Получение биорезорбируемых образцов костных имплантов на основе октакальциевого фосфата

Размещено на http://www.allbest.ru/

Курсовая работа

Получение биорезорбируемых образцов костных имплантов на основе октакальциевого фосфата

Самборская Маргарита

Повреждения и заболевания костных тканей часто являются причиной смертности, временной нетрудоспособности и развития инвалидности. Для восстановления функции костных тканей и поврежденных органов необходимо использовать костные имплантаты. В идеальном случае материал должен быть биологически совместимым с тканью, не отторгаться организмом как инородное тело, и быть биологически активным. Костная ткань представляет собой композит на основе гидроксиапатита кальция Са10(РО4)6(ОН)2 (ГА) и белка коллагена. Кальцийфосфатные материалы наиболее перспективные для восстановления и замещения дефектов костных тканей, и поэтому интенсивно развивается разработка биоматериалов на основе фосфатов кальция (ФК).

Долгое время наиболее широко применяемым в медицине материалом для восстановления костных повреждений являлся синтетический ГА из-за его подобия неорганической составляющей костной ткани. Но керамические материалы на основе ГА имеют низкую скорость резорбции в тканях организма и слабо способствуют росту новой ткани, а также обладают низкой прочностью и часто образуют трещины. В последние годы большой интерес вызывает новая концепция реконструкции костных тканей, которая основана на использовании материалов, постепенно замещаемых новообразующейся костной тканью, при этом имплант содержит необходимые для роста кости элементы и только на первых стадиях осуществляет опорную функцию. Организм сам может восстанавливать поврежденную ткань, если для этого созданы надлежащие условия. Данный регенерационный подход требует от современных биоматериалов, прежде всего, ускорения процесса срастания, замены имплантата новой костной тканью и остеостимулирующего действия материала имплантата.

В настоящее время на основе гидроксиапатита и более растворимого трикальциевого фосфата Са3(РО4)2 (ТКФ) получают биоматериалы с улучшенными биоактивными свойствами, также используют способы химической модификации апатита. Другой подход предлагает использовать более растворимые фосфаты кальция такие как трикальциевый фосфат Са3(РО4)2 (ТКФ). Пирофосфат кальция Са2Р2О7 (ПФК) и трикальциевый фосфат деградируют в биологической среде, однако керамические материалы на их основе мало изучены.

Целью работы является получение композита с конечным составом ТКФ/ПФК, предназначенного для замены костных тканей и обладающего повышенным уровнем резорбции по сравнению с ГА. В качестве прекурсора для получения порошкового материала для изготовления биокерамики предложено использовать октакальциевый фосфат Ca8(HPO4)2(PO4)4•5H2O (OКФ), мольное соотношение Ca/P которого составляет 1.33. Известно, что при температурной обработке выше 700°C, ОКФ переходит в смесь ТКФ и ПФК.

В работе были поставлены и решены следующие задачи:

1. Выбор метода синтеза ОКФ и его оптимизация (pH, температура, тип буферного раствора)

2. Термолиз ОКФ

3. Получение резорбируемой керамики из продуктов термического разложения ОКФ; исследование свойств керамики (механическая прочность)

Научная новизна данной работы состоит в следующих положениях:

1. Рассмотрены рН - Т закономерности синтеза ОКФ из растворов из брушита.

2. Установлена кинетическая кривая зависимости степени превращения брушита в ОКФ в кальций-ацетатном буфере при pH=5.55.

3. Выявлено оптимальное время выдержки образцов в кальций-ацетатном буфере при котором наибольшее количество брушита превращается в ОКФ.

4. Показаны механические характеристики образцов с и без макропористости, полученных только методом гидролиза в кальций-ацетатном буфере, а также образцов, дополнительно подверженных термической обработке (керамических образцов).

Практическая значимость результатов работы заключается в следующем:

1. Апробирован быстрый метод синтеза ОКФ путем гидролиза брушита в ацетатном буферном растворе при t=60єС и рН=5.55.

