Браш-цитология слизистой оболочки желудка: возможности и перспективы участия в оценке состояния микробиоценоза желудка

Размещено на http://www.allbest.ru/

Браш-цитология слизистой оболочки желудка: возможности и перспективы участия в оценке состояния микробиоценоза желудка

Дубенская Л.И., Баженов С.М., Никонорова Н.М., Дударева Т.В.

Аннотация

гастрит микробиоценоз желудок эндоскопический

В работе приводится краткий обзор сведений о микробиоценозе слизистой оболочки желудка в норме и при Helicobacter pylori-ассоциированном гастрите. Обсуждаются преимущества и ограничения различных методов, возможности и перспективы эндоскопической браш-цитологии в диагностике изменений микробного сообщества слизистой оболочки желудка. Предлагается система количественной оценки смешанной микрофлоры по признаку, прямо связанному с ее количеством -- «плотности взаиморасположения микроорганизмов», которая определяется визуально. Анализ состояния микробиоценоза слизистой оболочки желудка должен быть комплексным, следует учитывать клинические данные, результаты микробиологического, молекулярно-генетического, патогистологического и цитологического исследований.

Ключевые слова: браш-цитология, слизистая оболочка желудка, микрофлора

Annotation

Gastric brushing cytology: opportunities and prospects of participatoin in the estimation of stomac's microbiocenose

Dubenskaya L.I., Bazhenov S. M., Nickonorova N. M., Dudareva T.V.

Short review of information about bacterial microbiocenose of gastric mucosa in normal condition and in case of Helicobacter pylori-assotiated gastritis are given in the paper.Advantages and disadvantages of different methods are discussed, opportunities and prospects of using endoscopic brushing cytology for diagnostics of modifications in microbial community of mucous coat of stomach. A system of quantitative assessment of mixed microflora is suggested on the basis of its quantity - “density order of microorganisms”, which is determined by sight. The analysis of the bacterial microbiota of gastric mucosa has to be integrated, clinical evidence, the results of microbiological, molecular, pathohistological and cytological research should be taken into consideration.

Key words: brushing cytology, gastric mucosa, microflora

Значимость морфологических методов исследования состояния слизистой оболочки желудка (СОЖ) при хроническом гастрите (ХГ) в настоящее время является бесспорной, что нашло отражение в признании гистологического метода «золотым стандартом». Диагностическое цитологическое исследование гастробиопсийного материала, как правило, препаратов-отпечатков, не позволяет диагностировать ХГ [19], но имеются указания на высокий процент совпадений по степени активности, выраженности воспаления, бактериальной обсемененности, метапластическим и диспластическим изменениям СОЖ при ХГ [1]. Безусловно, значительное совпадение с результатами «золотого стандарта» должно способствовать применению цитологического метода совместно с гистологическим, но заменить его в полной мере не способно.

В этом случае, роль полноценного участника морфологического исследования цитологии может обеспечить описание и адекватная оценка тех элементов, которые мало доступны или не доступны для гистологии, специфическая подготовка материала которой, к тому же, значительно уменьшает размеры многих микрообъектов (клеток, микроорганизмов). В цитологии имеются примеры успешного применения ее методов именно в таком аспекте, в частности, это мазки, соскобы, отпечатки со слизистых оболочек, граничащих с внешней средой: из полости рта, носа, влагалища, уретры, с поверхности шейки матки. Анализ цитологических данных столь различных локализаций основан на единых общих принципах: оценка слущенных эпителиальных клеток (характера их дифференцировки, пролиферативных, диспластических, атипических изменений), микрофлоры, свойственной данному биотопу в состоянии нормы или патологии, количественных и качественных характеристик лейкоцитов, прочих клеток воспалительного экссудата, если таковой имеется.

Действительно, вышеуказанные компоненты содержатся в некотором объеме гистологического среза, однако элементы, относящиеся к поверхности слизистых, наиболее полноценно представлены в цитологических препаратах. Поэтому оценка состояния слизистых на границе взаимодействия с внешней средой, включающая элементы взаимоотношений микробиоценоза и макроорганизма -- значимый элемент морфологического исследования, существенно расширяющий его и часто самостоятельный (если нет надобности в гистологическом исследовании).

Создается впечатление, что цитологические исследования в диагностике неопухолевой патологии верхних отделов пищеварительного тракта (ВОПТ) в настоящее время наиболее востребованы для выявления Helicobacter pylori (HP). Поскольку в цитологическом материале, по сравнению с гистологическим, доступен весь поверхностный слизистый слой (излюбленные места обитания HP), естественные размеры и форма микроорганизмов более сохранны, цитологический материал более пригоден для выявления HP [15, 11]. Активному применению цитологии для выявления HP способствует и другое, традиционное для нее свойство: быстрота получения ответа, доступность и относительная простота исследования.

Безусловно, в идеальном варианте, микроскопическое выявление HP -- это один из этапов изучения колонизации конкретного больного данным микроорганизмом, сочетание его с ПЦР, с микробиологическими методами становится все более актуальным и необходимым, для определения антибиотикочувствительности HP, характера межмикробных взаимодействий в микробиотопах ВОПТ при различных его состояниях.

Helicobacter pylori на сегодняшний день -- наиболее признанный и изученный представитель мукозной флоры СОЖ, который активно изучается последние 25 лет. Вероятно, благодаря эволюции взглядов на роль HP в патологии ВОПТ, постепенно расширяются пути проникновения в сложный и все еще малоизученный мир микробиоценоза желудка, который, надо признать, давно привлекал внимание микробиологов, гастроэнтерологов и хирургов.

