Новые методы биотестирования и анализа ДНК с помощью флуорофоров

1

Размещено на http://www.allbest.ru/

Новые методы биотестирования и анализа ДНК с помощью флуорофоров

В.С. Сибирцев, А.В. Гарабаджиу

Описана новая схема анализа нуклеиновых кислот (НК), позволяющая с использованием системы из двух нуклеотид-специфичных флуорофоров со взаимодополняющими свойствами проводить оценку не только общего содержания ДНК в пробе, но и степени изменения структуры генома в клетках. Рассмотрен ряд новых методов, позволяющих с использованием вышеуказанной схемы анализа состояния генома «стандартных» биосистем быстро выявлять генотоксическое воздействие на живые организмы различных угнетающих факторов окружающей среды, продуктов питания, лекарственных и иных препаратов (в т.ч. при сочетанном их действии). Рассмотрены также новые методы, позволяющие по результатам анализа ДНК с помощью специфичных флуорофоров осуществлять быструю предварительную оценку индивидуальной радиочувствительности организма; а также экспрессную оценку микробной обсемененности жидких сред. флуорофор днк геном

Ключевые слова: биотестирование, ДНК анализ, флуорофоры на ДНК

В последнее время, в связи со все большими объемами производства и потребления различных фармакологических субстанций и биотехнологической продукции, а также увеличением общего уровня антропогенной нагрузки на окружающую среду - все более актуальной становится проблема быстрого выявления негативных свойств новых, а также генетически или иным способом модифицированных пищевых продуктов, биологически активных веществ, лекарственных и иных препаратов… причем не только при изолированном их действии на живой организм, но и в сочетании с другими продуктами, препаратами и факторами окружающей среды, специфическими для того или иного региона. Кроме того, нередко важна и сама по себе проблема достаточно быстрой и комплексной оценки степени экологического неблагополучия того или иного региона… причем даже в том случае, когда «стандартными» методами там не фиксируется превышение установленных норм ни по одному из возможных угнетающих факторов - однако в сочетанном виде они способны оказывать значимое повреждающее действие на людей и другие живые организмы.

Решение вышеупомянутых проблем может быть осуществлено разными способами. Но наиболее приемлемым и адекватным представляется использование для этой цели «стандартных» биосистем (таких например, как крысы) - достаточно адекватно моделирующих человеческий организм, но при том дешевых, доступных и имеющих сравнительно короткий жизненный цикл (что позволяет формировать на их основе статистически значимые выборки). Одним же из важнейших параметров, характеризующих состояние организма, являются изменения в структуре его генома (в отношении «степени суперспирализации ДНК», в частности, наблюдающиеся даже вследствие обычных суточных изменений физиологического и психологического состояния человека [1]) - которые весьма просто и экспрессно могут быть выявлены например с помощью синтетических низкомолекулярных флуорофоров, чувствительных даже к достаточно небольшим изменениям как в составе, так и в структуре внутриклеточной ДНК. Кроме того, нуклеотид-специфичные флуорофоры могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов, радиопротекторов, в исследовательских, диагностических целях и т.д.

В связи с вышесказанным, целью настоящей работы стало следующее. Во-первых, разработать с помощью ДНК-специфичных флуорофоров достаточно простой, быстрый и чувствительный метод оценки не только общего содержания НК, но и изменений в структуре генома клетки. Во-вторых, на основе применения вышеупомянутого метода к анализу генома «стандартных» биосистем разработать метод для быстрого выявления генотоксического воздействия на человеческий и другие живые организмы различных угнетающих факторов окружающей среды, продуктов питания, лекарственных и иных препаратов (в том числе, при сочетанном действии на эти организмы других продуктов, препаратов или факторов окружающей среды, специфических для того или иного региона). А также рассмотреть возможности применения синтетических низкомолекулярных ДНК-специфичных флуорофоров в других методах диагностики и мониторинга, основанных на количественном и качественном анализе клеточного генома.