2. Образцы обладают значимой прочностью (плотные), а пористые достаточной прочностью, что позволяет использовать их в дальнейшей работе по тканевой инженерии.

Личный вклад автора в представляемую работу состоит в:

1. Критическом обзоре и анализе литературных данных.

2. Синтезе всех использованных в работе составов, приготовлении образцов для исследований.

3. Обработке данных и систематизации полученных результатов.

Литературный обзор

Строение и свойства костной ткани

Кость - сложный материал с несколькими уровнями организации (рис. 1). Основными «строительными» единицами кости является остеоны.

Рис. 1. Строение костной ткани

Надкостница покрывает кость снаружи и прочно прикреплена к ней толстыми пучками коллагеновых волокон, которые проникают и вплетаются в слой наружных общих пластинок кости. Эти волокна придают тканям механическую прочность на растяжение. В общем виде минеральный состав кости приближенно можно выразить формулой (Са,Na)10-x-y(НРО4)x(СО3)y(PO4)6-x-y(OH)2-x-y-z(Cl,F)z, причем с возрастом количество CO32- увеличивается.

Кость является сложноорганизованным композиционным материалом минерал-биополимер и обладает высокой прочностью, большой устойчивостью к образованию трещин и, в основном, низкой плотностью ~ 2г/см3. Характеристики костной ткани меняются в зависимости от типа кости, характера нагрузок, возраста человека.

Уровень развития современной науки пока не позволяет создать материал, сочетающий прочностные и биологические характеристики, подобные костной ткани. Однако частично удается решить эту проблему, подбирая для каждого конкретного случая заменяющий материал.

Материалы, предназначенные для замены костной ткани

Самый распространенный подход к замещению поврежденных тканей и органов - выбор известных материалов для изготовления имплантатов. С этой целью широко используют металлы и их сплавы с высокими механическими свойствами, например титан. Благодаря эластичности и легкости популярными являются также имплантаты из полимерных материалов. Но все они обладают рядом недостатков, связанных с их воздействием на живую ткань организма: после имплантации разрушаются и изнашиваются металлические материалы или окружающие их элементы биологических тканей и органов, что обусловлено коррозией металлов; полимерные материалы теряют эластичность и прочность. Применение протезов из них часто вызывает аллергические реакции организма, возможно, его разрушение и накопление продуктов взаимодействия в живой ткани, что может приводить к нежелательным канцерогенным и иммунологическим эффектам. Керамика обладает сочетанием таких свойств, как биосовместимость, высокая механическая прочность, износо- и коррозионная стойкость. Недостатками являются отсутствие эластичности, а также различие в химическом составе по сравнению с естественной костью. Все многообразие биоматериалов можно классифицировать по нескольким признакам.

Классификация биоматериалов

С точки зрения действия биоматериалов на ткани организма, биосовместимые материалы разделяют на биотолерантные, биоинертные и биоактивные. К биотолерантным материалам относят металлы, металлические сплавы и полимеры, к биоинертным - керамику на основе оксида алюминия и циркония, а к биоактивным - материалы на основе ФК, например ГА, ТКФ и пр.

С точки зрения действия тканей организма на имплантат можно выделить материалы биодеградируемые - деградирующие под действием среды организма (металлические сплавы, полимеры), биорезистивные-устойчивые к воздействию тканей и среды организма (ГА) и биорезорбируемые-являющиеся источником для формирования фосфатов кальция в организме (ТКФ, фосфатные биостекла). Возможно, именно материалы на основе резорбируемых фосфатов кальция обеспечивают наиболее быстрое восстановление функций костной ткани после операции.

Требования к биоматериалам

Материал, наиболее пригодный для имплантации, должен удовлетворять требованиям:

Во-первых, отсутствие токсичных для организма продуктов распада и метаболизма.

