Размещено на http://www.allbest.ru/

Методы исследования кариотипа человека

Панова М. Р.

Тюменский Государственный Медицинский Университет, педиатрический факультет 2 курс, 240 группа

Тюмень, Россия

ВВЕДЕНИЕ

Кариотип представляет собой неизменное количество хромосом, при анализе которых можно определить все параметры человека. В процессе исследования также можно опознать сопутствующие нарушения.

Проводится кариотипирование с целью исключить вероятность патологии, наличие генетических заболеваний и возможность оплодотворения яйцеклетки женщины. Кариотип организма человека включает 23 хромосомные пары (число хромосом в кариотипе - 46), 44 из них - наследственные признаки рода, 2 хромосомы определяют половой признак.

Исследование кариотипа человека является важным способом предупреждения рождения ребёнка с пороками развития, поэтому данная проблема будет очень актуальна в современном мире.

В данной работе будут рассмотрены методы исследования кариотипа человека.

Таким образом, можно поставить цель: Рассмотреть все возможные методы исследования кариотипа человека Задачи:

1. Выяснить что значит “нормальный кариотип человека”

2. Изучить информацию о существующих на данный момент методах исследования

3. Выяснить показания к исследованию кариотипа человека

ГЛАВА 1. КАРИОТИП ЧЕЛОВЕКА

1.1 Нормальный кариотип человека

Во всех клетках человеческого тела, за исключением половых, находятся 23 пары хромосом, т.е. всего 46 хромосом. Такой набор хромосом называется диплоидным. Ребёнок похож на своих родителей потому, что одну из хромосом каждой пары он получает от матери, а вторую - от отца.

Кариотип - это полный набор хромосом в ядре клетки. Это название произошло от двух греческих слов карион - ядро и типос - отпечаток. Генетики нумеруют хромосомы согласно их размерам. Другими словами, самая большая хромосома имеет номер 1. Отметим, что хромосомы 22 пар называют аутосомами, а 23-й пары - половыми. Таков нормальный кариотип человека.(рис. 1)

У женщин половые хромосомы обозначаются буквой Х, а у мужчин одна половая хромосома обозначается Х, а меньшая - Y. В яйцеклетках и сперматозоидах находится по одной хромосоме из каждой пары - т.е. всего 23 хромосомы. Подобный набор хромосом называется гаплоидным.

Рис. 1

кариотип молекулярный цитогенетический хромосомный

Хромосомы человека различаются по размеру, расположению центромеры и вторичных перетяжек. Впервые подразделение кариотипа на группы было проведено в 1960 г. на конференции в г. Денвере. В описание кариотипа человека первоначально были заложены два следующих принципа: - расположение хромосом по их длине;

- группировка хромосом по расположению центромеры (метацентрические, субметацентрические, акроцентрические).

Все хромосомы подразделялись на 7 групп:

А - крупные метацентрические (1-3);

В - крупные субметацентрические (4 и 5);

С - среднего размера субметацентрические (6-12 и Х);

D - крупные акроцентрические (13-15);

Е - маленькие субметацентрические (16-18);

F - маленькие метацентрические (19 и 20);

G - маленькие акроцентрические (21, 22 и Y).

В последующие годы классификация хромосом была дополнена данными о положении вторичных перетяжек (Лондонская конференция). Однако потребности клинической практики показали, что предложенная групповая Денверская и уточненная Лондонская классификации хромосом недостаточны для индивидуальной идентификации хромосом.

В процессе деления клетки, которое предшествует образованию половой клетки, каждая хромосома находит свою пару и тесно к ней прижимается, после чего хромосомы обмениваются фрагментами друг с другом и расходятся по возникающим после деления клеткам, при этом порядок генов в хромосомах остаётся неизменным. Такой процесс получил название рекомбинации.

Вследствие рекомбинации ребёнок не получает от родителей целиком каждую хромосому и у него проявляются новые сочетания признаков. [3. Разд. 3 стр 8]

1.2 Кариотипирование

Кариотипирование - это тест для изучения хромосом, который может помочь выявить генетические проблемы, ставшие причиной расстройства или заболевания.

Кариотипирование делается, чтобы:

-- Определить наличие аномальных хромосом у плода.

-- Определить причину врожденных дефектов ребенка.

-- Определить, наличие аномальных хромосом у взрослого человека и рассмотреть варианты, как они могут повлиять на развитие его будущего ребенка.

-- Определить, являются ли аномальные хромосомы причиной выкидыша или бесплодия женщины.