1. Анализ ДНК с помощью системы из нескольких флуорофоров

При всем разнообразии вышеупомянутых потенциальных возможностей для использования флуорофоров, специфических к определенным участкам НК - спектр методов конкретного, практического применения таких соединений до сих пор еще далеко не так велик, как того бы хотелось. И связано это, в частности, с тем, что «сильное» избирательное связывание с субстратом, как правило, требует от лиганда одних структурных особенностей, а наличие пригодных для регистрации свойств - других.

Одним из лучших путей разрешения этого противоречия представляется, на первый взгляд, конструирование комплексных соединений, одна из частей которых, к примеру, отвечала бы за связывание с субстратом, а другая - за наличие спектральных или иных, пригодных для регистрации свойств. Кроме того, если конструируемое комплексное соединение состоит из нескольких субъединиц, способных специфически связываться с субстратом, то для него логично ожидать достаточно значительного увеличения (по сравнению с «мономерными» составляющими указанного соединения) как сродства к субстрату, так и специфичности по отношению к нему. Аналогично, если конструируемое комплексное соединение содержит несколько субъединиц, способных к примеру увеличивать свое свечение при сорбции на субстрате, то для него можно ожидать увеличения (по сравнению с вышеуказанными «мономерными» составляющими) чувствительности регистрации такого субстрата.

Однако, результат конструирования такого рода «комплексных» соединений далеко не всегда однозначно предсказуем - поскольку входящие в состав единой молекулы, жестко связанные между собой субъединицы способны не только взаимодополнять, но и мешать друг другу как стерически, так и в результате более «тонких» механизмов взаимодействия не только с субстратом, но и друг с другом [2].

Вследствие вышесказанного, более перспективным представляется использование для анализа НК систем, включающих в себя несколько нуклеотид-специфических флуорофоров - несвязанных между собой непосредственно, но имеющих согласованные комплексообразующие и спектральные свойства. В настоящей работе, в качестве примера одной из таких систем, были выбраны два таких широкораспространенных коммерческих нуклеотид-специфичных флуорофора, как этидий бромид (I) и Хехст-33258 (II).

Каждый из этих красителей при специфическом взаимодействии с полинуклеотидом увеличивает интенсивность своей флуоресценции в 10-20 раз. Но соединение I при этом является интеркалятором, прослаивающимся между двумя парами оснований двойной спирали полинуклеотида с некоторым предпочтением к его гуанин-цитозин (GC) богатым участкам, но в основном специфичным ко вторичному и более высоким порядкам организации молекулы ДНК. В то время как соединение II присоединяется к молекуле ДНК «снаружи» и предпочтительно специфично к участкам двойной спирали полинуклеотида, содержащим три последовательно расположенных аденино-тиминовых (АТ) и одну GC пары оснований.

А кроме того, при совместной сорбции на полинуклеотиде между молекулами этих красителей может происходить флуоресцентный резонансный перенос энергии. А именно, явление, когда при возбуждении флуоресценции молекул донора энергии (в нашем случае, Хехста) светиться начинают не только они, но и молекулы акцептора энергии (в нашем случае, этидия бромида), область длин волн флуоресцентной эмиссии которого в значительной мере пересекается с областью длин волн возбуждения флуоресценции донора (см. рис.1,2). Причем эффективность такого переноса энергии в весьма значительной степени будет зависеть от расстояния между молекулами донора и акцептора энергии [2].

Таким образом очевидно, что при совместном использовании вышеупомянутых ДНК-специфичных флуорофоров I и II можно оценивать не только общее количество ДНК в пробе, но и степень изменения структуры клеточного генома. При этом в качестве практического примера одной из возможных схем анализа генетического материала с помощью вышеупомянутых флуорофоров I и II можно предложить следующее.

