Новый метод оценки возможных генотоксических эффектов продуктов питания и лекарственных препаратов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Новый метод оценки возможных генотоксических эффектов продуктов питания и лекарственных препаратов

В.С.Сибирцев, А.В.Гарабаджиу

Abstract. Рассмотрена новая схема анализа ДНК (использующая систему из двух флуоресцентных нуклеотид-специфичных красителей с согласованными свойствами) - которая дает возможность оценивать не только общее количество, но и степень изменения структуры клеточного генома. А также рассмотрен ряд новых методов биотестирования, разработанных на основе вышеупомянутой схемы анализа ДНК - которые дают возможность оценивать: "общую микробную обсемененность" жидких сред; возможные генотоксические эффекты различных продуктов питания, лекарственных препаратов, угнетающих факторов окружающей среды (в т.ч. при совместном их действии на живые организмы); индивидуальную радиационную чувствительность организма и т.д.

Key words: biotesting, DNA analysis, fluorescent dyes on DNA

В последнее время, в связи со все более интенсивным развитием фармакологии, различных биотехнологических методов, а также увеличением общего уровня антропогенной нагрузки на окружающую среду, весьма важной становится проблема достаточно быстрой оценки возможности проявления каких-либо генотоксических эффектов от новых или модифицированных пищевых продуктов, БАВ, лекарственных препаратов и т.д. - причем как при изолированном действии их на живой организм, так и при сочетании с другими продуктами питания, лекарственными препаратами, различными факторами окружающей среды, специфическими для того или иного региона, и т.д. А кроме того, часто важна и проблема достаточно быстрой и комплексной оценки степени экологического неблагополучия какого-либо региона… причем даже в случае, когда стандартными методами там не фиксируется превышение норм ни по одному из возможных факторов; однако в комбинации друг с другом они могут оказать повреждающее действие на людей и другие живые организмы.

Решены вышеупомянутые проблемы могут быть разными способами… но наиболее приемлемым представляется использование для этих целей стандартных биосистем (которые по своим характеристикам близки к человеческому организму, дешевы, доступны в массовом количестве и имеют относительно короткий жизненный цикл)… одним из важнейших параметров, характеризующих состояние которых, являются изменения в структуре их клеточного генома... которые, в свою очередь, наиболее просто и быстро, по нашему мнению, могут быть выявлены с помощью синтетических флуорофоров, способных взаимодействовать с ДНК в том числе и непосредственно в клеточном ядре и чувствительных к присутствию даже довольно малых количеств нуклеиновых кислот… вследствие чего, ДНК-специфичные флуорофоры могут быть использованы, помимо упомянутого, в качестве лекарственных препаратов, в исследовательских, диагностических целях и т.д.

В связи с вышесказанным, целью настоящей работы стало:

- разработать метод анализа с помощью ДНК-специфичных флуорофоров не только общего количества нуклеиновых кислот, но и изменений в структуре генома клетки;

- разработать на основе вышеизложенного метод оценки с использованием стандартных биосистем возможных генотоксических эффектов различных продуктов питания, лекарственных и иных препаратов, а также угнетающих факторов окружающей среды… в том числе при сочетанном их действии на человека и другие живые организмы;

- а также рассмотреть возможности применения ДНК-специфичных флуорофоров в других методах диагностики и мониторинга, основанных на количественном и качественном анализе генетического материала клеток.

Анализ ДНК с помощью системы из двух красителей с согласованными свойствами

При всем разнообразии вышеупомянутых потенциальных возможностей для использования флуорофоров спектр методов конкретного, практического применения таких веществ до сих пор еще далеко не так велик, как хотелось бы. Связано это, в частности, с тем, что "сильное" избирательное связывание с субстратом, как правило, требует от лиганда одних структурных особенностей, а наличие пригодных для регистрации свойств - других. И одним из лучших путей разрешения этого противоречия нам представляется использование для анализа нуклеиновых кислот систем, включающих в себя несколько нуклеотид-специфических флуорофоров, несвязанных между собой непосредственно (поскольку отдельные фрагменты большого комплексного вещества способны не только взаимодополнять, но и мешать друг другу) а только через общий для них субстрат, но имеющих согласованные комплексообразующие и спектральные свойства.