Хромосомные перестройки могут приводить к мужскому и женскому бесплодию, проблемам невынашивания беременности, врожденным порокам развития плода. При помощи анализа на кариотип можно определить патологии в хромосомном наборе супругов -- моносомия, трисомия, делеция, транслокация, мозаицизм и т. д. Кариотип плода с высокой точностью покажет на изменения, которые вызывают заболевания: синдромы Клайнфельтера, Прадера-Вилли, Эдвардса, Дауна, Патау, Шерешевского -- Тёрнера, аутизм и прочие пороки развития.

Хромосомные аномалии могут становится причиной бесплодия или невынашивания беременности, поэтому в таких случаях требуется определить кариотип супругов. Проведение анализа кариотипа рекомендуется для людей из группы риска:

-- близкие родственники имеют изменения в хромосомном наборе; -- люди, которые подвергаются влиянию вредных факторов.

Если первенец имеет проблемы в развитии, то планируя вторую беременность необходимо обязательно проводить данный вид генетического обследования.

Изменить кариотип родителей не предоставляется возможности, но, зная о существующей проблеме, можно заранее рассмотреть варианты ее решение.[1. Раздел 13. С. 1]

ГЛАВА 2. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ АНАЛИЗА КАРИОТИПА ЧЕЛОВЕКА

Обнаружение корреляций целого ряда заболеваний и врожденных дефектов в развитии человека с изменениями в его хромосомном наборе (кариотипе) стимулировало в середине 1950-х гг. развитие новой области генетики - цитогенетики человека и ее подразделов - клинической цитогенетики, онкоцитогенетики, пренатальной цитогенетики.

Основной задачей клинической цитогенетики является анализ кариотипа у пациентов с различными (изолированными и множественными) врожденными пороками развития. Задачи онкоцитогенетики касаются исследования корреляций онкологического процесса с хромосомными аномалиями в опухолевых клетках. В задачи пренатальной цитогенетики входят диагностика хромосомных болезней и изучение функциональной активности отдельных хромосом и их сегментов в период внутриутробного развития человека.

2.1 Основные подходы к анализу кариотипа

По мере развития методов цитогенетического анализа их арсенал неуклонно увеличивался, и в настоящее время возможно изучение всего хромосомного набора или отдельных хромосом в клетках практически любых тканей и органов, на любой стадии клеточного цикла, в митозе и мейозе.

В зависимости от целей исследования различают прямые и непрямые методы исследования хромосом.

Прямые методы подразумевают приготовление препаратов из свежеполученного материала после специальных обработок. Эти методы применяются при исследовании тканей, обладающих высокой митотической активностью (костный мозг, клетки лимфатических узлов, ткани эмбриона на ранних стадиях развития и хорион/плацента на любом сроке беременности) и при исследовании мейотических хромосом.

Непрямые методы включают получение препаратов хромосом из любой ткани после стимулирования пролиферации клеток в культуральных условиях в течение времени - от нескольких часов (кратковременные органные культуры) до нескольких лет (перевиваемые клеточные культуры).

зависимости от стадии клеточного цикла проводят исследования:

• отдельных хромосом или их участков в интерфазных ядрах (Х- и Y-половой хроматин в ядрах буккального эпителия как ориентировочный тест при диагностике численных нарушений в системе половых хромосом, анализ гетероплоидии методом гибридизации in situ в интерфазных ядрах любых клеток, включая бластомеры дробящихся зародышей);

• профазных хромосом (анализ на стадии пахитены в сперматогенезе);

• прометафазных митотических хромосом (анализ на высоком уровне разрешения);

• метафазных хромосом (традиционный анализ ФГА-стимулированных лимфоцитов и реже - клеток костного мозга, фибробластов кожи и др.);

• стадий анафазы - телофазы (для регистрации специфического воздействия различных агентов на хромосомы путем оценки частоты клеток с мостами и фрагментами).

2.2 Основные этапы анализа хромосом

Существует множество модификаций прямого и непрямого методов приготовления хромосомных препаратов. Однако при всем их разнообразии основные этапы получения метафазных пластинок, пригодных для анализа, остаются неизменными.

1. Использование колхицина или других агентов - ингибиторов образования веретена, останавливающих клеточный цикл на стадии метафазы.

2. Гипотоническая обработка - вызывает набухание клетки, разрушение межхромосомных связей, что способствует отделению хромосом друг от друга.

3. Фиксация - сохраняет структуру хромосом и удаляет остатки цитоплазмы.

4. Окрашивание препаратов. Исключением можно считать приготовление препаратов мейотических хромосом (сперматоциты I на стадии пахитены и ооциты II на стадии метафазы), которые не требуют применения колхицина. Первые два этапа полностью могут быть исключены при анализе интерфазных ядер.

