Изучение мутагенных свойств фармакологических веществ

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ВИТЕБСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Кафедра стандартизации лекарственных средств с курсом ФПК и ПК ВГМУ

Изучение мутагенных свойств фармакологических веществ

Проверил:

старший преподаватель

Веремчук О.А.

Подготовила:

студентка 13 группы 4 курса

Федорович К.Н.

Витебск, 2019

Введение

средство фармакологический мутагенность

Исследование мутагенности новых фармакологических средств и вспомогательных компонентов лекарственных форм проводятся на этапе доклинического изучения и предусматривают оценку способности лекарственных средств к индукции разных типов мутаций в зародышевых и соматических клетках.

С этой целью используют комплекс методов, выполняемых на разных тест-объектах. Опыт работы по тестированию лекарств, накопленный различными группами исследователей с момента выхода первой редакции «Методических рекомендации по оценке мутагенности новых лекарственных средств» (1981), показывает, что на доклиническом этапе исследования целесообразно применение следующего набора тестов для оценки лекарственных средств на мутагенность:

-тест на индукцию генных мутаций (тест Эймса на Salmonella typhimurium или учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций/соматической рекомбинации у дрозофилы);

-тест на индукцию хромосомных повреждений in vivo (учет хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих либо учет микроядер в клетках костного мозга или периферической крови млекопитающих).

При условии получения отрицательных результатов препарат может быть допущен к первой фазе клинических испытаний. Перед второй фазой клинических испытаний необходимо провести изучение способности лекарственного препарата индуцировать мутации в зародышевых клетках мышей (доминантный летальный тест). В случае отсутствия мутагенной активности можно продолжить клинические испытания. Если в отдельных тестах получены неоднозначные, но воспроизводимые результаты, то на заключительных этапах клинических испытаний следует провести исследование уровня хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови леченных больных.

Исследование мутагенных свойств фармакологических средств, так же как и экспертную оценку результатов, должны проводить специалисты, имеющие достаточные профессиональные навыки по применению методов, составляющих систему тестирования. Данные методические рекомендации описывают комплексную систему проверки генетической активности новых лекарственных средств, но не является пособием для освоения методов. Последние в должном объеме можно освоить только в результате стажировки в лабораториях соответствующего профиля.



Общие подходы

Принципы отбора фармакологических средств для испытания на мутагенную активность.

Тестированию на мутагенную активность подвергаются новые оригинальные фармакологические средства, созданные химическими, биотехнологическими, генноинженерными и иными способами, включая полученные из сырья природного происхождения. Новые фиксированные комбинации фармакологических средств, планируемые для широкого клинического применения, при структурном сходстве компонентов комбинации с известными канцерогенами, мутагенами или их метаболитами также подвергаются испытанию. Для анализа структурного сходства используется, во-первых, представительная база данных о мутагенных свойствах широкого круга химических соединений, и, во-вторых, специальные компьютерные программы [1,2].

Пути введения фармакологического средства, выбор доз, объекты исследования

Пути введения исследуемого фармакологического средства должны соответствовать планируемому способу приема лекарства человеком.

Если предполагается возможность энтерального и парентерального введения, можно использовать внутрибрюшинный, подкожный или внутримышечный способы введения. Фарма- кологические средства перорального применения изучают при внутрижелудочном пути введения. Изучение мутагенной активности ингаляционных анестетиков, мазей и т.п. проводят в условиях предполагаемого применения (ингаляционное, накожное) и при парэнтеральном введении.

Исследуемые фармакологические средства растворяют в дистиллированной воде или физиологическом растворе. Водонерастворимые препараты вводят с Твином-80 или используют растворители (этиловый спирт, диметилсульфоксид в конечной концентрации до 5 %); для перорального введения порошкообразных лекарств можно использовать растительное масло или 1% водный раствор крахмала.

Методы тестирования мутагенности фармакологических средств

1. Учет аберраций хромосом в клетках костного мозга млекопитающих

Цель исследования и принцип метода

Выявление и количественная оценка потенциальной цито-генетической активности фармакологических средств в клетках костного мозга млекопитающих.

В основе метода лежит регистрация видимых структурных нарушений хромосом в клетках на стадии метафазы. Клетки костного мозга характеризуются высоким уровнем митотической активности, спонтанная частота клеток с хромосомными повреждениями, включая гепы, составляет 1-2,5%

Процедура тестирования 

Лабораторные животные. 