Давно сформировалось устойчивое убеждение о скудном микробном спектре желудка в норме. Многими авторами упоминается тот факт, что просветная микрофлора, поступающая в желудок с пищевым комком, погибает в нем в течение 30 минут за счет высокой бактерицидности желудочного сока [18, 20]. По мнению Басиной Л. (1931), Перетц Л.Г. (1955), в желудке здорового человека содержатся в основном энтерококки и молочные стрептококки. Относительная малочисленность культивируемых бактерий и жесткие антибактериальные условия внутрижелудочной среды привели к принятию мнения о том, что человеческий желудок не является местом, подходящим для комплекса микробной биоты. Как указывали Н.И.Урсова и Г.В. Римарчук (2001), в составе микрофлоры (МФ), расположенной на поверхности эпителиального пласта и в толще слизи, выявляются преимущественно грамположительные бактерии родов Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus, Micrococcus, а так же Helicobacter и дрожжеподобные грибы. В настоящее время, в микрофлоре желудка различают орально-респираторный тип (оральные и назофарингеальные микроорганизмы: стрептококки, лактобактерии, фузобактерии, нейссерии, стафилококки, микрококки и др.) и фекальный тип (энтеробактерии, энтерококки, бактероиды, вейлонеллы, фузобактерии и др.). Разделение на эти типы относительно, возможен и смешанный вариант [цит. по Чернину В.В. и др., 2004].

Bik E. M. и соавторы (2006), исследовавшие микробное сообщество желудка с помощью молекулярно-генетических методов, выделили в нем пять главных доминирующих филотипов: Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroides, Actinobacteria, Fusobacteria. Был найден и ряд других, в частности, Caulobacter, Actinobacillus, Corynebacterium, Rothia, Gemella, Leptotrichia, Porphyromonas, Capnocytophaga, TM 7, Flexistipes, Deinococcus; применение молекулярно-генетических методов анализа позволило этим авторам выявить 128 филотипов микроорганизмов. Столь выраженное разнообразие данной экосистемы сравнимо с таковым в нижних отделах желудочно-кишечного тракта [22].

Известно, что по сравнению с просветной МФ, бактерии, способные к гистадгезии в пристеночном слое, оказываются в более комфортном, защищенном слизистыми наложениями состоянии; гистадгезия, связанная с лиганд-рецепторным взаимодействием, обеспечивает долгосрочное пребывание бактерий в пристеночном биотопе. Оба микробиотопа нижележащих отделов кишечника -- просветный и пристеночный -- имеют существенное значение в формировании и поддержании различных патологических состояний. Пристеночный биотоп -- важнейшая структура, являющаяся границей между внешней и внутренней средой. Основными элементами СОЖ, с которыми взаимодействуют микроорганизмы и которые представляют пристеночный микробиотоп, являются слизистый гель, гликокаликс, эпителиальный пласт и инфильтрирующие слизистую оболочку иммунокомпетентные клетки [8]. Иммобилизированное состояние естественно для существования бактерий. Гликокаликс с ассоциированными с ним микроколониями участвует в формировании микробно-тканевого комплекса. Микробно-тканевой комплекс образуют микроколонии бактерий, слизь, клетки слизистой оболочки, подслизистый аппарат. В пределах микробно-тканевого комплекса происходит постоянный обмен генетическим материалом, регуляторными молекулами, фрагментами структурных генов, плазмидами. Данный комплекс имеет сложные регуляторные связи с другими системами организма. Захарченко М. П. и соавторы (2007) указывают на возможность выделения нескольких уровней, на которых происходит взаимодействие макроорганизма с нормальной флорой желудочно-кишечного тракта: микробно-тканевой комплекс, пищеварительная система в целом с участием всех органов и систем, макроорганизм с участием всех гомеостатических систем [10].

Имеющиеся данные о составе и функциях просветного биотопа кишечника не возможно полностью экстраполировать на пристеночный микробиоценоз. Биологическую, патогенетическую и диагностическую значимость пристеночного микробиоценоза кишечника еще предстоит установить [6].

Все вышесказанное вполне можно отнести к пристеночному и просветному микробиоценозу желудка как составной части желудочно-кишечного тракта, с той поправкой, что об этих биотопах в настоящее время известно существенно меньше. Тем не менее, несмотря на нераскрытые пока механизмы, указывается на важную роль желудочной микрофлоры как в поддержании здоровья, так и при формировании патологии [22].

Следует отметить, что любые функциональные и органические изменения слизистого слоя кишечной стенки обязательно ведут к обратимым или необратимым изменениям пристеночной микрофлоры [8]. Существенное значение для изменения микробиоценоза имеют морфофункциональные изменения кишечной стенки, физико-химических свойств муцина, скорости секреции слизи -- эти факторы могут создавать селективные условия для существования тех или иных микроорганизмов [5].

Не вызывает сомнений, что при различных функциональных и органических изменениях желудка значительно изменяется его микрофлора, что характеризуется усиленным размножением бактерий, появлением нетипичных видов [17, 20].

Есть основания предполагать, что Helicobacter pylori имеет существенное значение в формировании микробиоценоза желудка, однако данные разных авторов о влиянии хеликобактерий на МФ желудка выглядят достаточно противоречиво. Например, было выявлено, что у детей с хроническим гастритом, не ассоциированным с HP, в слизистой оболочке и пристеночной слизи достоверно чаще присутствовали условно-патогенные бактерии в ассоциации с лакто- и бифидофлорой. При наличии HP микробный спектр менее разнообразен, в нем отсутствовали бифидо- и лактобактерии [12]. Bik E.M. и соавторы (2006) не выявили значимого влияния наличия HP на состав желудочного сообщества бактерий. В экспериментальных исследованиях на мышах с помощью культуральных и молекулярно-генетических методов Tan M. и соавторами (2007) было выявлено, что ни острая, ни хроническая HP-инфекция не нарушают микробного сообщества желудка мышей, на него значимо не влияют ни HP-индуцированное воспаление в слизистой оболочке желудка, ни возрастное снижение кислотности; более того, и культуральные методы, и ПЦР не выявили значительных различий микробиоценоза желудка между инфицированными и неинфицированными HP мышами [30].

Сложны и неоднозначны взаимоотношения HP с грибами рода Candida: компоненты микробных клеток HP содержат полипептидные факторы, обладающие выраженной фунгицидной активностью по отношению к мицеллярным формам грибов [27]. Однако выявляются случаи совместного персистирования кандид с HP, особенно после неэффективного курса эрадикационной терапии [13].

Наряду с тем, что до сих пор нет четкого ответа на вопрос: в какой степени желудок является биотопом для эубиотической флоры, есть основания полагать, что поступающая в него эубиотическая индигенная, транзиторно-индигенная и транзиторная микрофлора вступает в антагонистические взаимодействия с патогенными бактериями и хеликобактерами. Несмотря на краткосрочность этих взаимоотношений, они считаются достаточно эффективными в реализации колонизационной резистентности желудка [8].