В качестве примера одной из таких систем нами были выбраны два широкоиспользуемых (по-отдельности), коммерческих ДНК-специфичных флуорофора: этидий бромид (2,7-диамино-10-этил-9-фенил-фенантридиниумбромид) (EB) и Хехст-33258 (2-[2-(4-гидроксифенил)бензимидазол-5(6)-ил]-5(6)-(4-метилпиперазин-1-ил)бензимидазол) (Ht). Первый из которых (EB) является интеркалятором, прослаивающимся между двумя парами оснований двойной спирали полинуклеотида с некоторым предпочтением к его гуанин-цитозин (GC) богатым участкам, но в основном специфичным ко вторичному и более высоким порядкам организации молекулы ДНК [1]. Тогда как второй (Ht) присоединяется к молекуле ДНК "снаружи" и предпочтительно специфичен к участкам двойной спирали полинуклеотида, содержащим три последовательно расположенных аденино-тиминовых (AT) и одну GC пары оснований [2] (рис.1). А кроме того, при совместной сорбции на полинуклеотиде между молекулами этих красителей может происходить флуоресцентный резонансный безизлучательный перенос энергии (FRET). FRET - это явление, когда при возбуждении флуоресценции молекул донора энергии (в нашем случае, Хехста) светиться начинают не только они, но и молекулы акцептора энергии (в нашем случае, этидия бромида). FRET может происходить только когда область длин волн флуоресцентной эмиссии донора энергии в значительной мере пересекается с областью длин волн возбуждения флуоресценции акцептора энергии (что и имеет место в случае Ht и EB) (рис.2). И эффективность FRET весьма значительно зависит от расстояния между хромофорными группами донора и акцептора энергии [3,4]. днк геном биотестирование микробный

Таким образом очевидно, что при совместном использовании Ht и EB можно оценивать не только общее количество ДНК в пробе, но и степень изменения структуры клеточного генома. Ниже мы рассматриваем практический пример одной из возможных схем анализа генетического материала с помощью системы “Hт+ЕВ”.

1) К 0,1 мл пробы (в качестве которой может быть использована, например, цельная кровь) добавляем 1 мл водной лизирующей смеси - используемой для того, чтобы нарушить целостность клеточных стенок, а также внешних клеточных и ядерных мембран, и таким образом обеспечить доступ красителя из "внешнеклеточного" раствора к внутриклеточной ДНК, и содержащей 2M NaCl + 0.1M Na₂EDTA (ethylenediamine tetraacetate, disodium salt) + 0.01M Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) + 0.5% (v/v) Triton X-100 (4-octyl-[2,4,6,8,10-decapentol]hydroxybenzene) (pH 8.0). Инкубируем результирующую смесь в течение 5 мин. Затем, к 0,05 мл полученного раствора добавляем 1 мл стандартного водного буфера - содержащего 0.01M NaCl + 0.01M Na₂EDTA + 0.01M Tris (pH 7.4). В результате, получаем раствор 1, для которого определяем значения фоновых интенсивностей флуоресценции: I_FX (при длинах волн возбуждения и эмиссии: 350 и 455 нм - соответствующих комплексу Ht с ДНК) и I_FE (при длинах волн возбуждения и эмиссии: 520 и 605 нм - соответствующих комплексу EB с ДНК).

2) Добавляем к 1,05 мл 1-раствора 0,05 мл раствора, содержащего 10 мкг/мл Ht в стандартном водном буфере. В результате, получаем раствор 2, для которого при длинах волн возбуждения и эмиссии: 350 и 455 нм определяем интенсивность флуоресценции I_H. Затем, добавляем к 1,1 мл 2-раствора 0,02 мл раствора, содержащего 60 мкг/мл стандартной ДНК в стандартном водном буфере. В результате, получаем раствор 3, для которого при тех же длинах волн, что и ранее определяем интенсивность флуоресценции I_DH. После чего вычисляем общее содержание ДНК в пробе как: C_DH=g·C_DS·(I_H-I_FH)/(I_DH-I_H) - где g=246 - разбавление анализируемой ДНК в 3-растворе, по сравнению с отобранной цельной кровью; а C_DS=3,3·10-6 М - концентрация стандартной ДНК в 3-растворе.