Эксперименты проводят на самцах и самках мелких лабораторных грызунов. Предпочтительно использование генетически однородных животных, не менее 5 особей в каждой контрольной и экспериментальной группе. 

Животные должны содержаться при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. 

Проведение эксперимента.

В первой серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей Суточной терапевтической для человека и в субтоксической дозе, вводят однократно только самцам с фиксацией клеточного материала через 24 часа после введения. 

Во второй серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей суточной терапевтической для человека, вводят самцам и самкам ежедневно на протяжении 4-5 суток. Фиксацию клеточного материала осуществляют через 6 и/или 24 часа после последнего введения в зависимости от фармакокинетических особенностей испытуемого препарата.

Контроли

В качестве позитивных контролей целесообразно использовать циклофосфамид в дозе 20 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении или любой другой известный агент, заведомо обладающий цитогенетической активностью. 

Негативным контролем является используемый растворитель. 

Приготовление цитогенетических препаратов

Методика выделения клеток костного мозга и приготовления препаратов для цитогенетического анализа подробно описаны в соответствующих руководствах и ранее опубликованных методических рекомендациях.

Микроскопический анализ.

Анализируют 100 метафаз от каждого животного. Анализу подвергаются округлые метафазные пластинки без наложений хромосом с модальным числом 40 - для мышей, 42 --для крыс. Учитывают число одиночных и парных фрагментов, хроматидных и хромосомных обменов, ахроматических пробелов (гепов) и разрывов по центромере, число клеток с множественными повреждениями и клеток с полной деструкцией хромосом. 

Оценка результатов

Оценку результатов цитогенетического анализа проводят путем сопоставления долей клеток с хромосомными аберрациями в контрольной и опытных сериях эксперимента. Сравнение долей клеток с гепами и разрывами по центромере Следует рассматривать в качестве дополнительных критериев цитогенетической активности исследуемого препарата. 

Статистическую обработку проводят согласно общепринятым рекомендациям.

2. Учет микроядер в клетках млекопитающих

Цель исследования и принцип метода

Выявление и количественная оценка потенциальной цито-генетической активности фармакологических средств в поли- хроматофильных эритроцитах костного мозга млекопитающих. 

Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами. Спонтанная частота клеток с микроядрами составляет 0,1-0,2%.

Процедура тестирования.

Лабораторные животные. 

Эксперименты проводят на самцах и самках мелких лабораторных грызунов. Предпочтительно использование генетически однородных животных, не менее 6 особей в каждой контрольной и экспериментальной группе. 

Животные должны содержаться при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. 

Проведение эксперимента.

В первой серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей суточной терапевтической для человека и в субтоксической дозе, вводят однократно только самцам с фиксацией клеточного материала через 24 часа после введения. 

Во второй серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей суточной терапевтической для человека, вводят самцам и самкам ежедневно на протяжении 4-5 суток. Фиксацию клеточного материала осуществляют через 6 и/или 24 часа после последнего введения в зависимости от фармакокинетических особенностей испытуемого препарата [5,7]. 

Контроли

Негативным контролем является используемый растворитель. 

В качестве позитивных контролей целесообразно использовать циклофосфамид в дозе 20 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении или любой другой известный агент, заведомо обладающий цитогенетической активностью. 

Приготовление цитогенетических препаратов

Методика выделения клеток и приготовления препаратов для цитогенетического анализа подробно описаны в соответствующих руководствах и методических рекомендациях.

Микроскопический анализ.

Анализируют 2000 полихроматофильных эритроцитов от каждого животного, соотношение нормо- и полихроматофильных эритроцитов определяют при подсчете 500 эритроцитов. 

Оценка результатов.

Критерием позитивного результата является воспроизводимое и статистически значимое увеличение числа полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по сравнению с контрольной. Полученный положительный результат свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.

3. Мутационный тест на Salmonella typhimurium (тест Эймса) 

Цель исследования и принцип метода 

Данный метод предназначен для выявления способности фармакологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium. 

Фармакологические средства с выраженной антибактериальной активностью изучать в тесте Эймса нецелесообразно. 

Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации или без метаболической активации. После инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем). 

