Метаболическая активность дендритных клеток при их взаимодействии с хантавирусом

Размещено на http://www.allbest.ru/

Метаболическая активность дендритных клеток при их взаимодействии с хантавирусом

Для формирования полноценного иммунного ответа, в том числе и противоинфекционного, необходимо наличие антигенпредставляющих клеток, среди которых наиболее важными являются дендритные клетки (ДК). Их морфология, фенотип и функции претерпевают значительные изменения в процессе дифференцировки гемопоэтических CD34⁺ клеток-предшественников из костного мозга. На первом этапе незрелые ДК циркулируют в крови, где приобретают способность к захвату и процессингу антигенов. В дальнейшем ДК мигрируют в органы, где впоследствии индуцируется их антигенпредставляющая функция, что определяет их ключевую роль в развитии иммунных реакций организма [1, 2].

M.J. Raftery с соавторами [3] обнаружили, что хантавирус способен проникать и размножаться в ДК, полученных из моноцитарных дериватов пуповинной и периферической крови человека. Причем эти ДК обладали способностью стимулировать пролиферацию Т-лимфоцитов в той же степени, что и ДК после TNF-б-опосредованного созревания [4]. Сообщалось, что антиген хантавируса может локализоваться в фолликулярных ДК селезенки и лимфатических узлов [5].

Цель работы: исследование метаболической активности дендритных клеток при их взаимодействии с хантавирусом.

Материалы и методы

В качестве инфекционного агента использовался штамм Аа 60343 (ПМ-79-95) геноварианта Far East вируса Hantaan из Семейства Bunyaviridae род Hantavirus из рабочей коллекции лаборатории хантавирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова. В экспериментах использовали супернатантную вируссодержащую жидкость, включавшую не менее 5 инфекционных единиц на клетку, исходя из посадочной концентрации клеток и величины титра (2,5 lg фокус-формирующих единиц/мл) вируса, используемого для заражения [6].

Первичную культуру недифференцированных клеток миелоидного пула получали по методу M.В. Lutz с соавторами [7] из костного мозга бедренной кости морских свинок путем промывания костномозгового канала средой RPMI-1640 (БиолоТ). Костный мозг гомогенизировали в среде RPMI-1640 (БиолоТ), трижды промывали с центрифугированием (1000 об/мин) и переносили в обогащенную среду культивирования. Конечная концентрация клеток составила 2х10⁶ в 1 мл среды RPMI-1640, содержащей 0,1 мг/мл гентамицина-К (KRKA) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (БиолоТ). Клеточную суспензию разносили в плоскодонные 96-луночные микропланшеты по 100 мкл на лунку, затем инкубировали 3 ч в СО₂-инкубаторе при 37^оС. После чего удаляли неадгезированные клетки путем промывания средой RPMI-1640.

Для индукции созревания дендритных клеток (ДК), к суспензии клеток костного мозга добавляли 80 нг/мл GM-CSF (Sigma) и 20 нг/мл IL-4 (Sigma). На третьи сутки проводили повторную цитокиновую стимуляцию. На шестые сутки инкубации производили смену среды и добавляли следующие индукторы созревания: 1) вирус Hantaan не менее 5 инфекционных единиц на клетку (1 ч контакта, затем отмывали от неадгезированных вирусных частиц); 2) TNF-б (Sigma); 3) 20 нг/мл IL-4 (Sigma). На девятые сутки монослой ДК использовали в экспериментальных целях. Качество культуры оценивалось методом прижизненного наблюдения клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии [8].

Время контакта первичной культуры ДК с вируссодержащей жидкостью составило 60 мин. Для удаления внеклеточных вирусных частиц монослой клеток дважды промывали средой RPMI-1640 (БиолоТ), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (БиолоТ), 0,1 мг/мл гентамицина-К (KRKA). Затем продолжали инкубацию в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 18, 24, 48, 72, 96 ч.

Определяли активность АТФазы, 5`-нуклеотидазы, сукцинатдегидрогеназы (СДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), миелопероксидазы (МПО) и цитохромоксидазы (ЦХО) на спектрофотометре при внесении соответствующих для каждого из ферментов субстратов. Результаты спектрофотометрического анализа активности ферментов выражали в виде унифицированного показателя - индекса стимуляции (Т), в процентах, который вычисляли по формуле: Т = (No - Nk)/ Nk х 100; где Nk - средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в нестимулированных ДК; No - средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в стимулированных ДК.

Результаты и обсуждение

В рамках настоящей работы установлены особенности влияния хантавируса на процесс дифференцировки ДК, полученных из костного мозга морских свинок. С помощью нМФА установлено, что при заражении хантавирусом ДК в начальной стадии дифференцировки без внесения индуктора, количество антигенсодержащих клеток составило 6±0,4%, тогда как в популяции клеток, после воздействия индуктора созревания TNF-б, это количество составило 25±0,2%. Наибольший процент антигенсодержащих ДК наблюдался в популяции, инфицированных хантавирусом (рис. 1). При этом через 3 суток после заражения вирусом, специфический антиген выявлялся как на поверхности ДК, так и в дендритных отростках.

