лигнина и зольных элементов [22].

Гемицеллюлозы это полисахариды, сильно отличающиеся структурными элементами, которые соединены -1,4-связью, довольно часто в них встречаются ответвления от основной цепи по -1,3- и -1,6-связям. Из всех гемицеллюлоз только очень немногие виды ксиланов, глюканов и маннанов имеют фибриллярное строение, гораздо чаще они имеют ветвистое строение. Кроме гемицеллюлоз, растворимых в щелочах, чага в процессе жизнедеятельности образует большое количество водорастворимых полисахаридов 6-8% (от сухого остатка) [23]. При химическом гидролизе водных извлечений и выделяемых из неё объектов обнаруживают глюкозу, ксилозу, следы галактозы, иногда фруктозу. Следовательно, гемицеллюлозы и другие полисахариды могут отличаться по своей структуре [3].

Исследованию полисахаридов чаги посвящено много работ, однако единого мнения об отнесении их к глюканам, пентозанам или гумми-веществам нет. При изучении противоязвенного действия биологически активных фракций, выделенных из сухого экстракта чаги, полученного с использованием в экстракции ультразвука, установлено, что существенный защитный эффект проявляют полисахариды чаги [1].

Табл. 1. Характеристика ферментных препаратов

Ферментный

препарат

Оптимальные условия применения

ферментных препаратов

Активность ферментных

препаратов,

ед/г

Т, єС

рН

Шеарзим

60-80

4.5-5.5

500

Целлюкласт

50-60

4.5-6.0

400

Для увеличения выхода экстрактивных веществ, при получении извлечений чаги, нами были выбраны микробиологические ферментные препараты «Целлюкласт» (Celluclast) и «Шеарзим» (Shearzim), содержащие в своём составе гидролазы некрахмалистых полисахаридов. Они производятся датской компанией Новозаймс (Novosim), доступны и используются в спиртопроизводстве для снижения вязкости замесов. Их применение особенно эффективно при проведении предобработки ржи, содержащей очень много пентозанов. Ферментный препарат «Целлюкласт» обладает выраженной целлюлазной активностью, а «Шеарзим» - пентозаназной [24]. Оптимум действия ферментных препаратов представлен в табл. 1.

Результаты и дискуссия

Для определения эффективности действия гидролаз некрахмалистых полисахаридов с целью повышения выхода экстрактивных веществ в извлечениях чаги проведено исследование их применения в интервале концентраций 0.01-0.1%. Результаты эксперимента приведены в табл. 2, 3.

Согласно табличным данным, применение ферментных препаратов «Целлюкласт» и «Шеарзим» при экстракции чаги в концентрации 0.01% оптимально увеличивает выход экстрактивных веществ в исследованном интервале концентраций по сравнению с контролем. При этом наблюдается увеличение сухого остатка, возрастает содержание основного действующего вещества водного извлечения - ПФК. Увеличивается выход зольных элементов и количество углеводов.

Табл. 2. Получение водной вытяжки чаги с применением ферментного препарата «Шеарзим»

Экстрагент

Концентрация

ферментного

препарата, %

Выход,

%

Сухой

остаток, г

Зольность

ПФК

Углеводы

г

%*

Вода

-

10.91

0.55

1.7028

0.3648

21.42

Раствор ферментного

препарата

0.001

11.25

-

1.6882

0.4188

24.82

0.01

13.56

0.69

1.9299

0.4923

26.58

0.1

10.72

-

1.3192

0.3524

23.16

* - процент от сухого остатка

Табл. 3. Получение водной вытяжки чаги с применением ферментного препарата «Целлюкласт»

Экстрагент

Концентрация

ферментного препарата, %

Выход,

%

Сухой

остаток, г

Зольность

ПФК

Углеводы

г

%*

Вода

-

10.91

0.55

1.7028

0.3648

21.42

Раствор ферментного

препарата

0.001

9.65

-

1.3615

0.3046

22.50

0.01

13.45

0.73

1.8321

0.4308

25.71

0.1

11.85

-

1.5333

0.3547

23.39

* - процент от сухого остатка.