Если тестируемое соединение и/или его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидинзависимых штаммов Salmonella typhimuri-um.

Процедура тестирования 

Бактерии 

В качестве тестерных организмов используются штаммы Salmonella typhimurium. Минимальный набор состоит из штаммов ТА 97, ТА 98 и ТА 100. При необходимости могут использоваться и другие виды и штаммы микрорганизмов. 

Каждый штамм должен быть проверен на ауксотрофность по гистидину, чувствительность к кристаллическому фиолетовому и устойчивость к ампициллину. Тестерные штаммы должны иметь уровень спонтанных ревертантов в пределах ожидаемого на основании литературных данных. 

Метаболическая активация

В качестве экзогенной метаболической активации используется фракция S9 печени крыс, предобработанных соволом (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно, за 5 суток до забоя) [10]. 

Изучаемые дозы (концентрации)

Максимальная доза тестируемого соединения определяется его токсичностью и растворимостью. Токсичность тестируемого соединения может изменяться при использовании экзогенной метаболической активации. Для нетоксичных хорошо растворимых соединений максимальная доза может быть в пределах 1000-5000 мкг/чашку. Для тестируемых соединений с бактерицидной активностью максимальная доза должна подавлять рост бактерий не более, чем на 50%, что определяется либо по уменьшению количества спонтанных ревертантов, либо по подавлению роста бактериального газона. В любом случае должно проверяться не менее 5 различных доз тестируемого соединения, различающихся например в 10 раз. 

Контроли 

В каждом эксперименте обязательны одновременно проводимые негативный (необработанный или растворитель) и позитивный контроли. 

В качестве растворителя используются дистиллированная вода или диметилсульфоксид, а при необходимости и другие растворители. 

Позитивные контроли должны быть специфичны для каждого тестерного штамма. Позитивный контроль для вариантов с метаболической активацией должен соответствовать типу используемой системы экзогенной метаболической активации. 

Проведение эксперимента

Необходимые для проведения эксперимента оборудование, посуда, реактивы, питательные смеси и растворы, проведение работ по получению фракции S9, а также регламент работы с бактериальными культурами описаны в литературе. 

Опыт параллельно ведут с использованием микросомальной активирующей смеси и без нее для регистрации действия как прямых мутагенов, так и непрямых, активность которых связана с образованием мутагенных метаболитов, учитываемых при работе с микросомальной фракцией. 

В контрольных вариантах опыта вместо испытуемого образца вносят соответствующий объем растворителя. 

Обработка результатов 

Данные должны быть представлены в виде количества ревертантных колоний на чашку. Как для тестируемого соединения, так и позитивных и негативных контролей указывается количество колоний для каждой чашки, среднее количество ревертантных колоний на чашку и стандартное отклонение. Если ни в одном из вариантов на данном штамме (штаммах) не получено статистически значимых результатов, эксперимент прекращают. В случае обнаружения позитивного результата опыт повторяют с целью подтверждения эффекта, причем работу ведут только на том штамме (штаммах), на котором был выявлен эффект. Если максимальный эффект зарегистрирован на одной из промежуточных доз (такая ситуация возможна при работе с фармакологическими средствами, обладающими бактерицидными свойствами), прибегают к дроблению доз. При этом за среднюю точку на шкале доз испытуемого вещества принимают дозу, на которой был выявлен максимальный эффект. В опыт вводят еще 4 варианта: дозы в 2 и 5 раз меньше и больше средней дозы. 

Если при проведении повторного опыта эффект не обнаруживается, проводится еще один дополнительный опыт, результат которого сравнивают с первыми двумя экспериментами. Заключение о наличии или отсутствии мутагенной активности испытуемого соединения делают на основании двух опытов с совпадающими результатами. 

Для оценки результатов тестирования могут использоваться соответствующие статистические методы, например метод попарных сравнений Даннета.

Оценка результатов 

Критериями позитивного результата являются или статистически достоверное зависимое от дозы увеличение коли чества ревертантов, или воспроизводимый и статистически достоверный позитивный ответ по крайней мере для одной экспериментальной точки. 

Тестируемое соединение, не вызывающее статистически достоверного зависимого от дозы увеличения количества, ревертантов или воспроизводимого и статистически достоверного позитивного ответа для какой-либо экспериментальной точки, рассматривается как немутагенное в данном тесте. 