1) К 0,1 мл пробы (в качестве которой может быть использована например цельная кровь) добавляем 1 мл лизирующей смеси (применяемой для того, чтобы нарушить целостность клеточных стенок, а также внешних клеточных и ядерных мембран - и таким образом обеспечить доступ красителя из «внешнеклеточного» раствора к внутриклеточной ДНК… состав оной смеси, а также упоминаемых ниже St-буфера, St-ДНК и т.д. - см. «Материалы и методы»), перемешиваем и выдерживаем 5 мин. Затем, к 0,05 мл полученного раствора добавляем 1 мл St-буфера. В результате, получаем раствор 1, для которого определяем значения фоновых интенсивностей флуоресценции: Iф_x (при длинах волн возбуждения и эмиссии 350 и 455 нм) и Iф_Е (при длинах волн возбуждения и эмиссии 520 и 605 нм).

2) Добавляя к 1,05 мл 1-го раствора 0,05 мл раствора, содержащего 10 мкг/мл флуорофора II в St-буфере, получаем раствор 2, для которого при длинах волн возбуждения и эмиссии 350 и 455 нм определяем интенсивность флуоресценции I_x. Далее, добавлением к 1,1 мл 2-го раствора 0,02 мл раствора, содержащего 60 мкг/мл St-ДНК в St-буфере, получаем раствор 3, интенсивность флуоресценции которого (I_дx) определяем также, как и ранее. После чего вычисляем собственно концентрацию ДНК в пробе:

C_дx=gC_сд(I_x-Iф_x)/(I_дx-I_x)

(где g=246 - разбавление ДНК в 3-ем растворе, по сравнению с отобранной цельной кровью; а C_сд=3,3х10-⁶ М - концентрация St-ДНК в 3-ем растворе).

3) Добавляя к 1,05 мл 1-го раствора 0,05 мл раствора, содержащего 200 мкг/мл флуорофора I в St-буфере, получаем раствор 4, для которого при длинах волн возбуждения и эмиссии 520 и 605 нм определяем интенсивность флуоресценции I_е. Далее, добавлением к 1,1 мл 4-го раствора 0,02 мл раствора, содержащего 60 мкг/мл St-ДНК в St-буфере, получаем раствор 5, интенсивность флуоресценции которого (I_де) определяем также, как и ранее. После чего вычисляем «коэффициент структуризации»:

Ks=C_де/C_дх (где C_де=gC_сд[I_е-Iф_е]/[I_де-I_е]),

изменение величины которого должно, в частности, отражать в определенной мере изменения в характере третичного и более высоких порядков организации структуры генома пробы (поскольку соединение I, как уже отмечалось, к ним существенно более специфично, чем соединение II).

4) При длинах волн возбуждения и эмиссии 350 и 605 нм определяем значение интенсивности флуоресценции 2-го раствора I_фxе. Затем, добавлением к 1,12 мл 2-го раствора 0,02 мл раствора, содержащего 200 мкг/мл флуорофора I в St-буфере, получаем раствор 6, интенсивность флуоресценции которого (I_хе) определяем также, как и ранее. После чего вычисляем «коэффициент эффективности переноса энергии»:

Ke=(I_XЕ-I_фxе)/C_дх,

уменьшение величины которого, может, в частности, как показано на рис.2, в определенной мере отражать даже уменьшение длины теломерных участков генома (которые для позвоночных животных и человека представляют собой многократно повторяющиеся на концах молекул ДНК фрагменты вида: TTAGGG - число которых уменьшается при каждом делении клетки, вследствие неполной репликации ее ДНК, и соответственно, является максимальным ограничителем возраста живого организма... выполняя, впрочем, и некоторые другие, в частности, регуляторные функции).

Вышеописанная схема анализа ДНК была опробована нами, в частности, на двух группах крыс (по 30 особей в каждой) со средним возрастом 2 месяца и 1,5 года. В результате, были получены достоверно (с веpоятностью 99%) различающиеся величины усредненных по этим группам параметров Ks и Ke - что вполне соответствовало нашим исходным предположениям… поскольку с возрастом (а процессы «старения» у крыс протекают, в целом, примерно в 20 раз быстрее, чем у человека) состояние генетического материала в клетках эукариотов и должно ухудшаться - в частности, за счет уменьшения длины теломерных участков генома и других изменений в структуре хромосомального нуклеопротеидного комплекса.