Нельзя исключить, что и колонизация HP, с которым человек сосуществовал миллионы лет, имеет для организма неизвестные на сегодняшний день преимущества, потеря которых подвергает человека другой опасности [23]: по мере исчезновения инфекции HP снижается частота развития язвенной болезни, но резко возросла частота таких заболеваний, как желудочно-пищеводный рефлюкс, синдром Барретта, аденокарцинома нижних отделов пищевода и кардиальной части желудка. Martin J. Blaser (1999) предполагает, что врачи будущего будут прибегать к колонизации определенными непатогенными штаммами HP с целью снижения риска развития некоторых заболеваний.

Столь неоднозначная роль HP и малоизученные взаимоотношения в микробиоценозе желудка указывают на необходимость особо осторожного обращения с термином «дисбактериоз» применительно к гастродуоденальной зоне. Нельзя исключить существования ситуаций, когда формально трактуемая как дисбактериоз стратегия поведения микрофлоры желудка является не патологическим состоянием, а комплексом адаптационно-приспособительных реакций, направленных на получение организмом позитивного результата.

Показано, что развитие дисбактериоза гастродуоденальной зоны при язвенной болезни и хроническом гастрите четко связано с местными и общими механизмами данных заболеваний, и, по мнению Чернина В.В. и соавторов (2004), является вторичной реакцией, в связи с чем оно должно рассматриваться во взаимосвязи с этиологическими, патогенетическими факторами, состоянием иммунного статуса и проявлениями заболевания [21].

Становится все более ясным, что проблема изучения дисбиотических изменений гастродуоденальной зоны, являясь традиционно микробиологической задачей, на сегодняшний день, не может быть ограничена лишь областью микробиологии, она широко охватывает смежные клинические дисциплины, клинико-лабораторную, патоморфологическую (гистологическую и цитологическую) диагностику, то есть предполагает участие различных специальностей со свойственными им методами исследования и особенностями получаемых данных.

Если принять во внимание значимость исследования наиболее поверхностных отделов слизистой оболочки желудка, являющихся границей взаимодействия с внешней средой, то следует рассмотреть возможности и особенности цитологического материала, полученного разными способами.

Вероятно, один из наиболее старых цитологических способов -- микроскопия желудочного содержимого, полученного натощак. В норме осадок содержит: клетки многослойного плоского эпителия (МПЭ) из полости рта и пищевода, нейтрофилы, макрофаги из мокроты, эпителиальные клетки СОЖ, незначительное количество эозинофилов, лимфоцитов, плазмоцитов. Дрожжеподобные грибы, иногда в состоянии почкования, в нормальном желудочном содержимом имеются в скудном количестве, при застое -- в большом. Сарцины находят в застойном содержимом в присутствии свободной соляной кислоты. Палочки молочно-кислого брожения (Боас-Опплера) -- в застойном желудочном содержимом при отсутствии свободной соляной кислоты. Пищевые остатки (растительная клетчатка, мышечные волокна, нейтральный жир) свидетельствуют о нарушении эвакуаторной функции и застойных явлениях. На воспалительный характер слизи может указывать обилие слущенных эпителиальных клеток, лейкоцитов, эритроцитов. Отсутствие слизи в материале не является убедительным свидетельством против наличия местной воспалительной реакции. Такие возможности микроскопического исследования осадка желудочного содержимого помогают судить об эвакуаторной функции желудка, а в ряде случаев -- о воспалительных изменениях [2, 16].

Наибольший интерес для цитолога представляют способы получения материала, полноценно сохраняющего клеточные элементы СОЖ, особенно при диагностике предопухолевой и опухолевой патологии. Мазки-отпечатки получают, прикасаясь к предметному стеклу всеми сторонами гастробиопсийного кусочка или прокатывая его по стеклу. Исследование мазков-отпечатков и гистологических срезов гастробиоптатов проводят параллельно; наряду с тем, что цитология не выявляет строго специфических признаков гастрита, полипоза, язвы, в цитопрепаратах можно выявлять разную степень пролиферации покровно-ямочного эпителия при этих состояниях [14], а так же наличие хеликобактерной инфекции.

Примечательны возможности цитологических отпечатков в диагностике некоторых инфекций гастроинтестинального тракта. Кроме HP могут быть выявлены грибы Candida, Giardia lamblia, Gastrospirillium hominis (Helicobacter heilmannii), Blastocystis hominis. При исследовании Debongnie J. C. и соавторами (1994) отпечатков параллельно со срезами биоптатов, в ряде случаев цитология была единственным морфологически методом, выявившим указанные патогены, что указывает на повышение диагностических возможностей морфологического исследования при участии цитологических методов [25].

Раздавленный (краш) препарат получается путем сжатия гастробиопсийного кусочка между двумя предметными стеклами. Особенностью краш-препаратов СОЖ является наличие всего клеточного материала и слизистых наложений в полном объеме, включая наиболее глубокие, прилежащие непосредственно к апикальной поверхности клеток, в области ямок. Поэтому с помощью такого способа получается цитопрепарат, вероятно, наиболее полноценный для выявления HP. Эта возможность не утрачивается даже в тех случаях, когда путем раздавливания получаются препараты с полностью разрушенными клеточными элементами или наличием отдельных плотных тканевых клочков, не пригодных для просмотра.

Редко используемый в настоящее время абразивный материал, полученный с поверхности СОЖ с помощью цитощетки (браш-препарат), может содержать все слои слизи, с преобладанием, вероятно, самых поверхностных. Davenport R. D. (1990) было показано, что браш-цитология желудка -- эффективный метод диагностики HP-ассоциированного гастрита.