Во-вторых, хорошая биодеградируемость, отсутствие воспалительных реакций и срастание с костной тканью, а также способность побуждать костные клетки остеобласты к формированию кости.

В-третьих, наличие сквозных пор размером 100-150 мкм для лучшего срастания.

К тому же имплант должен быть сходен с костью по механическим характеристикам. Но пока сложно имплантировать конструкцию из биоактивного материала в организм с поврежденной костной тканью из-за низких показателей механической прочности, которые намного ниже, чем у естественной костной ткани. Поэтому керамические имплантаты пока используют только для органов, не несущих значительные физиологические нагрузки.

В настоящее время разработано и изучено много вариантов использования керамических материалов в организме: от спеченных имплантатов, несущих физиологические нагрузки, до цементов, применяемых для пластики костных дефектов, керамических средств локализованной и пролонгированной доставки лекарственных препаратов в организм, биоактивных покрытий, обеспечивающих интеграцию биологически инертного имплантата с костной тканью, и пористых матриксов для клеточных технологий реконструкции костных тканей.

Фосфаты кальция и материалы на их основе

Несмотря на то, что именно гидроксиапатит среди всех фосфатов кальция наиболее подобен по химическому составу костной ткани, достаточно большое число ФК, отличающихся от ГА, находят применение в медицинской практике. Важными параметрами, характеризующими фосфаты кальция, является отношение Са/P. В общем случае, чем больше отношение Са/Р, тем менее растворимым является ФК. Следовательно, материал, полученный на его основе, будет характеризоваться низкой степенью резорбции в среде человеческого организма.

При температуре человеческого тела в контакте с водной средой устойчивы только четыре фосфата кальция: нерастворимые СаНРО4 (монетит), гидроксиапатит; растворимые Ca(H2PO4)2 и Ca(H2PO4)2·Н2О.

Поэтому при изготовлении материала, заменяющего костную ткань, возможно использование, помимо гидроксиапатита, таких фосфатов кальция как ДКФД, ОКФ, ПФК, АФК и ТКФ.

Октакальциевый фосфат

Октакальциевый фосфат Са8(НРО4)2(РО4)4·5Н2О (ОКФ) - один из ортофосфатов кальция, часто образуется как промежуточный продукт при получении термодинамически более устойчивых фаз (например, ГА).

ОКФ имеет важное биологическое значение, поскольку является относительно стабильным компонентом зубных и мочевых камней. Считается, что октакальциевый фосфат является прекурсором при формировании костного апатита.

Синтез ОКФ из водных растворов производят, используя в качестве растворимых солей Ca(CH3COO)2, Ca(NO3)2, Ca(H2PO4)2•H2O, некоторые другие соли кальция, а в качестве растворимых фосфатов смесь Na2HPO4/NaH2PO4, KH2PO4, NaH2PO4. Для поддержания требуемого уровня рН используют буферные растворы или поддерживают заданный уровень pH с помощью pH-стата.

Другая большая группа методов синтеза ОКФ основана на гидролизе таких малорастворимых фосфатов, как б-ТКФ или АФК (в слабощелочной среде), брушита или монетита (в слабокислой среде).

Октакальциевый фосфат является метастабильной фазой, он распадается до брушита в кислых растворах и гидролизуется до ГА в нейтральной и щелочной области pH. При гидролизе нестехиометрического ОКФ происходит образование кальцийдефицитного гидроксиапатита с соотношением Ca/P = 1,59.

Октакальциевый фосфат является достаточно стабильной на воздухе при комнатной температуре фазой. Однако, при нагревании он претерпевает следующие изменения:

Са8(НРО4)2(РО4)4·5Н2О > (~150єС) Ѕ Са10(РО4)6(ОН)2 + 3СаНРО4 > (~ 200єС) Ѕ Са10(РО4)6(ОН)2 + 3/2г-Са2Р2О7 > (~ 600єС) 2Са3(РО4)2 + в-Са2Р2О7

ОКФ обладает остеокондуктивными свойствами, т.е. способен инициировать образование новой костной ткани. Однако, вследствие невозможности термической обработки ОКФ, производить из него керамические имплантаты не представляется возможным. Поэтому пока основным материалом для замены костной ткани на основе ОКФ являются гранулы.