3) Добавляем к 1,05 мл 1-раствора 0,05 мл раствора, содержащего 200 мкг/мл EB в стандартном водном буфере. В результате, получаем раствор 4, для которого при длинах волн возбуждения и эмиссии 520 и 605 нм определяем интенсивность флуоресценции I_е. Затем, добавляем к 1,1 мл 4-раствора 0,02 мл раствора, содержащего 60 мкг/мл стандартной ДНК в стандартном водном буфере. В результате, получаем раствор 5, для которого при тех же длинах волн, что и ранее определяем интенсивность флуоресценции I_Dе. После чего вычисляем коэффициент структуризации: Ks=C_DE/C_DH (где C_DE=g·C_DS·[I_е-I_FE]/[I_Dе-I_е]) - изменение величины которого должно, в частности, отражать изменения в характере третичного и более высоких порядков организации структуры генома пробы (поскольку EB, как уже отмечалось, к ним существенно более специфичен, чем Ht).

4) При длинах волн возбуждения и эмиссии 350 и 605 нм определяем значение интенсивности флуоресценции 2-раствора I_FHе. Затем, добавляем к 1,12 мл 2-раствора 0,02 мл раствора, содержащего 200 мкг/мл EB в стандартном водном буфере. В результате, получаем раствор 6, интенсивность флуоресценции которого I_Hе определяем также, как и ранее. После чего вычисляем коэффициент эффективности переноса энергии: Kt=(I_HE-I_FHE)/C_DH - уменьшение величины которого должно, в частности, как показано на рис.2, в определенной мере отражать уменьшение длины теломерных участков генома… которые для позвоночных животных и человека представляют собой многократно повторяющиеся на концах молекул ДНК фрагменты вида: TTAGGG… число которых уменьшается при каждом делении клетки, вследствие неполной репликации ее ДНК, и соответственно является максимальным ограничителем возраста живого организма... выполняя также и некоторые другие, в частности регуляторные, функции [5,6].

Оценка генотоксических эффектов различных продуктов, препаратов и факторов окружающей среды

Базируясь на вышеизложенном нами были разработаны: метод оценки возможных генотоксических эффектов различных продуктов питания и лекарственных препаратов на живые организмы (в том числе при сочетанном действии на эти организмы других продуктов, препаратов или факторов окружающей среды, специфических для того или иного региона)… и метод оценки возможных генотоксических эффектов низких доз радиационных, химических, микробиологических и иных угнетающих факторов окружающей среды при сочетанном их действии на живые организмы. Эти методы основаны на том, что группе животных (например, крыс, жизненный цикл которых протекает примерно в 20 раз быстрее, чем у человека) вводят в течение определенного времени тем или иным способом анализируемый продукт или препарат (или подвергают оную группу воздействию того или иного угнетающего фактора)… в сочетании, при необходимости, с другими продуктами, препаратами и факторами окружающей среды. При этом у животных регулярно отбирают пробы крови. Затем, обрабатывают эти пробы специальной лизирующей смесью (состав смотри выше). После чего с помощью специального красителя (либо системы из нескольких красителей - таких например как Ht и EB) и флуориметра оценивают общее содержание и структуру генетического материала в пробе… нормируют их на количество лейкоцитов (поскольку эритроциты в нормальном состоянии в крови млекопитающих ДНК не содержат)… сравнивают с аналогичными величинами, определяемыми для контрольной группы животных (а также для всех животных, участвующих в анализе, до начала его проведения). И на основании этого сравнения делают вывод о наличии какого-либо генотоксического эффекта анализируемых продуктов или факторов на живые организмы.

Оценка микробной обсемененности жидких сред

Также был разработан новый метод для экспрессной оценки общей микробной обсемененности жидких сред (которая является одним из важных показателей при оценке качества воды и пищевых продуктов, мониторинге различных биотехнологических производств и т.д.). Стандартные методы, применяющиеся для этого в настоящее время (и включающие в себя: высевание анализируемого материала на питательную среду… инкубирование его затем при постоянной температуре, в стерильных условиях в течение от одних до нескольких суток… и последующий подсчет числа образовавшихся колоний микроорганизмов), требуют для своего проведения значительного времени и специализированных стационарных условий. А наш метод позволяет осуществлять подобный анализ практически в реальном режиме времени и непосредственно на тех местах, где пробы были отобраны, и заключается в следующем.