По сравнению с краш-прапаратами и отпечатками гастробиоптатов, браш-препараты отличаются определенным своеобразием. Как и мазок (соскоб) с поверхности других слизистых, браш-препарат СОЖ содержит поверхностные эпителиальные элементы, слизь, микрофлору и лейкоциты в различных количествах. Тесное соседство с агрессивными кислото-пептическими факторами желудочного сока изменяет привычный вид клеточных элементов, имеющих плохую сохранность в микропрепарате. Клетки покровно-ямочного эпителия чаще обнаруживаются в виде голых ядер, располагающихся среди разной плотности остатков разрушенной цитоплазмы и слизи, где так же содержатся различные количества микроорганизмов и лейкоцитов -- сегментоядерных, лимфоцитов. Как правило, лейкоциты резко пикнотичны, сегментоядерные редко имеют остатки цитоплазмы. Вероятно, на степень сохранности лейкоцитов влияет длительность их нахождения в поверхностных отделах слизи. В таком случае можно предположить, что чем интенсивнее экссудация нейтрофилов на момент забора материала, тем чаще в браш-препарате должны обнаруживаться сохранные лейкоциты.

Основным элементом браш-препаратов СОЖ, видимо, можно считать комплексы из эпителиальных разрушенных клеток и слизи (КРКС) в разных соотношениях, содержащие различное количество микроорганизмов и лейкоцитов. Данные комплексы могут быть разной оптической плотности и размеров, вплоть до самых тонких и мелких, сливающихся с фоном препарата.

Фон браш-препарата так же может быть более или менее густым, с остатками кристаллизации, вероятно, наиболее жидкой части поверхностной слизи, которая легко размазывается по стеклу. В фоне препарата содержатся отдельные голые эпителиальные ядра, лейкоциты, разрозненные или в плотных скоплениях, рассеянная микрофлора, микроколонии бактерий на трудноразличимых остатках слизисто-тканевых субстратов.

В браш-препаратах чаще, чем в краш- и отпечатках, встречаются клетки многослойного плоского эпителия, как правило, с выраженными признаками повреждения цитоплазмы и ядер, принадлежащие разным слоям МПЭ -- промежуточные, поверхностные клетки, безъядерные остатки цитоплазмы. Клетки МПЭ могут располагаться разрозненно и группами в фоне препарата, ассоциироваться с фрагментами разрушенных эпителиальных клеток СОЖ и слизи. Клетки МПЭ могут иметь относительно «чистую» цитоплазму или содержать в различных количествах (иногда массивных) адгезированную на поверхности микрофлору. Последнее обстоятельство заслуживает внимания в контексте обсуждения микробиоценоза желудка и не позволяет «отмахнуться» от клеток МПЭ в гастроцитограмме на том лишь основании, что СОЖ не является источником их происхождения. Несмотря на то, что в настоящий момент не пока достаточных предпосылок для рассмотрения определенной диагностической значимости клеток МПЭ в браш-препарате, где они оказываются, вероятно, нередко вследствие особенностей эндоскопических процедур, очевидно, что в полость желудка и на поверхность СОЖ они попадают вполне естественным путем, причем постоянно, из полости рта, пищевода, со слюной, назофарингеальной слизью и вместе с этими жидкостями служат источниками орально-респираторной флоры в микробиоценозе желудка. Действительно, иммобилизированные на клетках МПЭ микроколонии, имеющие, к тому же, определенный питательный резерв в виде гликогена в цитоплазме этих клеток, представляются реальными источниками микрофлоры, по крайней мере, часть из которой окажется способной колонизировать слизь СОЖ в течение того или иного времени.

Из приведенного выше обсуждения особенностей цитологического материала следует, что наиболее полноценный вариант цитологического исследования СОЖ должен включать и традиционный отпечаток (или краш) с сохранными клеточными элементами и глубокорасположенной, прилежащей к ним слизью, и редко применяемый браш-препарат с наиболее поверхностными отделами пристеночного микробиоценоза.

В таком случае, исследование браш-препарата целесообразно ориентировать, в первую очередь, на описание МФ и оценку морфологических элементов препарата, возникших в результате взаимодействия СОЖ с микробиоценозом в поверхностных отделах слизистой.

Перспективным представляется сочетание микробиологических методов с морфологическими. При этом каждому методу в комплексном исследовании принадлежит своя роль благодаря присущим им особенностям и возможностям. Доступность ряда быстрых, безопасных, недорогих цитологических методов часто выдвигает цитологию на передний край диагностических исследований, включая и диагностику инфекций [28]. Однако применяемые в повседневной практике окраски микрофлоры по Граму и по Романовскому не позволяют в полной мере идентифицировать микроорганизмы, речь может идти об отношении их к окраске по Граму и описании морфотипов бактерий. В большинстве таких ситуаций требуется выделение чистой культуры, идентификация ее до рода и вида и определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, проводимые в микробиологической лаборатории. Нельзя не отметить, что серьезной проблемой микробиологических исследований микробиоценоза слизистой оболочки желудка оказывается не только их длительность, высокая стоимость и малая доступность, но и существование множества микроорганизмов, которые все еще не могут быть культивированы in vitro.

Из 128 филотипов микроорганизмов, выявленных Bik E. M. и соавторами (2006) в микробиоценозе слизистой оболочки желудка молекулярно-генетическим методом, 50 % относились к некультивируемым. Вероятно, в некультивируемом состоянии находится и значительное количество хеликобактерий: так, с помощью ПЦР в режиме реального времени было показано, что количество HP-микроорганизмов в желудке инфицированных мышей, находящееся в некультивируемом состоянии, превышало их содержание, определяемое культуральным методом [30].

Высокочувствительные молекулярно-генетические исследования значительно расширяют представления о микробных сообществах различных экологических ниш человека и животных, в том числе, и микробиоценоза желудка. Тем не менее, при анализе результатов, получаемых с помощью столь высокочувствительного метода, надо учитывать, что выявление бактериальной ДНК не обязательно указывает на наличие живых и резидентных микроорганизмов. Бактериальные ДНК в гастробиоптатах могут оказаться фрагментами микроорганизмов или транзиторными бактериями [29].

Можно рассчитывать, что совместные исследования будут способствовать получению результатов, соотносимых между морфологическими, микробиологическими и молекулярно-генетическими способами оценки, нахождению морфологических методов, обладающих оптимальной чувствительностью, достаточной для общедоступного применения, по крайней мере, на ранних этапах диагностики изменений микробиоценоза СОЖ.

