Применение реакции угнетения биолюминесценции для оценки антагонистической активности бактериальных культур

Размещено на http://www.allbest.ru/

Применение реакции угнетения биолюминесценции для оценки антагонистической активности бактериальных культур

Кайнова Е.П.,

Калипарова М.П.,

Каблинова Т.В.,

Маслов Ю.Н.,

Галямова Л.А.

Введение

Антагонизм и синергизм - это неразрывно связанные стороны взаимоотношений между живыми организмами. Эубиоз, то есть равновесие между организмом человека и его нормальной микрофлорой, также как и баланс между микробными популяциями, возможны лишь при наличии равновесия между положительными и отрицательными взаимными влияниями. Поэтому вполне закономерно, что в настоящее время возникновение и развитие эндогенных инфекционных заболеваний, в частности, внебольничных пневмоний, принято рассматривать именно с позиций нарушения баланса между макроорганизмом и микрофлорой [1]. Снижение лимитирующего влияния иммунной системы приводит к активизации и размножению условно патогенной аутофлоры. При этом виды, способные к более активному размножению и колонизации, в конечном счете, становятся причиной развития инфекционного процесса. Нечто подобное происходит и при экзогенном инфицировании нестерильных локусов организма человека, когда возбудитель должен преодолеть конкурентное влияние аутофлоры. Здесь, наряду с другими факторами врожденной и приобретенной вирулентности, важную роль должна играть антагонистическая активность бактерий, то есть их способность блокировать либо замедлять размножение иных видов [2, 5]. Механизмы проявления антагонистической активности могут быть весьма разнообразны: конкуренция за трофические субстраты и/или сайты адгезии, высокая активность ферментов, изменение окислительно-восстановительного потенциала и уровня рН среды, выделение антибиотикоподобных метаболитов и т.д. Результатом межмикробных взаимодействий является формирование доминирующего вида или ассоциации.

В настоящее время антагонистическая активность рассматривается как один из дополнительных факторов вирулентности и персистенции условно патогенных микроорганизмов.

Цель работы - оценка антагонистической активности бактериальных культур, выделенных из нижних дыхательных путей у пациентов, находящихся в отделении реанимации с диагнозом "пневмония".

Материалы и методы. Изучены 54 микробные культуры, выделенные из мокроты пациентов, находившихся в отделении реанимации и интенсивной терапии многопрофильного стационара с диагнозом "Пневмония". Среди них: 14 культур Pseudomonas aeruginosa, 13 - Klebsiella pneumoniae, 9 - Escherichia coli, 7 - Acinetobacter baumanii, а также 11 культур Staphylococcus aureus. Все они были выделены в диагностически значимых концентрациях из проб мокроты, прошедших бракераж по внешнему виду и результатам бактериоскопии.

Для изучения антагонистической активности применяли классический метод отсроченного антагонизма, а также тест ингибирования биолюминесценции [3, 4]. В первом случае оценивали способность культур угнетать рост тест-штаммов: Ps.aеruginosa, E.coli M-17, E.coli O-127, S.aureus и Cand.albicans. Во втором случае использовали микробиологический индикатор токсичности (МИТ), разработанный в ИЭГМ УрО РАН под руководством профессора Р.А. Пшеничнова. Принцип действия МИТ состоит в оценке изменения биолюминесценции генноинженерного штамма E. сoli lum+ C-50 под воздействием изучаемых культур и их кратных разведений с помощью люминометра "Биотокс-10". Биометрическую обработку данных проводили с использованием компьютерных программ "Microsoft Excel" и "Биостат". бактериальный дыхательный пневмония

Результаты. Данные, полученные при использовании всех методологических подходов, свидетельствовали о наличии достаточно выраженных антагонистических свойств у микрофлоры, выделенной из нижних дыхательных путей у больных внутрибольничной пневмонией. Так, тест подавления биолюминесценции показал, что все 54 изученные культуры обладали антагонистической активностью в отношении штамма E.coli lum+ C-50 (см.табл.1). Различия между ними сводились лишь к степени подавления активности тестштамма, а также к срокам проявления и стабильности антагонистических свойств.