Отчет должен включать следующую информацию: 

- бактерии: использованные штаммы; 

- условия проведения теста: уровни доз и обоснование выбора доз, количество чашек на экспериментальную точку, токсичность, состав среды, тип и состав системы метаболической активации, методика обработки, позитивные и негативные контроли; 

- индивидуальные результаты для каждой культуры; 

- среднее количество ревертантных колоний на чашку; 

- стандартное отклонение; 

- отношения доза-эффект (где возможно). 

Интерпретация результатов

Позитивные результаты в этом тесте указывают на то,> что тестируемое соединение индуцирует генные мутации типа' замены пар оснований или сдвига рамки считывания у данного микроорганизма. Негативные результаты в этом тесте указывают на то, что в данных условиях тестируемое соединение не мутагенно для использованных штаммов Salmonella typhimurium. 

4. Учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций у дрозофилы

Цель исследования и принцип метода

С помощью данного метода проводят оценку способности испытуемого вещества и продуктов его метаболизма индуцировать генные мутации в зародышевых клетках дрозофилы. Рекомендуемый метод, называемый Меллер-5, основан на индукции исследуемыми лекарствами рецессивных летальных мутаций в Х-хромосоме самцов дикого типа линии D-32. Эти мутации передаются через самок F, самцам второго поколения, не доживающим до стадии имаго. 

Используемые линии дрозофилы

Для опытов по учету рецессивных, сцепленных с полом летальных мутаций (РСПЛМ) требуется линия дикого типа с хорошо изученным спонтанным фоном мутабильности, например, Canton-S или 0-32, а в качестве тестерной линии лучше всего использовать линию BASC. В Х-хромосоме мух этой линии имеются 2 инверсии - sc8 и d49, которые полностью исключают возможность кроссинговера между половыми хромосомами, но не нарушают жизнеспособности дрозофилы [11]. Фенотипическими маркерами служат мутации Apricot - абрикосовые глаза и Ваг - полосковидные глаза. В подобного рода экспериментах можно пользоваться также тестерной линией CIB. 

Пути введения и выбор доз

Обычно используют два основные способа введения испытуемых фармакологических средств в организм дрозофилы: ингаляционный и пероральный (с пищей). Чаще всего используют последний, при введении соединения в корм. В этом случае целесообразно использовать стеклянные пористые фильтры, погруженные в бюксы с веществами, растворенными в 1- 5,% сахарном сиропе в исследуемых концентрациях. Если препарат нерастворим в воде, можно (при обязательном применении соответствующих контролей с растворителями) растворить его в этиловом спирте или диметилсульфоксиде так, чтобы конечная концентрация этих растворителей в сахарном корме не превышала 2 %. Допускается внесение фармакологических средств непосредственно в корм. Ингаляционные затравки осуществляются в эксикаторах. Расчет доз при ингаляционном введении производят на объем эксикатора, а при лероральном - на объем корма. 

В зависимости от токсичности фармакологического средства длительность экспозиций может колебаться от нескольку часов до нескольких дней (обычно экспозиция составляет 48-72 часа). Комбинация различных концентраций и экспозиций позволяет ориентировочно определять количество ("дозу") фармакологического средства, вызывающую примерно 50% стерильность самцов. Эту "дозу" принимают за максимальную, которую используют в эксперименте. Снижение "дозы" необходимо только в случае испытаний фармакологических средств, обладающих выраженным стерилизующим аффектом. 

Проведение эксперимента

После обработки изучаемым фармакологическим средством самцов линии D-32 скрещивают с виргинными самками тестерной линии BASC (5 самцов ' 10 самок). После начала вылета мух первого поколения (F1) отбирают виргинных гетерозиготных самок и индивидуально скрещивают их с самцами F1. 

После вылета второго поколения (F2), каждая культура просматривается визуально с целью обнаружения таких, в которых отсутствуют самцы дикого фенотипа (с красными глазами). Общее количество культуральных пробирок определяет число проанализированных Х-хромосом самцов, подвергшихся действию изучаемых соединений. Пробирки, в которых отсутствуют самцы дикого типа, отмечают как "летали". Постановка контролей обязательна.

