Использование новых технологий диагностики для выявления наследственных болезней обмена

Размещено на http://www.allbest.ru/

Тюменский Государственный Медицинский Университет

Пед. фак., группа 240, г. Тюмень, Россия.

Использование новых технологий диагностики для выявления наследственных болезней обмена

Автор статьи: Осипова Анна Андреевна,

Наследственные болезни обмена (НБО) - одна из наиболее многочисленных и хорошо изученных групп моногенных болезней человека. Клинические проявления большинства наследственных болезней обмена обусловлены выпадением каталитической функции ферментов, участвующих в утилизации и транспорте субстратов или выполняющих роль клеточных рецепторов. наследственный болезнь диагностика спектрометрический

Применение новых технологий диагностики для раннего выявления наследственности наследственных болезней обмена показало их значительные преимущества и целесообразность использования в неонатальном скрининге.

Неонатальный скрининг как комплекс мероприятий вторичной про-филактике НБО широко распространен в общественном здравоохранении на международном уровне. Они направлены на раннее выявление тяжелых наследственных заболеваний у новорожденных с целью своевременного обеспечения лечебно-профилактических вмешательств для предотвращения и/или снижения осложнений, улучшения качества жизни и социальной адаптивности.

Высокая диагностическая чувствительность, как правило, превосходит специфичность диагностического метода, приводит к увеличению количества ложноположительных результатов. Данная проблема решается только путем применения новых высокоспецифичных технологий, либо совместное использование первичных скрининговых методов с тестами «второго уровня», подтверждающих первичные полученные результаты. Так, появление метода тандемной масс-спектрометрии (ТМС) расширило количество скринируемых заболеваний благодаря его чувствительности, специфичности, высокой пропускной способности и возможности одновременного мониторинга десятков аналитов. Применение ТМС показало, что «узким местом» скрининга остаются ложноположительные и неоднозначные результаты. Анализ полученных данных показал, что указанная проблема обусловлена недостаточностью специфичностью самих исследуемых маркеров. Было установлено, что их уровень может повышаться при других заболеваниях и варьировать от менструального возраста и веса при рождении ребенка, питания приема лекарственного препарата и т.д.

Внедрение новых хромато-масс-спектрометрических (ХМС) технологий ( газовая и жидкостная ) дает возможность определения более специфичных маркеров, которые могут подтвердить предполагаемый диагноз. К тому же, перечисленные технологии позволяют заподозрить определенный наследственный метаболический дефект у пациента и расширяют спектр определяемых маркеров. Но, кроме совершенствования лабораторных техно-логий, сохраняется необходимость проведения подтверждающей молекулярно-генетической диагностики.

Стремительный технологический прогресс в области молекулярно- генетических методов способствовал внедрению в диагностику генетически - детерминированных заболевании таких инновационных методов как высоко-производительное секвенирование следующего поколения, в отличие от секвенирования по Сэнгеру, позволяет осуществлять массовое параллельное прочтение большого количества фрагментов ДНК одновременно и установить последовательность всех экзонов или всего генома.

Так, с целью повышения эффективности неонатального скрининга, с апреля 2015 года, впервые в РФ в боиохимической лаборатории медико-генетическогo центра, был запущен пилотный проект по внедрению в алгоритм обследования по трем нозологиям муковисцидоз, фенилкетонурия, галактоземия, метода высокопроизводительного секвенирования. В данной статье приведены первые результаты данного исследования.

Материалы и методы

Исследование проводилось по результатам скринингового обследования указанных заболеваний в выборке 167189 новорожденных, родившихся в период с января 2015 по май 2017 года . По результатам ретеста было сформировано 3 группы новорожденных:

1 ) с повышенными значениями иммунореактивногo трипсиногена (123);

2 ) с повышенными значениями фенилаланина , (51);

3 ) с повышенными значениями общей галактозы , (157);

Всем новорожденным из указанных групп (331) проводилось молекулярно-генетическое тестирование соответствующих генов молеку-лярно-генетическое тестирование осуществлялось с помощью тест - системы Vari Find Neoscreen assay ( ParseqLab , Россия ) методом высокопризводительного секвенирования ( NGS ). Данная тест система основана на платформе Ion PGM ( LifeTechnologies , США ) и позволяет идентифицировать 442 мутации в гене муковисцидоза, 99 мутации в гене фенилкетонурии, 50 мутаций в гене галактоземии, а также выявлять ранее неизвестные мутации в кодирующих и клинически значимых регионах . Образцы ДНК были выделены из сухих пятен крови с использованием набора Pu- reLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen/Life Techno- loges , США ) в соответствии с инструкцией производителя.

Данные об окончательном диагнозе обследуемых пациентов были получены из заключения врача - генетика.

Результаты

Муковисцидоз

Среди 123 обследуемых с повышенными результатами ретеста на муко-висцидоз (ИРТ>70 нг/мл) 2 патогенных аллеля были идентифицированы у 18,7% пациентов (23 из 123). Носителями одной патогенной мутации оказались 32,5% пациентов, а в 48,7% (60 из 123) случаях клинически значимых мутаций обнаружено не было. Было установлено, что 70% (42 из 60) детей с повышенным уровнем ретеста иммунореактивногo трипсиногена в момент проведения скрининга находились в стационаре п поводу других заболеваний ( гипербилирубинемия, инфекционные заболевания, врожденные пороки сердца). Диагноз муковисцидоз установлен в 96% случаев выявления 2 патогенных мутаций (22 из 23). По данным клинических и лабароторно-инструментальных методов обследования на момент осмотра врачом-генетиком диагноз муковисцидоз подтвержден не был. Таким оброзом процент ложноположительных результатов при тестировании по стандартному алгоритму с использванием ретеста составил 82% а при тестировании по предложенному алгоритму 0,04%.

