Использование клеточных культур гепатоцитов для исследования метаболизма лекарственных соединений в печени человека

Комплексное изучение действия на клетки печени человека веществ и лекарственных препаратов. Первичные культуры гепатоцитов. Воспроизведение основных биохимических функций паренхимы печени. Оценка действия лекарственных средств на клетки in vitro.

Рубрика Медицина
Вид статья
Язык русский
Дата добавления 19.02.2019
Размер файла 21,3 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

2

Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

«Волгоградский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Направление подготовки «Биология», Россия, г. Волгоград

Использование клеточных культур гепатоцитов для исследования метаболизма лекарственных соединений в печени человека

Прокопченко И.С.

Казакова М.С.

Кубышкина Д.В.

Доля разрабатываемых лекарственных веществ, прошедших стадии клинических испытаний и дошедших до регистрации в качестве лекарственных средств, крайне мала, что обусловлено рядом недостатков присущих методам доклинических исследований. Причиной сложившейся ситуации явилась низкая эффективность методов выявления побочных эффектов в доклиническую стадию испытаний [1]. Все усилия, направленные на увеличение эффективности доклинических испытаний, привели к изменению методов по определению побочных эффектов лекарственных веществ: во время проведения фармакологических исследований для отбора оптимальных биологических моделей были внедрены сравнительные исследования на культурах клеток человека и лабораторных животных, позволяющие проводить экстраполяцию наблюдаемых эффектов тестируемых соединений на человека не только на основе данных, полученных в экспериментах на животных, но и в тестах, выполненных на клеточных культурах [2,3].

Центральный метаболизм большинства лекарственных препаратов, существующих на сегодняшний день, осуществляется в печени. Лекарственный метаболизм происходит в паренхиматозных клетках печени - гепатоцитах. На поверхности гепатоцитов находятся рецепторы и белки транспортёры лекарственных веществ. В микросомах гепатоцитов содержатся главные ферменты лекарственного метаболизма: цитохромы Р450, уридинглютатионтрансферазы (UGT), некоторые глютатион-S-трансферазы (GST)., флавин содержащие монооксигеназы (FMO).

В цитозолегепатоцитов растворены такие ферменты как сульфотрансферазы (SULT), N-ацетил трансферазы (NAT), некоторые GST, альдегид оксидазы (AO), ксантин оксидазы(XO). Митохондриальная мембрана гепатоцитов содержит моноамин оксидазы (MAO) [4]. Непаренхиматозные клетки печени, к которым относят синусоидальные клетки печени, биллиарные эпиталиальные клетки, клетки Купффера, стеллатовые клетки, а также макрофаги, нейтрофилы и натуральные киллеры крови приобретают большое значение при гепатотоксическом повреждении ткани печени, но при лекарственном метаболизме выполняют второстепенную, специфичную для каждого типа клеток задачу. Оптимальный режим жизнедеятельность клеток печени обеспечивает сложно-организованная структура паренхимы печени. Структурный каркас паренхимы печени сплетён главным образом из волокон фибронектина, коллагена, фибриллин/эластина. Важно отметить, что вне структуры печени гепатоциты быстро теряют свои свойства, происходит процесс, так называемой дедифференциации, который запускается приразрушения межклеточных контактов гепатоцитов в ходе выделения из ткани печени.

Исследования метаболизма лекарственных веществ (ЛВ) на клеточном уровне проводят на срезах печёночной ткани, культуре первично выделенных гепатоцитов, перевиваемых культурах клеток опухолевого и неопухолевого происхождения и гепатоцитах из плюрипотентных и стволовых клеток. Гистологические срезы и первичные гепатоциты получают из материала операционных вмешательств на печени. Различные линии перевиваемых клеток опухолевого происхождения выделены из гепатом человека.

Методами генной инженерии получают перевиваемые культуры гепатоцитов неопухолевого происхождения [5]. Толщина срезов (250-100 мкм) печеночной ткани ограничена доступностью питательных веществ и кислорода, для клеток внутри среза. Данная толщина среза не сохраняет минимальную структурную единицу печени - лобулу, размер которой 2 мм, но сохраняет 3-х мерный матрикс печеночной паренхимы.