Кроме того, вышеприведенная схема анализа ДНК использовалась в методах выявления генотоксического воздействия на живые организмы различных продуктов питания, лекарственных препаратов, угнетающих факторов окружающей среды; а также в методах оценки индивидуальной радиочувствительности клеток крови человека - адекватность которых удостоверялась как описано ниже.

2. Выявление генотоксического воздействия на живые организмы

различных продуктов, препаратов и факторов окружающей среды

Затем, основываясь на вышеизложенной схеме анализа состояния генома «стандартных» биосистем (в качестве которых были выбраны крысы… поскольку, с одной стороны, они достаточно адекватно моделируют человеческий организм… а с другой - дешевы, доступны и имеют сравнительно короткий жизненный цикл - что позволяет формировать на их основе статистически значимые выборки), нами были разработаны новые методы для быстрого выявления генотоксического воздействия на человеческий и другие живые организмы различных продуктов питания, лекарственных и иных препаратов, а также радиационных, химических и иных угнетающих факторов окружающей среды - в том числе в низких дозах и при сочетанном их действии на живые организмы. Эти методы основаны на том, что группе животных вводят в течение определенного времени тем или иным способом анализируемый продукт или препарат (или подвергают оную группу воздействию того или иного угнетающего фактора) - в сочетании (при необходимости) с другими продуктами, препаратами и факторами окружающей среды. При этом у животных регулярно отбирают пробы крови, которые обрабатывают лизирующей смесью. После чего с помощью специального красителя (либо системы из нескольких красителей - таких например, как рассматривавшиеся выше соединения I и II) и флуориметра оценивают общее содержание и структуру генетического материала в пробе; нормируют их на количество лейкоцитов (поскольку эритроциты в нормальном состоянии в крови млекопитающих ДНК не содержат… также как и митохондрий, рибосом, внутриклеточных мембран) и сравнивают с аналогичными величинами, определяемыми для контрольной группы животных (а также для всех животных, участвующих в анализе, до начала его проведения).

Вышеописанные методы были апробированы нами, в частности, при оценке лечебного и профилактического действия циклоферона (индуктора интерферона) при лучевой терапии фибросаркомы [3], при анализе действия на живые организмы в условиях Петербурга и Ленинградской области продукции предприятия «Полюстрово» (по договору с этим предприятием) [4], а также при оценке экологического состояния ряда водоемов Ленинградской области. И полученные при этом результаты достоверно коррелировали, в частности, с наблюдаемым в дальнейшем снижением продолжительности жизни испытуемых животных; а также с результатами, полученными для тех же образцов методом учета нестабильных хромосомных аберраций в культивируемых лимфоцитах и другими цитологическими методами.

3. Оценка микробной обсемененности жидких сред

Кроме того, с использованием ДНК-специфичных флуорофоров нами был разработан новый метод для экспрессной оценки общей микробной обсемененности жидких сред (которая является одним из важных показателей при оценке санитарно-гигиенического состояния водоемов, мониторинге процесса очистки воды а также иных биотехнологических производств и т.д.). «Стандартные» методы, применяющиеся для этого в настоящее время (и включающие в себя: высевание анализируемого материала на питательную среду; инкубирование его затем при постоянной температуре в стерильных условиях в течение от одних до нескольких суток и последующий подсчет числа образовавшихся колоний микроорганизмов) требуют для своего проведения значительного времени и специализированных стационарных условий. Разработанный же нами метод позволяет проводить анализ практически в «реальном» режиме времени, непосредственно на месте отбора проб… и заключается в следующем.