Анализ литературы указывает на перспективность поиска новых резорбируемых композиционных материалов, отличных от традиционной бифазной керамики ГА/ТКФ. Помимо ТКФ другой фазой композита может стать ПФК.

Экспериментальная часть

Материалы и методы

Материалы: Ca(NO3)2*4H2O (четырехводный нитрат кальция, хч, Лабтех); (NH4)2HPO4 (гидрофосфат аммония, хч, Лабтех) дистиллированная вода; водный раствор уксусной кислоты с концентрацией 0.2М; водный раствор 0.1М ацетата кальция, колбы пластмассовые плоскодонные и круглодонные, сито, воронки пластмассовые, ступка и пестик, вакуумый фильтр, пипетка, линейка измерительная, весы, магнитная мешалка с режимом нагрева, термометр, штангенциркуль, сушильный шкаф, муфельная печь для высокотемпературного обжига, прессформа и пресс фирмы Carver, твердомер ТШ-2 для измерения механических характеристик образцов, pHметр-ионометр с комбинированным водородным электродом (для измерения pH), кальциевый электрод и электрод сравнения (для измерения pCa), рентгеновская установка ДРОН-3М, растровый электронный микроскоп Leo Supra.

Методы: растровая электронная микроскопия, рентгенофазовый анализ, ионометрия растворов, механические испытания.

Порядок выполнения эксперимента

Синтез брушита

На первом этапе получили брушит по реакции:

(NH4)2HPO4+ Са(NO3)2·4H2O > CaHPO4•2H2Ov+2NH4NO3 + 2H2O

Для этого взяли 41.16г Сa(NO3)2*4H2-O и растворили в 250 мл дистиллированной воды, перемешивая на магнитной мешалке в течение 20 мин. Получили слегка мутный раствор. Взяли 23.02г (NH4)2HPO4 и растворили в 250 мл дистиллированной воды, перемешивая на магнитной мешалке в течение 5 мин. При растворении (NH4)2HPO4 колба слегка нагревается и чувствуется легкий запах аммиака. Таким образом, мы получили 250мл 0.5 молярного раствора Сa(NO3)2*4H2O и 250мл 0.5 молярного раствора (NH4)2HPO4.

После этого мешая на магнитной мешалке раствор (NH4)2HPO4 приливаем медленно раствор Сa(NO3)2*4H2O. Порядок приливания объясняется необходимостью избежать образования малорастворимых термодинамически устойчивых фаз (с ростом отношения Ca/P растворимость фосфатов кальция уменьшается). Раствор моментально белеет. Образуется брушит СaHPO4*2H2O. Помешав раствор 20 мин, даем осадку СaHPO4*2H2O осесть.

Далее проводим несколько актов декантации с целью удаления остатков маточного раствора (содержащего NH4NO3). Полученную суспензию отфильтровываем на вакуумном фильтре с использованием 2 фильтров «черная лента» (максимальный размер пор) для максимально быстрого процесса фильтрации. В колбе остается относительно прозрачный раствор, а СaHPO4*2H2O остается на фильтре. Затем аккуратно промываем СaHPO4*2H2O водой и ацетоном для лучшего удаления воды. Полученную пасту просушиваем 2 дня при комнатной температуре (T=22єC).

Было получено 25.4г порошка брушита (выход 85%). Был проведен рентгенофазовый анализ полученного брушита (аппарат ДРОН-3М). Анализ полученного вещества показывает, что был получен почти чистый брушит (рис. 2а). В качестве подготовки к прессованию брушит был подвергнут дезагрегации (протирали через сито с размером пор 200 микрон) с целью получения мелкогранулированного порошка.