Гепатоциты печёночного среза, размещённые в 3-х мерном матриксе паренхимы, длительно сохраняют активность ферментов и транспортных белков лекарственного обмена веществ, но теряют различия в спектре метаболических и анаболических функций вдоль оси лобулы [6]. После криоконсервации печёночный срез не сохраняет своих первоначальных свойств из-за разрушения межклеточных контактов гепатоцитов. Исследования динамики деградации гепатоцитов, выделенных коллагеназным методом и культивируемых в монослое на коллагене в срок до 168 часов показали, что до 24 часов экспрессия изоформ белков цитохрома Р450 существенно не изменяется. Межиндивидуальные различия гепатоцитов определяются генетическими особенностями донора гепатоцитов и внешними факторами, такими как: питание, болезни, приём лекарств, вредные привычки, пол и т.д. [7]. Деградация и межиндивидуальные различия выделенных гепатоцитов человека ограничивают экстраполяцию данных исследований метаболизма лекарственных веществ. Межиндивидуальное различие считается непреодолимым недостатком при использовании среза печёночной ткани, но преодолим при работе на культуре свежевыделенных гепатоцитов человека путём сливания культур от разных доноров в один мультидонорный пул. Деградация замедляется при размещении культуры гепатоцитов в каркасе, имитирующем структуру и состав печёночной паренхимы, а также добавлением в питательную среду нужного количества ингибиторов деградации. Доказано, что наиболее точным аналогом печеночной ткани при исследованиях метаболизма лекарственных веществ на клеточном уровне является мультидонорная культура свежевыделенных или криоконсервированных гепатоцитов человека.

Перевиваемые линии гепатоцитов человека, которые обладают рядом преимуществ, таких как доступность и стандартность являются отличной альтернативой культуре первичных гепатоцитов человека. Большинство исследователей полагают, что наиболее подходящей моделью для исследования метаболизма лекарственных веществ является линия гепатомы человека. Было проведено сравнительное исследование метаболизма лекарственных веществ в культуре свежевыделенных гепатоцитов человека, культуре гепатоцитов человека после криоконсервации и линии HepaRG после криоконсервации и показано, что различия в уровне экспрессии мРНКизоформцитохрома Р450 и уридинглютатионтрансферазы (UGT) определяли различие временного профиля метаболитов тестовых лекарственных соединений между культурами свежевыделенных и размороженных гепатоцитов человека с одной стороны и культурой Hepa RG с другой.

Резко снижается в течение суток уровень экспрессии изоферментов цитохрома Р450 и UGT в суспензии свежих гепатоцитов, но сохраняется на приемлемом уровне в течение недели в 3-х мерной культуре. Активность ферментов лекарственного метаболизма сохраняется в культуре HepaRG в течение недели вне зависимости от способа культивирования.

Качественные и количественные различия, существующие в ферментах лекарственного метаболизма у лабораторных животных и человека обуславливают несовпадение метаболических путей биотрансформации лекарственного вещества в печени, которое является причиной видоспецифичной реакции организмов на то или иное ЛВ. Масштабные исследования причин видоспецифичности биотрансформации ЛВ стали возможными после полного секвенирования генома человека и описания большинства белков протеома человеческой клетки. Были проведены геном-масштабные реконструкции метаболической сети человеческой клетки, исходя из накопленной информации о продуктах нескольких тысячей генов, которые, в свою очередь, послужили отправной точкой для создания геном-масштабных реконструкций метаболической сети крысы и мыши. Таким образом была реконструирована геном-масштабная модель метаболической сети крысы (Rattusnorvegicus), включающая 2324 гена и 8268 реакции, и был проведён её сравнительный анализ с геном-масштабной моделью метаболической сети человека, включающей 2315 гена и 8263 реакции. В результате обширного сравнительного анализа большинство метаболических подсистем показали нулевое видоспецифическое различие. Однако и было показано, что видоспецифичность некоторых ферментов лекарственного метаболизма является причиной, которая не всегда позволяет использовать в качестве животной модели крысу.