Более того, роль цитоморфологии в комплексном исследовании изменений микробиоценоза СОЖ не может быть ограничена только неспецифическими методами и начальными этапами диагностики. Использование цитологических и гистологических методов, особенно со специфическими способами выявления микроорганизмов моноклональными антителами, с помощью иммуноцитохимии, может существенно расширить информацию о них, в частности, и о бактериях, которые трудно культивируются или находятся в некультивируемом состоянии. В отличие от микробиологического, иммуноморфологическое выявление микрофлоры может быть проведено несравнимо быстрее. Иммуноморфологическое исследование не связано с трудностями культивирования, необходимостью воспроизведения естественных условий обитания бактерий. Для иммуноцитохимии не требуется создания особых условий, в отличие от ПЦР-лаборатории. Безусловно, микроскопическое исследование не может выявить такого разнообразия малых количеств микроорганизмов, как молекулярно-генетические методы, порог его чувствительности несравнимо выше, но именно благодаря этому свойству общедоступная бактериоскопия и иммуноцитохимия способны выявлять микробные популяции, достигшие высоких титров в данном биотопе или поступившие в него в большом количестве.

Другим выгодным свойством цитологии является то, что изготовление цитопрепарата и его быстрая фиксация значительно ограничивают возможность бактериальной контаминации персонала и лабораторного оборудования [28].

Уместно подчеркнуть, что только морфологическим методам доступно выявление взаиморасположения различных микроорганизмов и их локализации, которые, по крайней мере, приближены к естественным.

Существование защитных сил организма и барьеров слизистых оболочек предопределяет создание бактериями участков их локального насыщения [4]. Микроколониальный рост одного вида бактерий или сложного мультивидового сообщества на подходящей поверхности свойственен и сапрофитным, и патогенным бактериям. Здесь могут реализовываться механизмы коллективного поведения микроорганизмов, основанные на «Quorum sensing» («чувство кворума»), химической сигнальной системе, регулирующей работу определенных генов бактерий в зависимости от плотности их популяции на основе принципа аутоиндукции [7]. «Quorum sensing» -- важный механизм межклеточных коммуникаций, зависящий от плотности бактериальной популяции и приводящий к модуляции определенных специфических функций бактерий (например, вирулентности). Этот феномен обеспечивает поведение сообщества бактерий как многоклеточного организма. Предполагается, что дальнейшее раскрытие механизмов «Quorum sensing» микроорганизмами гастроинтестинального тракта позволит выявить неизвестные механизмы вирулентности патогенов, развития и поддержания нормофлоры желудочно-кишечного тракта [26].

Значимость плотности микробных популяций для координации направленности их функционирования позволяет предположить важность морфологических характеристик количества и взаиморасположения МФ для понимания процессов, происходящих в поверхностных отделах СОЖ при различных адаптивных и патологических процессах. Микрофлора пристеночного слоя, выявляемая при микроскопии браш-препаратов СОЖ при ХГ в больших количествах, в виде микроколоний, действительно заставляет задуматься и о принадлежности ее к конкретным видам, и о ее роли в функционировании микробно-тканевого комплекса СОЖ.

Поэтому, кроме выявления факта наличия микрофлоры, перед морфологией, в том числе и браш-цитологией, могут быть поставлены задачи определения некоторых характеристик локализации МФ, ее количества, ряда представителей, характера лейкоцитарной экссудации, то есть элементов, составляющих морфологические эквиваленты перестройки в данном биотопе, взаимодействия микробиоценоза с СОЖ.

Весьма сложной задачей в описании микрофлоры браш-препарата является ее количественная оценка. При массивном содержании разнообразных по размеру и форме микроорганизмов, многослойном и неравномерном их расположении, трудности различения отдельных бактерий в скоплениях и агглютинатах, полуколичественные оценки, разработанные и применяемые для HP, оказываются бесполезными для смешанной флоры. Требуются критерии, отражающие различия не только в относительно небольших количествах, которые можно подсчитать, но и в массивах, содержащих многие сотни микробных клеток. Все это объясняет необходимость разработки нескольких систем учета, отражающих возрастающие значения признаков, прямо связанных с количеством МФ. Итоговая оценка может быть представлена в виде значений таких признаков каждого отдельно или вместе в виде суммы баллов, которая может варьировать в достаточно широких пределах, что более приемлемо для статистической обработки по сравнению с узкими трех- или четырехбальными системами.

Вполне понятно, что любая полуколичественная оценка субъективна и не претендует на высокую точность, но она должна дать возможность распознать и отличить различные количественные градации признака.

В связи с вышеизложенным, разработана полуколичественная оценка ряда признаков, прямо связанных с количеством микроорганизмов в браш-препарате СОЖ.

Применение всех предлагаемых систем учета признаков проводилось в микропрепаратах, фиксированных 96є этиловым спиртом и окрашенных по Граму. Микроскопическая оценка включала использование бинокулярной насадки (Х 1,5), окуляров (Х 7), масляной иммерсии с объективом (Х 90).

Одним из основных учитываемых признаков явилась «плотность взаиморасположения микроорганизмов» (ПВМ) рассеянной МФ. Термин ПВМ предлагается для однозначного понимания каждого из вариантов взаимного положения микроорганизмов разных размеров и формы, находящихся в компонентах цитопрепарата на определенном расстоянии друг от друга и расположенных в наслоениях различной толщины. Показатели ПВМ могут варьировать от единичных бактерий, далеко отстоящих друг от друга в поле зрения, до массивных количеств тесно расположенных микроорганизмов, что указывает на прямую связь величины ПВМ с количеством бактерий в пристеночном микробиотопе СОЖ.

1. Система оценка ПВМ рассеянной микрофлоры.

Для определения ПВМ рассеянной смешанной МФ в браш-препарате была модифицирована система оценки «плотности колонизации», разработанная на краш-препаратах, окрашенных нитратом серебра для выявления смешанной мукозной флоры, исключая HP [9].

Условными «единицами измерения» расстояния между микроорганизмами служили: наибольший диаметр часто встречающихся в браш-препарате ядер клеток поверхностно-ямочного эпителия (Я) и средний диаметр микробной клетки (ДМК), определяемые визуально, без точных измерений. Система оценки включает 11 баллов. Учитывать результат можно относительно поля зрения или части поля зрения в зависимости от размеров участка, занимаемого микрофлорой, оценить можно микрофлору во фрагментах из разрушенных клеток и слизи, в «чистой» слизи, если она имеется в достаточном количестве, в фоне препарата. Система оценки содержит 5 пунктов для учета вариантов относительно равномерно рассеянной флоры и шесть промежуточных, для неравномерно рассеянной.