Рис. 1. Дендритные клетки, индуцированные хантавирусом. а) антигенсодержащие клетки через 1 ч после заражения хантавирусом, внутриклеточное свечение в виде глыбок; б) 2 сут после заражения. Непрямой МФА, ЛСКМ, увеличение х 800

При изучении ферментативной активности популяций ДК, дифференцированных под влиянием различных индукторов, а затем зараженных хантавирусом, была выявлена наибольшая стимуляция клеток, дифференцированных под влиянием вируса. Также, в этих клетках наблюдалась активация сукцинатдегидрогеназной кислородобразующей системы, тогда как в ДК без воздействия индуктора и после внесения TNF-б, обнаруживалась активность лактатдегидрогеназы (рис. 2).

Рис. 2. Активность ферментов кислородзависимого метаболизма дендритных клеток, инфицированных хантавирусом. а) ЛДГ; б) СДГ; в) ЦХО. А - незрелые дендритные клетки; Б - дендритные клетки, индуцированные TNF-б; В - дендритные клетки, индуцированные хантавирусом.

Из литературы известно, что неспецифические эстеразы экспрессируются только в незрелых предшественниках ДК [1]. Нами определено повышение активности неспецифической эстеразы в ДК в ответ на внесение хантавируса. Так, в популяции клеток, индуцированной хантавирусом, активация данного фермента наблюдалась через 24 ч, тогда как в ДК без внесения индуктора- через 48 ч после заражения. В то же время в популяции, индуцированной TNF-б, активация фермента не выявлялась. Эти данные указывают на участие фермента неспецифической эстеразы в процессе дифференцировки клеток по пути, отличному от процесса, наблюдаемого в ДК под влиянием индуктора TNF-б.

В литературе нами не обнаружено работ по исследованию нитроксидобразующей активности ДК, инфицированных вирусом. На начальных сроках после заражения хантавирусом в популяции недифференцированных и индуцированных вирусом ДК установлена внутриклеточная продукция нитритов, с последующим выделением их во внеклеточное пространство. В ДК, предварительно индуцированных TNF-б, внутриклеточная продукция нитритов не выявлялась, что объяснялось деградацией культуры вследствие цитотоксического действия хантавируса.

Итак, исследования последних лет показали существенную значимость факторов врожденного иммунитета в гомеостазе организма, при формировании его ответа на воздействие патогенов. Основой врожденного иммунитета являются процессы воспаления и фагоцитоза и его факторы обладают генетическими неклональными механизмами распознавания и элиминации патогенов. Эти свойства определяют важнейшую инициирующую и регулирующую роль клеточных факторов врожденной защиты организма в развитии специфических иммунных реакций при вирусных инфекциях. Наряду с вышеизложенным, необходимо отметить, что на настоящий момент неоправданно мало внимания уделяется исследователями проблеме изучения процессов, связанных с функциональными изменениями, происходящими в инфицированных вирусами клетках.

Анализируя результаты нашего исследования, можно сделать вывод, что хантавирус индуцирует созревание ДК в большей степени, чем TNF-б, на что указывали показатели метаболической активности клеток. Различие в показателях функционального состояния ДК было наиболее демонстративным на 9-е сутки инкубирования с индукторами созревания. При этом хантавирус не оказывал активирующего эффекта на ДК без предварительного внесения индуктора, тогда как в отношении клеток, предварительно прошедших дифференцировку под его влиянием, отмечалось его выраженное воздействие на активность кислородзависимой и нитроксидобразующей систем.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Работа поддержана научным проектом (0545-2014-0011) ФАНО.

Литература

дендритный клетка хантавирус

1. Прокопович С.К., Виницкий В.Б. Дендритные клетки и перспективы их использования в иммунотерапии злокачественных новообразований // Онкология. 2001; 3(2-3): 126-131.

2. Алексеенко О.И., Храновская Н.Н., Болгова Л.С., Гриневич Ю.А. Цитоморфологические особенности дендритных клеток // Цитология и генетика. 2006; 40(1): 66-69.

3. Raftery M.J., Kraus A.A., Ulrich R., Kruger D.H., Schonrich G. Hantavirus Infection of Dendritic Cells. J. of Virology. 2002; 76(21): 10724-10733.

4. Lui G., Manches O., Angel J., Molens J.P., Chaperot L., Plumas J. Plasmacytoid Dendritic Cells Capture and Cross-Present Viral Antigens from Influenza-Virus Exposed Cells. PLoS ONE. 2009; 4: e7111.

5. Zaki S.R., Greer P.W., Cof?eld L.M., Goldsmith C.S., Nolte K.B., Foucar K., Feddersen R.M, Zumwalt R.E., Miller G.L., Khan A.S. Hantavirus pulmonary syndrome. Pathogenesis of an emerging infectious disease. Am. J. Pathol. 1995; 146: 552-579.

6. Плехова Н.Г., Сомова Л.М. Роль моноцитов/макрофагов в патогенезе вирусных инфекций. Тихоокеан. мед. журн. 2010; 3: 5-9.

7. Lutz M.В. Kukutsch N., Ogilvie A.L., Rцssner S., Koch F., Romani N., Schuler G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 1999; 223: 77-92.

8. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир; 1983; - 264 с.

Размещено на Allbest.ru