При исследованиях метаболизма ЛВ также используются первично выделенные гепатоциты крысы, в частности, чтобы сравнить соотношение доза-эффект (в отношении метаболических потоков лекарственного метаболизма) на уровне клетки, с соотношением доза-эффект на уровне организма. Изменение метаболических потоков лекарственного метаболизма определяют по изменению уровня экспрессии мРНК и белков или по концентрации лекарственных метаболитов в гепатоцитах, из клеточной культуры после экспозиции определённой дозы ЛВ, и гепатоцитах, выделенных из печени после введения крысе определённой дозы ЛВ. Разница в соотношении доза-эффект между гепатоцитом из культуры и гепатоцитом из печени показывает, в какой степени в биотрансформации ЛВ в организме крысы, помимо метаболизма ЛВ в гепатоцитах, задействованы другие факторы, такие как среда желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), способность всасывания из ЖКТ в кровь, взаимодействие с белками и клетками крови, характер распределения по органам и тканям, выделение почками и лёгкими и др. Определение разницы в соотношениях дозаэффект для культуральных гепатоцитов человека и крысы, и гепатоцитов из ткани печени крысы делает возможным правильный подбор дозировок ЛВ для дальнейших более развёрнутых исследований на животных моделях. Данные, полученные при исследовании метаболизма ЛВ на клеточных культурах гепатоцитов, имеют определяющее значение при экстраполяции на организм человека, путём создания многоуровневых компьютерных моделей метаболизма лекарственных веществ на уровне организма человека.

Список литературы

гепатоцит паренхима печень лекарственный

1. Kola, I. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?/ Ismail Kola and John Landis// Nature Reviews, Drug Discovery. - 2004. - v. 4. - p. 711-715.

2. Bukatin M.V., Ovchinnikova O.Y., Krivitskaya A.N., Chernikov M.V., Samburov A.V., Sendrjakova V.N. Technique of the integral estimation the general condition of laboratory animals in medical and biologic experiments // Международный журнал экспериментального образования. 2010. № 6. С. 40.

3. Dambach, C. New Technologies and Screening Strategies for Hepatotoxicity: Use of In Vitro Models / Donna M. Dambach, Barbara A. Andrews, and Frederic Moulin// Toxicologic Pathology.-2005.-v. 33.- n. 1.- p. 17-26.

4. Roth, A. Idiosyncratic Drug-Induced Liver Injury (IDILI): Potential Mechanisms and Predictive Assays /Alexander D. Roth and Moo-Yeal Lee// BioMed Research International.- 2017.- p. 1-23.

5. Ramboer, E. Immortalized human hepatic cell lines for in vitro testing and research purposes / Eva Ramboer, Tamara Vanhaecke, Vera Rogiers, and Mathieu Vinken// Methods Mol Biol.-2015.- p. 1-21.

6. Godoy, P. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME / Patricio Godoy, Nicola J. Hewitt, Ute Albrecht, Melvin E. Andersen, Nariman Ansari, Sudin Bhattacharya et al./ Arch Toxicol. - 2013.- 87. p. 1315-1530.

7. Heslop, J. Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile/ James A. Heslop, Cliff Rowe, Joanne Walsh, Rowena Sison-Young, et al./ Arch Toxicol. - 2017.- 91. p. 439-452.

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

  • Хроническое прогрессирующее заболевание печени человека. Значительное уменьшение числа функционирующих гепатоцитов, перестройка структуры паренхимы и сосудистой системы печени с последующим развитием печеночной недостаточности и портальной гипертензии.

    презентация [11,1 M], добавлен 28.05.2014

  • Роль печени в организме. Биохимические основы формирования алкогольной болезни печени. Экспериментальное моделирование патологии печени у крыс. Влияние карсила и эссенциале на состояние печени крыс при острой интоксикации CCl4 и этиловым спиртом.

    дипломная работа [10,2 M], добавлен 06.06.2016

  • Взаимосвязь функций печени, водно-электролитного баланса и кровообращения, влияние лекарственных препаратов. Определение риска при операциях у больных с заболеваниями печени. Особенности диагностики и терапии в различные фазы оперативного вмешательства.

    реферат [26,6 K], добавлен 17.02.2010

  • Влияние инфекционных заболеваний, а также токсических веществ экзогенного и эндогенного происхождения на печень. Симптомы гепатомегалии. Применение гепатопротекторных препаратов при лекарственных поражениях печени с наличием цитолитического синдрома.

    презентация [521,9 K], добавлен 17.09.2015

  • Рассмотрение основных факторов риска лекарственного взаимодействия. Анализ индукторов микросомальных ферментов печени: фенобарбитал, гризеофульвин, рифампицин. Знакомство с особенностями взаимодействия лекарственных средств при выведении из организма.

    презентация [243,0 K], добавлен 20.10.2013

  • Заболевания печени неинфекционной этиологии. Изменения основных биохимических показателей при заболеваниях печени. Ультразвуковое исследование печени. Методы биохимических исследований. Изменение биохимических показателей при токсическом циррозе.