Применение всех этапов обработки материала существенно улучшает качество препаратов метафазных хромосом. Концентрации реагентов, температурные и временные режимы, способы нанесения материала на препарат и окраски хромосом могут варьировать. Наличие многочисленных вариантов и модификаций цитогенетических методов объясняется особенностями исследуемого материала, целями исследования и устоявшимися лабораторными традициями.

В зависимости от задач исследования препараты хромосом можно анализировать одним из следующих способов.

1. Анализ с помощью фазового контраста. Позволяет оценить митотический индекс и качество метафазных пластинок на препарате.

2. Сплошное (рутинное) окрашивание хромосом. Применяется для анализа численных аномалий кариотипа и при специальных исследованиях хромосомных аберраций (хромосомных и хроматидных разрывов, мостов и фрагментов).

3. Дифференциальное окрашивание хромосом. Для идентификации хромосом и анализа их морфофункциональных особенностей используются различные методы дифференциальной окраски. Разнообразные способы предобработки препаратов позволяют выявлять как линейную неоднородность всех хромосом, т. е. их G/R-блочную организацию, так и избирательно окрашивать отдельные хромосомные районы. Многочисленные методы, позволяющие выявить линейную гетерогенность хромосомы, условно можно подразделить на три группы - избирательное связывание красителя (флюорохрома) с определенными нуклеотидами молекулы ДНК; различные предобработки хромосомных препаратов перед окраской неспецифическим красителем (обычно красителем Гимзы); исследования, основанные на асинхронности репликации отдельных участков хромосом. Особую группу представляют методы избирательной окраски, использующиеся для специфического выявления отдельных участков хромосом (прицентромерного гетерохроматина, ядрышковых организаторов). Для обозначения методов дифференциальной окраски применяется трехбуквенная система, подразумевающая способ получения и визуализации определенного типа сегментации. В зависимости от красителей анализ (общий и селективный анализ кариотипа или индивидуальных хромосом) проводится либо в проходящем свете, либо - после окрашивания флюорохромами - в отраженном свете с помощью люминесцентного микроскопа. Основные типы окраски, наиболее широко используемые в цитогенетической практике: GTG, СBG, RHG, QFQ, QFH/ AcD, RBA, FPG, Ag-NOR, DA/DAPI.

4. Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH). Метод основан на использовании хромосомспецифических ДНК-зондов, их гибридизации на хромосомных препаратах и детекции сигнала с помощью микроскопа.

При флуоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды (ДНК-пробы), которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин[en] (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флуоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стрептавидина, а дигоксигенин -- при помощи флюоресцентно-меченых антител. Хотя непрямой вариант мечения ДНК-проб требует дополнительных реактивов и временных затрат, этот способ позволяет добиться обычно более высокого уровня сигнала за счёт присутствия на молекуле антитела или авидина 3--4 молекул флюорохрома. Кроме того, в случае непрямого мечения возможно каскадное усиление сигнала.

Для создания ДНК-зондов используют клонированные последовательности ДНК (например, NotI-связующие клоны 3-й хромосомы человека, БАК[en]-клоны), геномную ДНК, продукты ПЦР, меченые олигонуклеотиды, а также ДНК, полученную при помощи микродиссекции.

Мечение зонда может осуществляться разными способами, например, путём ник-трансляции или при помощи ПЦР с мечеными нуклеотидами.

На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большой (не более 1 тыс. п. о.), чтобы не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических локусов или при окраске целых хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНКпоследовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченой ДНК повторов (например, Cot-1 DNA). Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.

На следующем этапе приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида, что позволяет снизить температуру денатурации до 70 °C.

Далее к препарату добавляют зонды и осуществляют гибридизацию около 12 часов. Затем проводят несколько стадий отмывок для удаления всех негибридизовавшихся зондов.

Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флуоресцентного сигнала зависит от многих факторов -- эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флуоресцентного красителя.[2 раздел 16 стр. 5-6]

В практическом плане суть цитогенетических методов при всем разнообразии их отдельных этапов сводится к микроскопическому анализу хромосомного набора (кариотипа) и выявлению геномных и хромосомных мутаций. Основным подходом к решению этой задачи является кариотипирование, т. е. определение числа и анализ структуры митотических хромосом с использованием метода дифференциальной окраски, позволяющего идентифицировать все хромосомы набора. Остальные методы хромосомного анализа дополняют кариотипирование и используются для решения специальных задач.

2.3 Основные принципы цитогенетического анализа

При кариотипировании следует руководствоваться критериями и правилами, принятыми в отечественной и международной клинической и пренатальной цитогенетике, а также нормативными документами МЗ РФ (Приказ МЗ РФ от 30.12.1993 № 316). Результатом цитогенетического анализа является цитогенетический диагноз в виде формулы с указанием числа хромосом, набора половых хромосом (и хромосомных аберраций, если они выявлены), который должен быть сформулирован в соответствии с рекомендациями Международной системы цитогенетической номенклатуры хромосом [31]. Цитогенетическую формулу необходимо сопровождать развернутым заключением, в котором интерпретируется цитогенетический диагноз, а также поясняются указанные в формуле особенности хромосомного набора.