Приготовление Ca/ацетатного буфера с pH=5.6

Для получения Ca/ацетатного буфера взяли 50мл 0.2 молярной CH3COOH и 450мл 0.1 молярного (CH3COO)2Ca и слили вместе. Оценку динамики изменения значения pH проводили c помощью pHметра-ионометра “Эксперт 001” с использованием комбинированного электрода. Электрод был предварительно откалиброван растворами с pH=9.18 и pH=4.01. костный ткань имплантат микроскопия

Изготовление прессованных образцов

Для получения компактных образцов из брушита при изготовлении каждой таблетки брали 0.22г порошка брушита и добавляли 0.1мл Ca/ацетатного буфера с pH=5,6 с достижением пасты вязкой консистенции. После этого образцы подверглись прессованию на прессе в течении t=1мин при давлении в 400МПа. Таким образом, сделана серия таблеток (10-15 шт.). После этого таблетки сушились на воздухе в течение 12 часов. Данные РФА показали, что никаких значимых изменений в составе образцов не происходит ввиду малого количества жидкости, которая остается после акта прессования. Полученные таблетки использовали для дальнейших экспериментов.

Получение бифазного материала на основе брушита и октакальциевого фосфата

В качестве реакции консолидации выступал процесс гидролиза брушита в октакальциевый фосфат (ОКФ, Ca8(HPO4)2(PO4)4•5H2O):

8CaHPO4•2H2O+2CH3COONa > Ca8(HPO4)2(PO4)4•5H2O+2NaH2PO4+2CH3COOH+ 11H2O

Пять из полученных таблеток использовались для исследования изменения состава образцов при выдержке в Ca/ацетатном буфере в зависимости от времени выдержки.

Для этого использовали серию таблеток брушита и положили в закрытую емкость со 100мл предварительно нагретого до t=60°C Ca/ацетатного буфера. Времена выдержки образцов составило t1=0.5ч; t2=1.5ч; t3=3ч; t4=4.5ч; t5=6ч.

Было выявлено, что наибольшее количество ОКФ образуется в интервале 1.5ч-4.5ч.

По истечении 0.5ч рефлексов ОКФ по данным РФА обнаружено не было, а после 4ч ОКФ начинает деградировать. При протекании времени t=12ч брушит полностью превращается в монетит, который характеризуется меньшей склонностью к гидролизу, что говорит о нецелесообразности использования больших времен протекания реакции.

Дальнейшие исследования превращения брушита в ОКФ при выдержке образцов в течение времен t6=1.5ч; t7=2ч; t8=2.5ч; t9=3ч; t10=3.5ч; t11=4ч; t12=4.5ч позволили построить кинетическую кривую превращения брушита в ОКФ и выявить оптимальное время выдержки образцов в 3ч. Это время является максимумом кинетической кривой. Данные получены методом РФА, избранные результаты которого представлены на рис.2.

Измерение изменения pH брушита и измерение рСa брушита в Ca/ацетатном буфере.

Существенных изменений pH не обнаружено. В буферном растворе pH равен 5.6. Концентрация кальция в растворе ацетатного буфера была равна 0.01 моль (pCa=2). Значительных отклонений при добавлении в буфер брушита не обнаружено.

Изготовление больших образцов для дальнейших исследований.

Изготовляем 4 образца - два с макропористостью и два без нее. Берем 1г брушита и 0.5 мл Ca/ацетатного буфера (который пришлось делать заново, поскольку предыдущий зарос плесенью) и достигаем вязкой консистенции, размешивая пасту. Прессуем образец при тех же условиях как и меньшие образцы, используя другую форму для прессования.

После этого делаем образцы с макропористостью. Для этого берем 0.5г мелкозерненого KCl и 0.5г брушита и добавляем к смеси 0.5мл Ca/ацетатного буфера, после чего образец так же прессуем.