Сначала, к отобранной во флуориметрическую кювету пробе (достаточно 1 мл) добавляем лизирующую смесь и определяем фоновую интенсивность флуоресценции образца I_Ф1 - также, как описано выше для «чистых» красителей и полинуклеотида. Затем, туда же добавляем раствор ДНК-специфичного флуорофора (такого например как коммерческий краситель DAPI - см. «Материалы и методы» - фоновая интенсивность флуоресценции которого I_Ф2 определяется заранее) и измеряем интенсивность флуоресценции I_Д, определяемую в наибольшей своей части взаимодействием добавленного к пробе красителя с содержащейся в ней ДНК (ставшей доступной для красителя вследствие добавления к пробе вышеупомянутой лизирующей смеси), а также в некоторой степени и другими компонентами микробных клеток. Далее, в качестве «внутреннего стандарта», добавляем туда же раствор с известной концентрацией St-ДНК в St-буфере и определяем получившуюся интенсивность флуоресценции I_сд, изменившуюся относительно I_Д вследствие взаимодействия содержащегося в пробе флуорофора помимо микробной ДНК также с известным добавленным количеством St-ДНК. После чего, вычисляем общее количество микроорганизмов в пробе как:

Cm = а₀ + а₁Х, где Х=(I_Д-I_Ф1-I_Ф2)/(I_СД-I_Д),

или в более широком диапазоне значений Cm как: Cm=а_iХⁱ, i=0N,

где коэффициенты а₀ (учитывающий «недоизмеренную» часть «фоновой» флуоресценции пробы с красителем) и а₁а_N (учитывающие взаимодействие флуорофора с St-ДНК, а также ДНК и другими компонентами микробных клеток, среднее содержание ДНК в микробных клетках в пробе и т.д.) определяются по данным калибровки, предварительно проводимой с использованием стандартных образцов с уже известным содержанием в них микроорганизмов (определяемым например по «стандартной высевной» методике).

С использованием переносного микрофлуориметра ТКО-100 данная методика позволила определять общее количество микроорганизмов в пробе начиная с 20 кл/мл, с погрешностью не более 30%, затрачивая не более 10 мин на одно измерение. При этом с 95% вероятностью подтвердилась гипотеза о том, что данные получаемые по представленной здесь методике принадлежат к той же генеральной совокупности, что и данные, получаемые для тех же образцов по «стандартной высевной» методике [5] (см. рис.3). На вышеописанную методику нами был получен патент [6], а дальнейшая ее разработка осуществлялась при финансовой поддержке гранта правительства Санкт-Петербурга PD03-1.3-40.

Так в частности, если вместо лизирующей смеси при обработке клеток использовать какой-либо антибиотик, образующий канал только во внешних стенке и мембране клетки, то ДНК-специфичный флуорофор будет окрашивать лишь клетки прокариотов (присутствие которых нежелательно к примеру при производстве пива). Если же вычесть полученные таким образом данные из общего количества микроорганизмов в пробе (определенного с помощью ДНК-специфичного флуорофора и лизирующей смеси - как описано выше), то можно будет оценить и количество содержащихся в анализируемом образце эукариотов (присутствие которых нежелательно к примеру при производстве кисломолочных продуктов). Кроме того, на производствах, осуществляемых в стационарных условиях (как например, очистка воды для населения и технических нужд, производство пива и т.д.), для регистрации окрашивания ДНК флуорофором можно использовать к примеру не переносной, а стационарный проточный цитофлуориметр - что позволит не только проводить оценку микробной обсемененности действительно в реальном режиме времени, но и существенно повысить чувствительность такой оценки. Однако, в каждом конкретном случае, когда микробиологическая чистота определяется не просто в воде, а в достаточно сложной многокомпонентной смеси, необходимо предварительно убедиться, можно ли пренебречь влиянием вышеупомянутых компонентов на свечение используемого флуорофора в отсутствие микроорганизмов (влияние «примесей» на характер взаимодействия флуорофора с ДНК учитывается введением «внутреннего стандарта»), и в случае отрицательного ответа - либо подобрать другой флуорофор, либо видоизменить методику измерения.