Равномерно рассеянная флора. 1 балл -- «очень широко рассеянная флора» (ОШР): в поле зрения малое количество микробных клеток, расстояния между которыми -- несколько диаметров Я. 2 балла -- «широко рассеянная флора» (ШР): преобладающие расстояния между бактериями -- 1-2 диаметра Я. 5 баллов -- «близко расположенная флора» (БР): преобладающие расстояния между бактериями -- 3-4 ДМК. 8 баллов -- «тесно расположенная флора тонких участков» (ТРТ): преобладающие расстояния между бактериями -- 1-2 ДМК и теснее. Флора расположена преимущественно однослойно. Такие участки производят впечатление густо колонизированных, но прозрачных. Бактерии расположены, как правило, раздельно. 11 баллов -- «тесно расположенная флора плотных участков-агглютинат» (ТРА): массивное количество микрофлоры располагается в нескольких перекрывающихся слоях, границы скоплений неровные и нечеткие, отдельные микробные клетки различимы только по краям плотного скопления-агглютината, который выглядит темным или очень темным.

Неравномерно рассеянная флора, промежуточные варианты (следует отметить, что варианты неравномерно рассеянной флоры встречаются в препаратах гораздо чаще относительно равномерных). 3 балла -- «широко рассеянная флора» преобладает над «близко расположенной» (ШР-БР). 4 балла -- «близко расположенная флора» визуально преобладает над «широко рассеянной» (БР-ШР). 6 баллов -- «близко расположенная» преобладает над «тесно расположенной тонких участков» (БР-ТРТ). 7 баллов -- «тесно расположенная тонких участков» преобладает над «близко расположенной» (ТРТ-БР). 9 баллов -- «тесно расположенная флора тонких участков» по площади преобладает над «тесно расположенной-агглютинатом» (ТРТ-ТРА). 10 баллов -- «тесно расположенная флора-агглютинат» по площади преобладает над «тесно расположенной флорой тонких участков» (ТРА-ТРТ).

Таким образом, в порядке возрастания количества смешанной микрофлоры элементы данной системы учета выглядят следующим образом: «ОШР» (1 балл) > «ШР» (2 балла) > «ШР-БР» (3балла) > «БР-ШР» (4 балла) > «БР» (5 баллов) > «БР-ТРТ» (6 баллов) > «ТРТ-БР» (7 баллов) > «ТРТ» (8 баллов) > «ТРТ-ТРА» (9 баллов) > «ТРА-ТРТ» (10 баллов) > «ТРА» (11 баллов).

Используя данную систему учета, можно по мере просмотра препарата фиксировать в протоколе, в каком количестве полей зрения однотипных компонентов (фон, слизь, КРКС) выявлен соответствующий вариант ПВМ рассеянной МФ, который затем будет переведен в количественный показатель.

В нижних отделах желудочно-кишечного тракта процесс построения и разрушения пристеночного микробиотопа динамичен, как динамично заселение и освобождение этой среды обитания. Есть основания считать, что в кишечнике микроорганизмы располагаются кластерно как в полостном, так и в пристеночном микробиотопе [8].

В каждом браш-препарате имеется свой диапазон изменений ПВМ между минимальными и максимальными количественными вариантами, присущими отдельным участкам СОЖ и ее состоянию в целом. Нельзя исключить возможности существования ряда сходных черт морфологической структуры пристеночных биотопов разных уровней гастро-интестинального тракта, вышеназванные свойства могут реализоваться и в пристеночном микробиотопе желудка; в таком случае, естественно одновременное наличие на поверхности СОЖ участков и с низкой, и с высокой ПВМ. Важнейшее значение плотности микробных популяций в процессах колонизации слизистых, в КРКС как «представителях» микробно-тканевого комплекса в браш-препарате, указывает на необходимость оценить не только максимальную ПВМ, но выявить наиболее характерную максимальную ПВМ в этом компоненте, что может быть определено по доле полей зрения (участков), занимаемых такой ПВМ, иными словами, по ее распространенности. «Распространенность максимальной ПВМ», которая указывает, насколько выявленная максимальная ПВМ является «характерной» для определенного компонента данного микропрепарата (и у конкретного больного), может быть оценена полуколичественно с помощью отдельной системы.

Следует отметить, что в фоне браш-препарата так же учитывалась максимальная ПВ рассеянной флоры -- между КРКС, избегая густых краев препарата. Учет данного признака в фоне требует осторожности, так как количество МФ, как и других клеточных элементов данного компонента, зависит не только от свойств поверхностных отделов СОЖ (различные количества жидкой слизи), но и от техники изготовления препарата, когда примерно одинаковые объемы материала могут быть распределены на большей или меньшей площади. К тому же, в отдельных участках по краям препарата формируются сгущения жидкой части материала, которые подлежат просмотру и описанию, но не могут быть учтены как «характерные». «Характерная максимальная ПВМ» в фоне препарата учитывалась визуально как наиболее часто встречающаяся, без использования системы определения «распространенности».

2. Система оценки «распространенности характерной максимальной ПВМ рассеянной микрофлоры»

Учет производился только в комплексах из разрушенных клеток и слизи.

1 балл -- максимальная для данного препарата ПВМ рассеянной МФ имеется в малом количестве полей зрения (от 1/8 до 1/4 просмотренных однотипных по составу компонентов полей). 2 балла -- максимальная ПВМ имеется в ряде полей зрения, но не во всех (примерно от 1/4 до 1/2 от общего количества). 3 балла -- максимальная для данного браш-препарата ПВМ значительно преобладает (даже в небольшом количестве однотипного материала необильного мазка), то есть является не только характерной максимальной ПВМ, но и преимущественным типом взаиморасположения МФ.

Если наиболее плотно колонизированные КРКС были очень мелкими (малая часть поля зрения) и единичными, данный тип плотности колонизации не считался «характерным» и выбирался другой, менее высокий тип, распространенность которого могла бы соответствовать, по крайней мере, 1 баллу.

