Молекулярно-генетическая верификация уреазопозитивных микроорганизмов в метафилактике уролитиаза

Размещено на http://www.allbest.ru/

Молекулярно-генетическая верификация уреазопозитивных микроорганизмов в метафилактике уролитиаза

Севостьянова Мария Юрьевна

Аннотация

В статье рассказывается о исследовании, целью которого является разработка чувствительного и специфичного метода ДНК-диагностики маркерных инфекционных агентов (уреазопозитивных микроорганизмов) и создании на его основе тест-системы для прогнозирования течения и метафилактики мочекаменной болезни.

Ключевые слова: мочекаменная болезнь, уреазопозитивные микроорганизмы, метафилактика уролитиаза, ДНК-диагностика, тест-система.

Мочекаменная болезнь - болезнь обмена веществ, вызванная различными эндогенными и/или экзогенными причинами, которая нередко носит наследственный характер и определяется наличием камня в мочевыводящей системе больного [1].Распространенность мочекаменной болезни в популяции оценивается от 1% до 15% в зависимости от возраста, пола, расы и географического расположения[2].Основная опасность данного заболевания заключается в осложнениях, которые возникают вследствие обтурации мочевыводящих путей с последующим присоединением инфекции и развитием уретерогидронефроптоза. Также частое применение литотрипсии и других инвазивных методов лечения негативно сказываются на состоянии больных. Клинические рецидивы уролитиаза наблюдаются у 5-12% населения, что определяет социальную значимость заболевания и ставит задачи его метафилактики (профилактики повторных эпизодов)[3].

В последние годы рассматривается существенная роль локальных инфекцийуреазопозитивных микроорганизмов (Proteus mirabilis, Corynebacterium urealyticum, Ureaplasma urealyticum и др.) в возникновении аммоний- и кальций-фосфатных камней ("инфекционный уролитиаз"). Инвазивные и цитотоксические свойства патогенных штаммов данных бактерий приводят к повреждению слизистых поверхностей мочевыводящих путей, а продукция ими уреазы способствует защелачиванию мочи и образованию струвитных конкрементов[3].Ассоциация камнеобразования с микробной инфекцией достаточно известна, и за последние годы принято понятие "инфекционные камни" [4]. Этот термин относится к конкрементам, возникающим на фоне инфекций мочевого тракта, вызванных бактериями, продуцирующими уреазу. Инфекционные камни составляют от 5% до 15% всех камней[3, 5].В настоящее время отсутствуют эффективные методы прогнозирования рецидивов мочекаменной болезни, вызванных уреазопозитивными микроорганизмами. В этих ситуациях стандартные микробиологические методики часто дают отрицательный результат. Геноспецифическая ПЦР-диагностика является эффективным методом выявления и, в дальнейшем, количественной оценки инфицирования мочевых путей данными микробами.

Бактериальные инфекции мочевыделительной системы прижизненно констатируются традиционными культуральными методами существенно реже патоморфологического исследования. Роль активации условнопатогенных микроорганизмов в мочевыделительной системе при подавлении местного иммунитета остается предметом исследований, как при развитии заболеваний почек, так и с позиций системного воспалительного ответа. Целью исследования является разработать чувствительный и специфичный метод ДНК-диагностики маркерных инфекционных агентов и создать тест-систему для прогнозирования мочекаменной болезни. Данные молекулярно-генетических исследований на наличие Proteus mirabilis и Corynebacteriumurealyticum при мочекаменной болезни в сочетании с клиническими данными позволят определить роль уреазопозитивных микроорганизмов в патогенезе данного заболевания и их влияние на его развитие, прогрессирование и рецидивирование.