    дипломная работа [1,0 M], добавлен 18.03.2016

  • Особенности печеночного кровотока при проведении операции. Метаболизм лекарственных препаратов. Образование и экскреция желчи. Дисфункция печени, ассоциированная с галогенизированными анестетиками, и ее лабораторная оценка. Заболевания желчных путей.

    реферат [21,4 K], добавлен 27.12.2009

  • Общая характеристика болезней печени. Токсическая дистрофия печени человека. Этиология и патогенез, патологическая анатомия по стадиям, осложнения, исходы. Роль пункционной биопсии печени в диагностике гепатитов. Медикаментозное поражение печени.

    реферат [34,4 K], добавлен 25.05.2014

  • 3 группы болезни печени. Нарушение обмена веществ в гепатоцитах и развитие в них дистрофических изменений и некроза. Токсическая дистрофия печени. Массивный некроз гепатоцитов. Изменения внутренних органов при остром гепатозе. Стадия неполной регенерации.

    презентация [1,5 M], добавлен 30.03.2016

  • Строение и назначение печени. Функциональные расстройства данного органа. Нарушение метаболической и антитоксической функций печени. Детоксикация организма от действия этилового спирта и нарушения функций печени, приводящие к жировой трансформации.

    курсовая работа [4,9 M], добавлен 18.01.2012

  • Диагностика и методы лечения нейроциркуляторной дистонии. Клинико-фармакологическая характеристика лекарственных препаратов. Обоснование выбора режима дозирования лекарственных средств, коррекция доз с учетом возраста больного, функции печени и почек.

    история болезни [21,7 K], добавлен 04.04.2015

  • Строение печени и ее функции в организме человека. Классификация цирроза печени. Основные методы исследования в гистологии. Алгоритм действий приготовления гистологического препарата. Выявление цирроза печени на основании гистологического исследования.

    дипломная работа [3,4 M], добавлен 29.06.2015

  • Классификация пролонгированных лекарственных форм. Методы продления действия лекарственных веществ. Иммобилизация живых клеток. Глазные пленки, их преимущества. Суспендирование растворимых лекарственных веществ. Заключение веществ в пленочную оболочку.

    курсовая работа [496,1 K], добавлен 28.03.2012

  • Изучение современных лекарственных препаратов для контрацепции. Способы их применения. Последствия взаимодействия при совместном применении контрацептивов с другими препаратами. Механизм действия негормональных и гормональных лекарственных препаратов.

    курсовая работа [3,2 M], добавлен 24.01.2018

  • Связь проблем фармацевтической химии с фармакокинетикой и фармакодинамикой. Понятие о биофармацевтических факторах. Способы установления биологической доступности лекарственных средств. Метаболизм и его роль в механизме действия лекарственных веществ.

    реферат [49,5 K], добавлен 16.11.2010

  • Биосинтез гемоглобина. Обмен хромопротеидов. Биохимические процессы, протекающие в печени. Роль печени в углеводном обмене и обмене стеринов. Синтез гликогена в печени. Участие печени в распаде белка. Механизм обезвреживания токсических веществ в печени.

    реферат [26,6 K], добавлен 23.01.2009

  • Исследование основных особенностей воспалительного процесса. Характеристика фармакологического действия лекарственных препаратов нестероидных противовоспалительных средств. Изучение показаний и способа применения, противопоказаний, побочных действий.

    курсовая работа [3,4 M], добавлен 10.03.2014

  • Бактериальная этиология и патогенез абсцесса печени, клинические проявления заболевания и постановка диагноза. Эпидемиология и патоморфология эхинококкоза печени и методы его профилактики. Распространенность первичного рака печени и течение болезни.

    реферат [22,8 K], добавлен 11.09.2010

  • Условия успешного проведения эхографии. Последовательный анализ состояния печени для уменьшения возможных диагностических ошибок. Сегментарное строение печени человека. Эхографическая картина нормальной печени. Какие заболевания выявляет ультразвук.

    презентация [1,8 M], добавлен 24.01.2016

  • Характеристика и виды очагового образования печени. Совершенствование методов лабораторной и инструментальной диагностики. Радиоизотопное сканирование печени. Клиника, диагностика и лечение метастатического рака печени. Доброкачественные опухоли печени.

    реферат [16,6 K], добавлен 25.02.2009

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.