В результате учета ПВМ рассеянной флоры, с помощью второй системы оценки, выявляются важные итоговые характеристики, прямо связанные с реальным количеством МФ: в КРКС -- «характерная максимальная ПВМ рассеянной микрофлоры» и ее «распространенность», в фоне препарата -- только «характерная максимальная ПВМ рассеянной микрофлоры».

Как видно из описания системы учета ПВМ (п.1), она рассчитана и для оценки массивных многослойных скоплений микроорганизмов, однако тесно расположенные бактерии выявлялись и в виде более плотных образований, как бы «склеенных» между собой микробных клеток, микроколоний-агглютинатов (МКА), которые, как правило, хорошо заметны на фоне значительно менее плотно расположенной флоры. Формирование МКА так же прямо связано с количеством МФ в нативном материале и может иметь важное значение, так как ряд вирулентных микроорганизмов использует свойство агглютинации (при отсутствии лизиса) в агрессивных целях, создавая высокие заражающие дозы на локальных участках слизистых оболочек; транзиторная и индигенная эубиотическая микрофлоры, образуя в слизистых наложениях бактериальные кластеры-микроколонии, по типу агглютинатов, используют это свойство в целях колонизации кишечной стенки [8]. Поэтому, несмотря на очевидность морфологического сходства МКА с участками ТРА и условность их визуального различения, количество МКА в браш-препарате заслуживает анализа с помощью отдельной, специально предназначенной для этого системы с учетом их величины.

3. Система количественной оценки микроколоний-агглютинатов.

Различали МКА по величине: «очень мелкие» -- несколько микробных клеток. «Мелкие» -- до 1/8 поля зрения. «Средние МКА» -- до 1/4 поля зрения. «Крупные МКА» -- до 1/2 поля зрения. «Массивные» -- более 1/2 поля зрения.

МКА могут быть выявлены и количественно учтены в КРКС, в «чистой» слизи и фоне препарата. Количественная оценка МКА проводилась в баллах.

1 балл -- МКА очень мелкие и встречаются крайне редко, что можно расценить как тенденцию к формированию МКА. 2 балла -- имеются единичные мелкие, средние МКА, 1-2 крупных. 3 балла -- выявляются множественные мелкие, средние МКА, малое количество крупных.

В результате использования описанных выше систем учета в КРКС можно получить итоговый «суммарный показатель смешанной флоры» путем суммирования показателей «характерной максимальной ПВМ рассеянной МФ», ее распространенности и «количественной оценки МКА»; в фоне препарата оценка «суммарного показателя смешанной флоры» не включает «распространенность характерной максимальной ПВМ».

Общепринятая в микробиологии окраска по Граму рекомендована как наиболее целесообразная для выявления микрофлоры в цитологических препаратах СОЖ [15]. Хорошо известно, что разные тинкториальные свойства микроорганизмов, выявляемые данной окраской, зависят от различного химического состава микробных клеток, который влияет на взаимодействие бактерий с факторами иммунитета. Так, иммуномодулирующие свойства нормофлоры связаны с синтезом грамположительными микроорганизмами мурамилдипептида, который оказывает стимулирующее воздействие на фагоциты. Липополисахарид О-антигена грамотрицательной флоры стимулирует синтез цитокинов, секреторных антител, интерферона иммунокомпетентными клетками (цит. по Бондаренко А.В. и др., 1998). Исходя из этого, в комплексе учитываемых признаков смешанной мукозной флоры СОЖ естественно выглядит и полуколичественная оценка грампринадлежности, «выраженности грамотрицательного компонента смешанной МФ».

5. Система оценки выраженности грамотрицательного компонента смешанной микрофлоры.

1 балл -- единичные грамотрицательные микробные клетки, встречаются крайне редко. 2 балла -- грамотрицательные бактерии выявлены в малых количествах (грамположительная флора значительно преобладает). 3 балла -- значительное количество грамотрицательной флоры (невозможно визуально определить, какая флора преобладает: грамположительная или грамотрицательная). 4 балла -- очевидное преобладание грамотрицательной флоры.

Лейкоциты являются обязательными участниками взаимодействия микробиоценоза и макроорганизма в поверхностных отделах СОЖ. В браш-препарате они могут быть представлены в различных количествах, распределяться по мазку неравномерно, располагаться разрозненно, в виде плотных скоплений.

С помощью данной системы можно оценить в баллах количество нейтрофилов, лимфоцитов в КРКС и в фоне препарата.

6. Система оценки количества лейкоцитов.

1 балл -- 1-5 лейкоцитов в очень редких полях зрения. До 15 лейкоцитов в единичных полях зрения. 2 балла -- 1-5 лейкоцитов в ряде полей зрения. Более 15 -- в очень редких полях зрения. 3 балла -- более 5 до 15 в ряде полей зрения. Более 15 в нескольких полях зрения. 4 балла -- более 15 почти в каждом поле зрения.

Описанные выше системы количественной оценки смешанной флоры и лейкоцитов поверхностных отделов СОЖ позволяют проанализировать с помощью статистических методов каждый из них и «суммарный показатель смешанной флоры». Во всех предлагаемых системах учета отсутствуют градации, соответствующие нулевым, так как во всех изученных браш-препаратах с наличием КРКС, оцениваемые признаки имелись, по крайней мере, в минимально выраженном виде. Предлагаемые показатели предоставляют возможность полуколичественной оценки ряда характеристик наиболее значимого компонента браш-препарата: комплексов из разрушенных клеток и слизи. Если таковой компонент в препарате отсутствует, но фон хорошо выражен, оценка фона препарата так же может принести полезную информацию. При наличии оптимально полноценного браш-препарата с достаточным количеством КРКС, а так же фона как возможно наиболее жидкой части слизистого покрова СОЖ, целесообразно оценить оба этих компонента.

Несомненно перспективными для разработки их учета представляются и такие признаки, как наличие различных морфотипов смешанной микрофлоры и их разнообразие, участие в формировании МКА, преимущественной локализации их в различных элементах браш-препарата, ассоциированности скоплений микроорганизмов с лейкоцитами.

Алгоритм полуколичественного анализа цитоморфологических эквивалентов взаимодействия пристеночного микробиоценоза и СОЖ в наиболее поверхностных ее отделах может выглядеть следующим образом.