Измерение геометрических параметров проводили с помощью штангенциркуля, а массы образцов с помощью весов. Данные образцов занесены в таблицу 1.

Таблица 1. Геометрические параметры.

После получения образцы поместили в Ca/ацетатный буфер на 3ч при t=60єC, затем проводили сушку образцов и повторно измеряли геометрических параметров и массы образцов (Таблица 2.).

Таблица 2. Геометрические параметры.

Обжиг образцов 2 и 3 провели в керамической тигле в печи для обжига при температуре 1100°С и времени 3ч.

При обжиге осуществляется серия реакций:

Са8(НРО4)2(РО4)4·5Н2О > (~150єС) Ѕ Са10(РО4)6(ОН)2 + 3СаНРО4 >(~ 200єС) Ѕ Са10(РО4)6(ОН)2 + 3/2г-Са2Р2О7 > (~ 600єС) 2Са3(РО4)2 + в-Са2Р2О7

При обжиге ОКФ разлагается на ТКФ и ПФК. (трикальциевый фосфат и пирофосфат). Tнагрева=2ч 34мин (с температуры 22°С до температуры 1100°С). Tвыдержки=3ч. Vнагрева печи=7°C/мин.

Измерение механической прочности образцов и проведение микроскопии на образцах

Результаты:

По данным механических испытаний (испытание на микротвердость, испытательная машина ТШ-2) наибольшую прочность продемонстрировал образец 1 - микротвердость 3кг/мм2. Образец 2 продемонстрировал прочность 1.5кг/мм2. Макропористые продемонстрировали микротвердость в 0.5кг/мм2. Для сравнения микротвердость компактного вещества костной ткани нижней челюсти человека оценивается в 10кг/мм2. Данные значения представляются достаточными для того, чтобы использовать полученные материалы для биомедицинского применения.

Проведение микроскопического анализа Данные микроскопии и РФА представлены на рис. 3.

По данным РФА компактный образец представлен пирофосфатом кальция с небольшой примесью ортофорсфата кальция. Макропористый образец представлен преимущественно ортофорсфатом кальция и ренанитом калия, который образуется по реакции взаимодействия KCl и Ca2P2O7. Хлорид-ионы удаляются в виде хлороводородной кислоты. В таблице 3 представлено относительное содержание фосфора, калия и кальция в макропористой керамике.

Таблица 3. Содержание ряда элементов в смеси.

Приведенные данные демонстрируют, что ренанит занимает значительную долю образца по массе, что неплохо, так как ренаниты обладают лучшими параметрами биорезорбции.

Выводы

Полученные образцы удовлетворяют необходимым механическим критериям (обладают достаточной микропрочностью) и могут подвергаться биологическим испытаниям.

Обсуждение выводов:

В зависимости от условий возможно использование как более прочных образцов ,так и менее прочных, поскольку более микротвердые образцы могут обладать меньшей биорезорбируемостью по сравнению с менее микропрочными.

Макропористые образцы должны обладать большей биорезорбируемостью по сравнению с микропористыми образцами.

Керамический макропористый образец хотя и показывает одинаковый результата как компактный макропористый, должен обладать большей износо- и трещиностойкостью по сравнению с компактным образцом.

Наиболее биорезорбируемым, исходя из микроструктуры и микротвердости, должен оказаться макропористый компактный образец на основе ОКФ.

Список литературы

1. Кукуева Е.В. Резорбируемая композиционная керамика на основе продуктов термолиза октакальциевого фосфата. Магистерская диссертация. ФНМ МГУ. 2010.

2. Путляев В.И. Современные биокерамические материалы. Соровский образовательный журнал, том 8, №1, 2004 стр. 1-17.

3. Ларионов Д.С. Путляев В.И. Низкотемпературные методы получения кальцийфосфатных биоматериалов. Вестник РФФИ, том 4(72), 2011 стр. 57-61.

Размещено на Allbest.ru