Программы контроля качества цитогенетических исследований в учреждениях медико-генетической службы включают состав и квалификацию персонала, оборудование и реактивы, а также ряд параметров, касающихся непосредственного выполнения хромосомного анализа. .[1. Раздел 12 стр. 114]

ГЛАВА 3. ПОКАЗАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведение цитогенетического обследования необходимо во всех случаях, когда состояние или заболевание пациента позволяет заподозрить хромосомную аномалию. Результаты цитогенетического анализа позволяют уточнить клинический диагноз в соответствии с международной номенклатурой болезней (МКБ-10).

Основные показания к проведению кариотипирования:

1) нарушения репродуктивной функции неясного генеза у мужчин и женщин:

- привычное невынашивание (две и более неразвивающихся беременностей или спонтанных абортов в I триместре); учитывая высокую частоту (50-70 %) хромосомных аномалий у спонтанных выкидышей ранних сроков, целесообразно проводить также цитогенетическое исследование постабортного материала;

- многократные мертворождения;

- бесплодие при исключении гинекологической патологии у женщин;

- первичная или вторичная аменорея или ранняя менопауза;

- аномальная спермограмма у мужчин (олигоспермия и азооспермия);

- нарушения полового развития (гипогонадизм, нарушения половой дифференцировки);

2) множественные врожденные пороки развития (МВПР) у ребенка;

3) задержка умственного и физического развития у ребенка;

4) подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике. Специальные показания к проведению цитогенетического анализа:

1) подозрение на синдромы, характеризующиеся хромосомной нестабильностью;

2) некоторые онкологические заболевания (для дифференциальной диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза течения болезни); 3) оценка мутагенных воздействий.

Показания к проведению метафазного и интерфазного FISHтестирования:

1) подозрение на микроделеционные синдромы;

2) подозрение на мозаичный кариотип при хромосомном синдроме;

3) подозрение на хромосомную аномалию, возникшее при стандартном кариотипировании;

4) наличие сверхчисленной маркерной хромосомы;

5) острые лейкозы, миелодиспластические синдромы, хронический миелоидный лейкоз и другие миелопролиферативные болезни, злокачественная лимфома или хронические лимфопролиферативные заболевания, некоторые плотные опухоли. .[1. Раздел 12 стр. 15]

ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ХРОМОСОМНОГО АНАЛИЗА

В настоящее время все более широкое применение в цитогенетике находят методы, основанные на гибридизации хромосом с различными вариантами ДНК-зондов или количественном определении специфичных для каждой хромосомы маркерных ДНК-последовательностей. Благодаря применению молекулярно-генетических методов все более условной становится грань между методами микроскопического анализа хромосом и исследованием их тонкой структуры с помощью молекулярных методов или комбинированного молекулярно-цитогенетического подхода (рис.2).

Данные подходы включают флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), сравнительную геномную гибридизацию на ДНК-микрочипах (arrayCGH), мультиплексную лигазную реакцию с последующей амплификацией (MLPA), количественную ПЦР в реальном времени. .[1. Раздел 12 стр. 16]

Рис.2. Уровни разрешения методов исследования генома

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, можно сделать вывод, что существует достаточное количество методов исследования кариотипа человека. Благодаря данным исследованиям возникает возможность выявления аномалий хромосом. Что необходимо для прогнозирования вероятности рождения ребенка с той или иной патологией.

Таким образом, в данной работе были рассмотрены возможные методы исследования кариотипа человека

Выяснено, что значит “нормальный кариотип человека”

Выяснены показания для проведения кариотипирвания

Сегодня генетика является очень развитой научной отраслью. Она позволяет обнаружить отклонения на самых ранних стадиях и помогает скорректировать их. Благодаря генетике можно избежать повторных выкидышей, безуспешных попыток зачатия и других проблем. С помощью современной медицины можно решить практически любые проблемы с аномалиями хромосом.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Медицинская лабораторная диагностика: программы и алгоритмы / под ред. А.И. Карпищенко - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2014

2. "Клиническая генетика/ Бочков Н. П., Пузырев В. П., Смирнихина С.

А.; под ред. Н. П. Бочкова. - 4-е изд., доп. и перераб. - М. : ГЭОТАРМедиа, 2013."

3. Медицинская генетика : под ред. Н. П. Бочкова. - М. : ГЭОТАРМедиа, 2014.

Размещено на Allbest.ru