1. Описание. По мере просмотра КРКС и фона препарата, в протоколе фиксируется: количество просмотренных полей зрения, в них: ПВМ рассеянной микрофлоры, размеры и количество МКА, выраженность грамотрицательного компонента МФ, количество лейкоцитов, количество хеликобактеров.

2. Итоговые оценки КРКС и фона препарата (по препарату в целом): «характерная максимальная ПВМ рассеянной флоры», «распространенность характерной максимальной ПВМ рассеянной МФ» (в фоне не учитывается), «количественная оценка МКА», «суммарный показатель смешанной микрофлоры», «выраженность грамотрицательного компонента смешанной микрофлоры», «количество хеликобактерий», «количество лейкоцитов».

Таким образом, если наиболее традиционный материал слизистой оболочки желудка -- отпечатки и «раздавленные» (краш) препараты -- содержат информацию преимущественно о состоянии эпителиальных элементов (пролиферация, дисплазия, атипия) и микрофлоре, колонизирующей глубокие отделы слизи, браш-препараты предоставляют возможность изучить морфологические эквиваленты взаимодействия СОЖ и пристеночного микробиоценоза в самых поверхностных, наиболее динамичных его отделах.

Браш-препараты, в совокупности с отпечатками и гистологическими срезами гастробиоптатов, представляют собой единый блок полноценного и разнообразного морфологического материала, получаемого в ходе эндоскопического исследования СОЖ, его элементы взаимосвязаны между собой и взаимодополняют друг друга, позволяют изучать процессы изменения СОЖ на разных уровнях их реализации -- от глубоких отделов СОЖ до самых поверхностных.

Оценка состояния микробиоценоза СОЖ, каким бы методом она не проводилось, не может служить задачей, отдельной от понимания того, что значит данное состояние для функционирования СОЖ, желудка и организма, чем поддерживается, как изменяется под влиянием лечебных мероприятий. Следовательно, для развития целостного понимания этих процессов, совершенно необходим полный набор информации, представляемый морфологическими методами исследования, которая будет содержать в себе как традиционные гистологические и цитологические оценки, так и малоиспользуемую пока цитоморфологическую информацию о состоянии микробиоценоза СОЖ.

Не конкурируя с возможностями микробиологических, молекулярно-генетических методов и не противореча им, цитоморфология микробиоценоза СОЖ может занять достойное место как на этапах первичной, неспецифической оценки, так и в комплексе методов специфической диагностики.

Представленный в данной работе ряд количественных показателей, предлагаемых для оценки браш-препарата СОЖ, очевидно, не является единственно возможным. Информация, заключенная в данном виде морфологического материала, далеко не исчерпана. Другими авторами могут быть разработаны иные критерии оценки цитологического материала СОЖ, в том числе, и браш-препарата. Важно то, что полуколичественная цитологическая оценка элементов пристеночного микробиоценоза слизистой оболочки желудка принципиально возможна, значима и перспективна.

Литература

1. Беляева О.П., Кокшаров В.Н. Возможности цитологической диагностики хронического гастрита // Новости клинической цитологии России. -- 2004. -- Т. 8.-- № 3-4.-- С. 2-4.

2. Бокуняева Н.И., Золотницкая Р.П. Желудочное содержимое / Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под общей ред. Е.А. Кост. -- М.: Медицина, 1968. -- С. 203-204.

3. Бондаренко А.В., Бондаренко Вл. М., Бондаренко В.М. Пути совершенствования этиопатогенентической терапии дисбактериозов // Журн. микробиол. -- 1998. -- № 5. -- С. 960-101.

4. Бондаренко В.М., Жалко-Титаренко В.П. Динамика формирования инфекционного очага в кишечнике // Журн. микробиол. -- 1991. -- № 8. -- С. 23-27.

5. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Липницкий Е.М. и др. Исследование пристеночной микрофлоры желудочно-кишечного тракта у человека в норме и патологии // Вестн. РАМН. -- 2004. -- № 2. -- С. 43-47.

6. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А. и др. Анализ штаммовой общности пристеночных биотопов желудочно-кишечного тракта // Вест. РАМН. -- 2004. -- № 6. -- С. 15-18.

7. Гинцбург А.Л., Ильина Т.С., Романова Ю.М. “Quorum sensing” или социальное поведение бактерий // Журн. микробиол. -- 2003. -- № 5. -- С. 86-93.

8. Григорьев А.В. Желудочно-кишечный тракт как среда обитания бактерий. Раздел 1. Морфология желудочно-кишечного бактериального биотопа. -- Москва-Киев, 2004.

9. Дубенская Л.И., Локтева М.Э., Баженов С.М. и др. Способ количественного учета мукозной флоры желудка в краш-препаратах // «Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей». Материалы Юбилейного 15 Международного Конгресса детских гастроэнтерологов России и стран СНГ / Под ред. Ю.Г. Мухиной, С.В. Бельмера. -- М., 2008. -- С. 195-196.

10. Захарченко М.П., Захарченко М.М., Захарченко В.М. Гигиеническая диагностика абиотических изменений микробиоценоза в современных условиях // Гиг. и сан. -- 2007. -- № 6. -- С. 26-28.

11. Ивашков Е.А., Писаренко Т.В. Комплексная диагностика инфекции, вызванной Helicobacter pylori с помощью метода иммуноферментного анализа // Информационный бюллетень «Новости Вектор-Бест». -- 2005. -- №. 36. -- С.13-14.

12. Казимирова А.А., Волосников Д.К., Бахарева Л.И. и др. Микробиоценоз желудка при хроническом гастрите у детей // Журн. микробиол. -- 2007. -- №. 2. -- С. 71-75.

13. Лабезник Л.Б., Хомерики С.Г., Морозов И.А. и др. Дрожжеподобные грибы в желудочной слизи при кислотозависимых заболеваниях // Эксперим. клин. гастроэнтерол. -- 2005. -- №.4. -- С. 27-32.

14. Лукина Т.А. Опухоли желудка // Руководство по цитологической диагностике опухолей человека / Под ред. А.С. Петровой, М.П. Птохова. -- М.: Медицина, 1976. -- С. 47-54.