Увеличение суммарного содержания экстрактивных веществ (по сухому остатку), при использовании «Шеарзима» почти в два раза выше 13.3%, чем при применении «Целлюкласта» - 7.6% (здесь и далее в относительных процентах), по отношению к контролю. Можно отметить, что использование ферментного препарата «Шеарзим» в этой концентрации позволило увеличить выход ПФК на 24.3% по сравнению с контролем, а «Целлюкласта» на 23.3%. Извлечения из чаги полученные с «Целлюкластом», более богаты углеводами, увеличение по сравнению с контролем - 32.7%, в то время как у «Шеарзима», только 25.5%. Интересно отметить и различие диффузии зольных элементов из сырья при использовании ферментных препаратов. Более высокая зольность, по сравнению с контролем, получена при использовании «Шеарзима» - на 35%, а «Целлюкласта» - только на 18.1%. Анализ полученных результатов позволяет заключить, что в целом, применение в экстракции чаги ферментного препарата «Целлюкласт» позволяет увеличить содержание в извлечении веществ органической природы, а «Шеарзима» - неорганической.

Проведено исследование антиоксидантной активности полученных извлечений из чаги и соответственно ПФК. Полученные результаты представлены в табл. 4.

Применение в экстракции чаги ферментных препаратов «Шеарзима» и «Целлюкласта» приводит к существенному снижению антиоксидантной емкости, как получаемых извлечений, так и выделенных из них ПФК.

Табл. 4. Результаты кулонометрического определения антиоксидантной емкости (n = 5, p = 0.95).

Объект исследования

Антиоксидантная емкость,

кКл/100 г ПФК

Sr

Водное извлечение из чаги

29.37±0.01

0.02

Извлечение из чаги с применением «Шеарзима»

18.63±0.04

0.01

Извлечение из чаги с применением «Целлюкласта»

17.62±0.05

0.01

ПФК водного извлечения

32±2

0.06

ПФК извлечения с применением «Шеарзима»

25±2

0.05

ПФК извлечения с применением «Целлюкласта»

25±2

0.07

При введении в экстрагент целлюлолитических ферментов происходит гидролиз соответствующих субстратов, присутствующих в сырье. Можно пред-положить, что выделяемые продукты гидролиза целлюлозы, гемицеллюлоз и полисахаридов чаги влияют на формирование дисперсионной фазы и дисперсной среды золя получаемого извлечения, снижая антиоксидантную ёмкость, как вытяжки, так и формируемого в этих условиях ПФК. Следует отметить высокую вероятность проявления иного биологического действия экстрагируемых в указанных условиях извлечений чаги, что, естественно, требует проведения дополнительных испытаний.

Экспериментальная часть

Для экстракции использовали сырье чаги, приобретенное в аптечной сети, производитель ООО «Травы Башкирии». Вытяжки получали проведением процесса ремацерации [25]. Экстракцию проводили в оптимальных условиях работы ферментных препаратов «Шеарзима» и «Целлюкласта» - рН = 5.5, Т = 70 єС. По стандартным методикам определяли сухой остаток и зольность [26, 27] водных извлечений чаги. Содержание углеводов анализировали антроновым методом [28, 29]. Антиоксидантную активность ПФК и водных вытяжек чаги определяли с помощью кулонометрического метода, основанного на взаимодействии водных экстрактов и растворов с электрогенерированными соединениями брома [30, 31]. Электрогенрацию брома осуществляли на потенциометре П-5827М при постоянной силе тока 5.0 мА из 0.2М KBr в H2SO4. Конец титрования определяли амперометрически, в ячейке с двумя поляризованными платиновыми электродами (ДЕ = 300 мВ). Рабочим электродом служила гладкая платиновая пластинка площадью 1 см2, вспомогательным электродом - платиновая спираль, отделенная полупроницаемой перегородкой от анодного пространства ячейки.

Выводы

Показано, что применение микробиологических ферментных препаратов «Целлюкласт» и «Шеарзим», содержащих в своём составе гидролазы некрахмалистых полисахаридов, эффективно использовать в экстракции чаги для повышения выхода экстрактивных веществ в получаемых извлечениях.

Определена антиоксидантная активность, получаемых с помощью примененных в экстракции ферментов, извлечений чаги и полифенолоксикарбонового комплекса. Выдвинуто предположение, что полученные низкие значения антиоксидантной активности, как вытяжки, так и полифенолоксикарбонового комплекса, по сравнению с контролем, можно объяснить тем, что под действием применённых ферментных препаратов изменяется формирование дисперсионной фазы и дисперсной среды золя получаемого извлечения чаги, соответственно меняются их физико-химические свойства.

Установлено, что составы получаемых извлечений отличаются содержанием органической и неорганической компоненты экстрактивных веществ, как от контроля, так и между собой.

Литература

[1] Рыжова Г.Л., Кравцова С.С., Матасова С.А., Грибель Н.В., Пашинский В.Г., Дычко К.А. Химические и фармакологические свойства сухого экстракта чаги. Химико-фармацевтический журнал. 1997. №10. С.44-47.