В настоящий момент изучена встречаемость 2 маркерных видов бактерий у 38 больных с мочекаменной болезнью, поскольку их уреазная активность приводит к сдвигу рН, способствующему кристаллизации оксалата кальция. Группа сравнения из 77 человек без уролитиаза была сопоставима по возрасту и гендерному составу. ДНК из мочи выделяли сорбентным методом. Генодиагностика микроорганизмов проводилась с помощью ПЦР ДНК, детекцию участков генов уреазы и hsp65 бактерий Proteus mirabilis и Corynebacterium urealyticum осуществляли методом геноспецифической ПЦР. инфекционный уролитиаз мочекаменный

В результате исследования патологическое кристаллообразование по интегральным биофизическим тестам (верификация криогеля мочи, диагностикум Литос-системой) достоверно верифицировало группу больных с мочекаменной болезнью от контрольной группы (р<0,001). ПЦР-позитивность мочевых осадков по Proteus mirabilis и Corynebacteriumurealyticum у больных мочекаменной болезнью коррелировала между собой (р<0,01). Частота встречаемости P. mirabilis у больных мочекаменной болезнью была существенно повышена по сравнению с группой контроля (21% и 2% соответственно, р=0,003). Выявляемость Corynebacteriumurealyticum была также существенно повышена у больных (особенно старших возрастов) по сравнению с группой контроля (44% и 2% соответственно, p<0,001). Показана связь ПЦР-позитивности по этим двум микробным видам и наличием признаков инфекции в мочевом синдроме: слизь, лейкоцитурия, протеинурия, общее число микробов в моче, р<0,0001). В отдельной группе из 15 больных мочекаменной болезнью в образцах мочи с применением обычной культуральной методики была выявлена лишь непатогенная микрофлора (S. epidermidis и др.), тогда как ПЦР-анализ показал наличие одного или 2 маркерных микробов в 50% образцов. Кроме того, при верификации уреазопозитивных микроорганизмов в мочевом тракте выявлены проявления системного воспалительного ответа (повышенный уровень СРБ - р<0,01) и хронического повреждения почек (снижение скорости клубочковой фильтрации и протеинурия. Таким образом, геноспецифический ПЦР-метод выявления инфицирования мочевых путей уреазопозитивными микроорганизмами является новым важным элементом этиопатогенетической диагностики для уролитиаза, хронической болезни почек и, следовательно, вторичной эндотелиальной дисфункции и прогрессирования кардиоренального континуума.

Сделан оригинальный вывод о роли уреазопозитивной флоры, которая не только защелачивает мочу, способствуя кристаллизации фосфатов, но и увеличивает ионную силу мочи, т.к. переводит нейтральную мочевину в ион аммония. Изучение биофизических характеристик белка Тамма-Хорсфалла методом динамического светорассеивания показало, что при этом происходит трансформация белка Тамма Хорсфалла из саногенетической, олигомерной формы золя с массой в 7млн Да в полимерную форму с массой в 28 млн Да с переходом в гель. Макромолекулярная частица становится центром кристаллизации и оксалатов и уратов. В совокупности так формируются комбинированные конкременты.

Список использованных источников

1. Глыбочко И.В.,Аляев Ю.Г. Практическая урология. Руководство для врачей. М.: Медфорум, 2012. - С. 352

2. Margaret S. Pearleand Yair Lotan. Urinary Lithiasis. Campbell-Walsh Urology, chapter 45, 1257-1286.e9

3. Чухловин 1А.Б., Эмануэль 1Ю.В., Напалкова 1О.В., Ланда 2С.Б., Эмануэль 1В.Л. Инфекционные факторы нарушения обмена веществ в развитии мочекаменной болезни.1Кафедра клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова, 2Петербургский институт ядерной физики, Санкт-Петербург, Россия. 2012.

4. Miano R, Germani S, Vespasiani G. Stones and urinary tract infections. Urol Int 2007;79 [Suppl 1]:32-36

5. David A. Bushinsky and Rebeca D. Monk.Nephrolithiasis and Nephrocalcinosis. Comprehensive Clinical Nephrology, Chapter 59, 688-702.

Размещено на Allbest.ru