Отбираем во флуориметрическую кювету 1 мл пробы, добавляем туда 0,1 мл лизирующей смеси (состав ее см. выше), перемешиваем, выдерживаем в течение нескольких минут при t⁰=253⁰C (до установления стабильных показаний на флуориметре), после чего определяем фоновую интенсивность флуоресценции образца I_F1. Далее, к анализируемому образцу добавляем 0,1 мл раствора (фоновая интенсивность флуоресценции которого I_F2 определяется заранее), содержащего 10 мкг/мл Ht (или другого ДНК-специфичного флуорофора в иной концентрации) в стандатном водном буфере (состав его см. выше)… и также, как и ранее, определяем новую интенсивность флуоресценции I_D. Затем, к анализируемому образцу добавляем еще 0,02 мл стандартной ДНК (например, ДНК тимуса телёнка, растворенной в стандатном водном буфере в концентрации 60 мкг/мл)... и также, как и ранее, определяем новую интенсивность флуоресценции I_DS. После чего вычисляем общее количество микроорганизмов в пробе как: Cm=а₀+а₁(I_D-I_F1-I_F2)/(I_DS-I_D) - где эмпирические коэффициенты а₀ и а₁ определяются по данным калибровки с использованием стандартных образцов с уже известным содержанием в них микроорганизмов.

С использованием переносного микрофлуориметра ТКО-100 эта методика (на которую нами был получен патент [7]) позволила определять общее количество микроорганизмов в пробе начиная с 20 кл/мл, с погрешностью не более 30%, затрачивая не более 10 мин на одно измерение. Кроме того, в частности, если вместо лизирующей смеси при обработке клеток использовать какой-либо антибиотик, образующий канал только во внешних стенке и мембране клетки, то ДНК-специфичный флуорофор будет окрашивать, вероятно, лишь клетки прокариотов. А если вычесть полученные таким образом данные из общего количества микроорганизмов в пробе (определенного с помощью флуорофора на ДНК и лизирующей смеси как описано выше), то можно будет оценить также количество содержащихся в анализируемом образце эукариотов. А на производствах, осуществляемых в стационарных условиях, для регистрации окрашивания ДНК флуорофором можно использовать к тому же уже не переносной, а стационарный проточный цитофлуориметр - что позволит не только осуществлять оценку "микробной обсемененности" действительно в реальном режиме времени, но и существенно повысить чувствительность такой оценки.

Оценка индивидуальной радиочувствительности организма

И наконец, был разработан метод предварительной оценки индивидуальной радиочувствительности клеток крови человека и животных, основанный на том, что у пациента например до начала лучевой терапии отбирают пробу крови (достаточно 1 мл), разбавляют St-буфером и делят на две части, одну из которых затем облучают, а другую (контрольную) - нет... После чего каждый из вышеупомянутых образцов инкубируют в течение 3 часов при 37⁰С (для репарации первичных повреждений)… обрабатывают их лизирующей смесью… с помощью специального красителя (либо системы из нескольких красителей) и флуориметра оценивают общее содержание и структуру генетического материала в пробе… нормируют их на количество лейкоцитов... и, сравнивая полученные величины между собой, делают вывод о степени повреждающего воздействия, которое окажет вероятно лучевая терапия в выбранной дозе на данного, конкретного пациента.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Morgan A.R., Lee J.S., Pulleyblank D.E., Murray N.L,.Evans D.H. (1979) Nucl. Acids Res., 7, 547-571.

2. Pjura P.E., Grzeskowiuk K., Dickerson R.E. (1987) J. Mol. Biol., 197, 257-271.

3. Сибирцев В.С. (2005) Биохимия, 70 (4), 545-555.

4. Speiser S. (1996) Chem. Rev., 96, 1953-1976.

5. Микер А.К., Коффи Д.С. (1997) Биохимия, 62 (11), 1547-1557.

6. Блэкберн Е.Х. (1997) Биохимия, 62, 1400-1406.

7. Иванов С.Д., Сибирцев В.С. (1997) Способ определения микробиологической загрязненности воды. Российский патент №2079138, бюлл. №13.

Размещено на Allbest.ru

Рис.1. Схемы структуры ДНК и взаимодействия с ней интеркаляторов (ЕВ) и неинтеркаляторов (Ht). «hb» обозначает водородные связи между комплиментарными нуклеотидами 1-ой и 2-ой цепей ДНК.

Рис.2. Схема флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) между молекулами Ht и EB. Условные обозначения: I - интенсивность флуоресценции; hv₁ и hv₂ - кванты света, поглощаемый Ht и испускаемый EB, соответственно.

Размещено на Allbest.ru