[2] Шиврина, А. Н., Ловягина Е.В., Платонова Е. Г. О химическом составе чаги. Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л.: Медгиз. 1959. Вып.9. С.55-61.

[3] Платонова Е.Г. Характеристика водорастворимых углеводных комплексов чаги и других трутовиков. Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.: Наука. 1961. 279с.

[4] Якимов П.А. Ступак М.Ф. Зольные элементы чаги и препарата из нее. Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л.: Медгиз. 1959. Вып.9. С.50-54.

[5] Андреева С.М., Якимов П.А., Алексеева Е.В. К вопросу обеззоливания диффузионных соков из чаги. Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.: Наука. 1961. С.139-143.

[6] Мари Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. В 2-х томах. Т.2. М.: Мир. 1993. 415с.

[7] Низковская О.П., Милова Н.М., Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. К вопросу биологии и биохимии культуры чаги. Труды ин-та микробиол. АН СССР. 1959. Вып.6. С.277-285.

[8] Кузнецова М.А., Байгильдеева М.Г. Дикорастущие лекарственные растения Татарии и их ресурсы. Казань: Таткнигоиздат. 1970. 176с.

[9] Кузнецова М.А. Лекарственное растительное сырье. М.: Высшая школа. 1984. 207с.

[10] Кузнецова М.А. Лекарственное растительное сырье и препараты. М.: Высшая школа. 1987. 191с.

[11] Фармакотерапевтический справочник. Под ред. Ф.П. Трикус. Киев: Здоровье. 1979. 608с.

[12] Соколов С.Я., Замотаев И.П. Справочник по лекарственным растениям (фитотерапия). М.: Недра. 1989. 512с.

[13] Лекарственные растения СССР. М.: Планета. 1988. 200с.

[14] Чхве Тхэсоп. Лекарственные растения. Пер. с корейск. М.: Медицина. 1987. 608с.

[15] Лекарственные средства, применяемые в медицинской практике в СССР. Под ред. М.А. Клюева. М.: Медицина. 1990. 512с.

[16] Волкинд И.В., Гуревич И.Я., Урюпов О.Ю. Рецептурный справочник для врачей и фармацевтов. Л.: Медицина. 1976. 648с.

[17] Никитин Н.И. Химия древесины и целлюлозы. М.-Л.: Изд-во АН СССР. 1962. 711с.

[18] Грушников О.П., Антропова О.Н. Микробиологическая деградация лигнина. Успехи химии. 1975. Т.44. №5. С.935-967.

[19] Бондарцев А.С. Трутовые грибы Европейской части СССР и Кавказа. М.-Л.: Изд-во АН СССР. 1953. 1057с.

[20] Ванин С.И. Древесиноведение. М.: Наука. 1952. 432с.

[21] Ванин С.И. Лесная фитопатология. М.: Наука. 1955. 386с.

[22] Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М.: Элевар. 2000. 512с.

[23] Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. К характеристике комплекса сложных органических соединений чаги. Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л.: Медгиз. 1959. Вып.9.С.72-84.

[24] Солярек Л. Роль вспомагательных ферментных препаратов Новозаймс в совершенствоании технологии производства и повышении качества спирта. В матер. семинара «Изменения в вопросах стандартизации продукции отрасли, совершенствование технологии производства и НТД». М. 2001. С1-9.

[25] Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой сстемы при проведении экстракции различными способами. Вестник Казанского технологического университета (КГТУ). 2003. №2. С.172-179.

[26] Государственная фармакопея СССР: Вып.1. Общие методы анализа. 11-е изд., доп. М.: Медицина. 1987. 336 с.

[27] Государственная фармакопея СССР: Вып.2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. 11-е изд., доп. М.: Медицина. 1989. 400с.

[28] E.W. Yemm, A.J. Willis. J.Biochem. 1954. Vol.57. No.3. P. 508-513.

[29] Ермаков А.И., Арасимович В.В, Смирнова-Иконникова М.И, Мурри И.К. Методы биохимического исследования растений. М.: Наука.. 1972. 400с.

[30] Абдуллин И.Ф., Турова Е.Н., Будников Г.К. Электрогенерированный бром - реагент для определения антиоксидантной способности соков и экстрактов. Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2002. Т.68. №9.С.12-15.

[31] Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Суханов П.П., Зиятдинова Г.К., Будников Г.К. Исследование золя вводных извлечений чаги. IV. Антиоксидантная активность. Влияние способа извлечения и применение комплексонов, гидроокиси натрия. Химия растительного сырья. 2005. №1. С.41-47.

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.