4. Оценка индивидуальной радиочувствительности организма

И наконец, используя ДНК-специфичные флуорофоры, мы разработали новый быстрый метод для предварительной оценки индивидуальной радиочувствительности клеток крови человека и животных. Этот метод основан на том, что у пациента например до начала лучевой терапии отбирают пробу крови (достаточно 1 мл), разбавляют St-буфером и делят на две части… одну из которых затем облучают, а другую (контрольную) - нет. После этого каждый из вышеупомянутых образцов инкубируют в течение 3 часов при 37⁰С (для репарации первичных повреждений ДНК) и обрабатывают лизирующей смесью. Затем, с помощью специального красителя (либо системы из нескольких красителей) и флуориметра оценивают общее содержание и структуру генетического материала в пробе… нормируют их на количество лейкоцитов… и, сравнивая полученные величины между собой, делают вывод о степени повреждающего воздействия, которое окажет вероятно лучевая терапия в выбранной дозе на данного конкретного пациента.

Описанный метод был апробирован нами, в частности, на более чем 50 пациентах Центрального научно-исследовательского рентгено-радиологического института - показав достоверную 95% корреляцию с результатами, полученными для тех же людей в тех же условиях методом учета нестабильных хромосомных аберраций в культивируемых лимфоцитах (одним из общепринятых для ранней идентификации облучения человека... но при этом существенно более материалоемком, трудоемком и продолжительном - 7 суток вместо 4 часов - чем предлагаемый здесь метод).

5. Материалы и методы

Флуорофоры: 2,7-диамино-10-этил-9-фенил-фенантридиниумбромид (ethi-dium bromide) (I), 2-[2-(4-гидроксифенил)бензимидазол-5(6)-ил]-5(6)-(4-метил-пиперазин-1-ил)бензимидазол (Hoechst-33258) (II) и 4',6-диамидино-2-фенил-индол (DAPI) (III) были получены от фирмы «Serva» (Германия). В качестве стандартного (St-) субстрата использовалась ДНК тимуса теленка, приготавливаемая путем растворения сухого препарата, полученного от фирмы «Serva», в дистиллированной воде и обрабатываемая затем ультразвуком на аппарате УЗДН-2 (Россия) в течение 15 с при силе тока 0,3 A на резонансной частоте 22 кГц (при этом средний размер одного фрагмента ДНК составлял 35000 Да). В качестве стандартного (St-) буфера - водный раствор, содержащий: 0,01М NaCl + 0,01M Na₂EDTA (этилендиаминотетраацетат натрия) + 0,01M Tris (2-амино-2-гидрокси-метил-1,3-пропандиол) с pH=7,4±0,1. А в качестве лизирующей смеси - водный раствор, содержащий: 2М NaCl + 0,1M Na₂EDTA + 0,01M Tris + 0,5% (по объему) Triton Х-100 (4-октил-(2,4,6,8,10-деканпентол)оксибензол) c pH=8,0±0,1.

Список литературы

1. Кованько Е.Г. Флуоресцентная характеристика изменений структуры ДНК клеток кроветворной системы облученных крыс: Дис. ... канд. биол. наук. С.Пб.: ЦНИРРИ, 2000. 166с.

2. Сибирцев В.С. (2005) Биохимия, 70, 545-555.

3. Иванов С.Д., Коваленко А.Л., Кованько Е.Г. и др. (1999) Вопросы онкологии, 45, 292-297.

4. Иванов С.Д., Кованько Е.Г., Ямшанов В.А., Сибирцев В.С. Влияние ионов металлов питьевых минеральных вод на биологические эффекты радиации. / Тез. докл. научн. конф. "Актуальные вопросы медицинской радиологии", С.-Пб., ЦНИРРИ, 1998. -С.370.

5. ГОСТ 18963-73 (1985) Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа, Издательство стандартов, М.

6. Иванов С.Д., Сибирцев В.С. (1997) Способ определения микробиологической загрязненности воды. Патент №2079138, бюлл. №13.

Размещено на Allbest.ru