Таблица 1. Показатели угнетения биолюминесценции исследуемыми культурами, % (М±m).

Наиболее выраженное угнетение тест-штамма вызывали культуры Ps.aeruginosa, чье действие было стабильно высоким (показатели, замеряемые в течение 2-х часов, были практически равны). Подобным эффектом характеризовались и культуры A. baumanii. Средние показатели культур ацинетобактеров не давали статистически значимых различий с аналогичными значениями синегнойной палочки. Примечательно, что хотя Ps.aeruginosa является общеизвестным антагонистом, культуры ацинетобактеров практически не уступали псевдомонадам по показателям антагонистической активности. Активность культур псевдомонад и ацинетобактеров, разведенных в 2 раза (в таблице не показано), снижалась лишь на 10-15%.

Первоначальные показатели энтеробактерий (клебсиелл и эшерихий) оказались достоверно ниже, чем у псевдомонад и ацинетобактеров (табл.1), однако ко 2-му часу наблюдения они достигли уровня 80% и более, что позволяет предположить наличие тонких, специфичных для родственных бактерий механизмов подавления метаболизма тест-штамма. При разведении культур их активность снижалась на 20-30% (у эшерихий - до 40%), что можно трактовать, как свидетельство низкой антагонистической активности.

Культуры стафилококка характеризовались самыми низкими показателями антагонистической активности. Кроме того, в последних измерениях отмечался противоположный эффект - усиление биолюминесценции. Этот эффект связывают, прежде всего, с действием компонентов питательной среды, которые проявляют свой стимулирующий эффект при отсутствии антагонистической активности микробов.

Показатели отсроченного антагонизма свидетельствовали о более низкой чувствительности этого метода (табл.2). Только показатели псевдомонад соотносились с описанными выше; у других культур отмечали сужение спектра активности и низкие цифровые показатели.

Таблица 2. Показатели угнетения тест-штаммов исследуемыми культурами, мм (М±m).

Полученные результаты вполне соотносятся с полученными ранее данными об антагонистической активности возбудителей внебольничных пневмоний и подтверждают тезис о значимости данного признака при развитии инфекционного процесса в легких [2].

Выводы

1. Диагностически значимая микрофлора, выделенная из нижних дыхательных путей больных пневмониями, обладает достаточно выраженной антагонистической активностью.

2. Наиболее чувствительным и информативным способом выявления антагонизма является тест угнетения биолюминесценции.

3. Неоднородность культур по выраженности антагонизма и срокам его проявления указывают на множественность механизмов реализации этого признака.

4. Дальнейшее изучение антагонистических свойств условно патогенной микрофлоры позволит глубже оценить роль этого фактора в возникновении и развитии инфекционных процессов, вызванных данными микроорганизмами.

Литература

1. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Перунова Н.Б., Усвяцов В.Я., Черкасов С.В. Симбиоз и его роль в инфекции // Екатеринбург, УрО РАН. 2011.- 302 с.

2. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н., Несчисляев В.А., Черешнев В.А. Антагонистические и адгезивные свойства условно патогенной микрофлоры, выделенной из нижних дыхательных путей при внебольничных пневмониях // Вестник уральской медицинской академической науки. №1 (38). 2012. С.79-81.

3. МУК 4.2.2602-10. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков. Методические указания. - М., 2010.

4. Патент 2187801 Россия А 61 К 35/74, G 01 N 33/15. Способ определения антагонистической активности пробиотиков. В.А. Несчисляев, Р.А. Пшеничнов, Е.Г. Арчакова, Л.П. Чистохина, И.В. Фадеева. 2002.

5. Хуснутдинова Л.М. Модификация биологических свойств бактерий в условиях ассоциации индигенной и патогенной микрофлоры // Вестник ОГУ, 2006. - № 12. - С.11-15.

Размещено на Allbest.ru