Фенилкетонурия

По результатом секвенирования гена фенилкетонрии в крови были обобнаружены 2 патогенные мутации. В 11,5% выявлен только один патогенный аллель и в стольких же случаях мутаций обнаружено не было. В гомозиготном состоянии мутация встречалась в 25,6% случаев, в 43,6% была в компаунде с другими мутациями. В остальных 25,6 выявлены другие генотипы, которые провоцировали гиперфенилаланинемию, не требующую специального лечения. Примечательно, что из 78 обнаруженных аллелей всего 11 (14,1 %) являются наиболее частыми и входят в панель, используемую для рутинной ДНК - диатностики . В то время как 67 аллелей ( 85 % ) удалось обнаружить только с применением расширенного секвенирования гена. Также необходимо отметить, то в 33,3% случаев (2 из 6) у пациентов, у которых выявлен только один патогенный аллель установлен диагноз фенилкетонурия. В связи с ограничениями метода NGS (невозможность обнаружения крупных делеции / инсерций ) образцы крови данных пациентов направлены в ФГБНУ «Медико-генетический научный центр» для проведения дополнительных исследовании гена фенилкетонурии. В процессе проведения скрининга классической ФКУ с использованием только биохимических методов и в комплексе с ДНК-диагностики процент ложноположительных результатов составил 47 % ( 28 51 ) и 31 % ( 12 из 39 ) соответственно.

Галактоземия

Для проведения молекулярно-генетического исследования на основе NGS было отобрано 157 новорожденных с положительными результатами неонатального скрининга на галактоземию (ГАО>390 мкмоль/л (7,03 нг/дл)). В результате анализа у трех пациентов (19,1% обследованных) выявлена мутация в сочетании с патогенными аллелями. В 31 (19,7%) образце выявлен вариант Дуарте: в 6 (3,8%) - в гомозиготном состоянии в сочетании с нормальным аллелем с патогенными аллелями. Клинический фенотип пациентов с генотипами соответствовал классической галактоземии. У третьего пациента результат ретестового исследования общей галактозы в крови составил 1492мкмоль/л (27нг/дл), активность фермента галактозо-1-фосфатуридилтрансферазу. Также проводилось тестирование родителей, которое подтвердило транс-положение обнаруженных мутаций. При осмотре врачом-генетиком данных за галактоземию не было. В связи с тем, что уровень общей галактозы может повышаться при различных состояниях, а также в случае носительства заболевания скрининг выявил, 98% ложноположительных результатов.

Анализ полученных результатов проведенного исследования показал уменьшение количества ложноположительных результатов, что свидетельствует о превосходстве диагностической информативности алгоритмов скрининга, с применением тестирования ДНК в качестве подтверждающей диагностики скрининга. Генетическая информация, полученная на примере ФКУ, продемонстрировала возможность NGS потенциально выявлять «мягкие» мутации, лежашие в основе доброкачественной гиперфенилаланинемии, не требующей лечения , что является важным для дифференциальной диагностики . По мимо всего прочего, важным фактором, уменьшающим психологическое воздействие на родителей, является отсутствие необходимости повторно вызова и забора венозной крови у детей , так как количество ДНК для проведения TNGS достаточно при выделении из сухих пятен крови, предназначенных для неонатального скрининга.

Заключение

Программы неонатального скрининга разрабатывались для ранней экономически эффективной диагностики заболеваний, для которых принципиально необходимо раннее медицинское вмешательство для профилактики тяжелых последствий и отдаленных осложнений . С момента внедрения первого скринингового теста на ФКУ были достигнуты значительные успехи в этой области. Важными характеристиками скрининговогых методов являются аналитическая специфичность и чувствительность вкупе с высокой пропускной способностью и своевременным получением результатов . отклоняющихся от нормы . Несмотря на то, что в настоящее время доступны такие высокоточные и сверхчувствительные методы как ТМС, ВЭЖХ, ГХ-МС. Для уменьшения неоднозначности в диагностике генетически де- терминированных заболеваний целесообразно применять более определенные тесты, например такие, как ферментативные или молекулярно-генетические исследования. Внедрение технологий секвенирования следующего поколения в неонатальный скрининг позволяет модернизировать подтверждающую диагностику тестируемых заболеваний, что способствует улучшению качества оказания медицинской помощи.

Список литературы

1) Чурюмова Ю.А., Вохмянина Н.В. Использование новых технологий диагностики для выявления наследственных болезней обмена.Медицинская генетика. 2017;16(10):18-22.

2) Клиническая генетика : учебник / Н. П. Бочков, В. П. Пузырев,С. А. Смирнихина ; под ред. Н. П. Бочкова. - 4-е изд., доп. и перераб. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2015. - 592 с. : ил. ISBN 978-5-9704-3570-0.

Размещено на Allbest.ru