5. Учет соматической рекомбинации (мозаицизма) у дрозофилы 

Цель исследования и принцип метода 

Целью данного метода является интегральное выявление рекомбинационных и других мутационных событий, индуцируемых лекарственным веществом или его метаболитами в соматических клетках личинок дрозофилы. В основе метода лежит учет мозаичных пятен, возникающих у мух тестерных линий в результате комплексного нарушения генотипа: митотической рекомбинации, потери хромосом и/или их фрагментов, транслокаций, делеций и генных мутаций. В качестве маркеров возможно использование генов "у" и "sn3" в трансположении.

Используемые линии дрозофилы

Для учета соматического мозаицизма в данной тест-системе необходимо поддержание следующих тестерных линий дрозофилы: 

линия 1 - yellow - генотип у/у (у - рецессивный ген, обусловливающий развитие желтой окраски тела и щетинок); 

линия 2 - w, sn3 - генотип w sn3/Y (w - white - белая окраска глаз, sn3- singed3- извитая скрученная форма щетинок; оба гена рецессивные); 

Спонтанный уровень мутаций и рекомбинаций невысок и колеблется у разных линий в пределах от 0,3 до 1,1 %. 

Пути введения и выбор доз

Обычно используют один из двух способов введения испытуемых фармакологических средств в организм дрозофилы: ингаляционный или пероральный (с кормом). Если препарат нерастворим в воде, можно (при обязательной постановке соответствующих контролей) растворить его в этиловом спирте или диметилсульфоксиде так, чтобы конечная концентрация этих растворителей в испытуемом растворе 2 %. В любом случае в культуру с кормом вносят 200 мкл тестируемого раствора. Возможно распыление нерастворимых в воде соединений по поверхности питательной среды. Ингаляционные затравки осуществляются в эксикаторах, в этом случае расчет доз производят на объем эксикатора. 

Токсичность фармакологических средств устанавливают по выживаемости самок F1, которая на максимальной из использованных концентраций не должна быть меньше 50%. Всего в эксперименте определяют эффект 3 различных концентраций фармакологического средства. В зависимости от токсичности фармакологического средства длительность экспозиций может колебаться от нескольких часов до нескольких дней (обычно экспозиция составляет 48-72 часа). 

Проведение экспериментов

Девственных самок в количестве 10 особей помещают в пробирку, содержащую стандартную питательную среду вместе с 5 самцами. Через 48-72 часа родителей пересаживают в пробирки со свежей питательной средой, а в прежние пробирки вносят растворы испытуемых фармакологических средств. 

Просмотр вылетевших особей начинают с 9-10 дня после начала эксперимента и продолжают до начала вылета следующего поколения. Просмотр проводят под бинокулярным стереоскопическим микроскопом в отраженном свете. 

При скрещивании самок линии 1 с самцами линии 2 у гетерозиготных самок первого поколения, имеющих генотип у+/ +w sn3, регистрируют мутантные щетинки (макрохеты на голове, тораксе и скутеллюме) фенотипа yellow или singed. В протоколе регистрируют общее число просмотренных самок, число самок с одиночными (у, sn3) и двойными (у sn3) пятнами.

6. Метод учета доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей

Цель исследования и принцип метода

Выявление влияния исследуемого препарата на генетические структуры зародышевых клеток. Мутагенный эффект проявляется в виде повышенной эмбриональной смертности. Если яйцеклетка оплодотворена сперматозоидом, несущим доминантную леталь, то смерть развивающегося эмбриона может произойти как до, так и после имплантации. Для оценки мутагенных свойств фармакологических средств учитывают постимплантационную смертность. 

Лабораторные животные

Эксперименты проводят на самцах и самках мелких лабораторных грызунов. Предпочтительно использование генетически однородных животных, не менее 5 особей в каждой контрольной и экспериментальной группе. Животные должны содержаться при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. 

Проведение эксперимента

Для каждого варианта опыта и контроля (понедельного) следует использовать животных приблизительно одного срока рождения. Самок в течение 2-3 недель после привоза не рекомендуется брать в опыт для исключения неконтролируемых беременностей. Каждая группа самцов, обрабатываемых фармакологическим средством, должна быть увеличена на 3- 5 животных для использования их в случае не предусмотренной гибели в ходе опыта. 

Для выявления возможного мутагенного эффекта фармакологическое средство исследуется в дозах 1/10 ил1/2 LD50 при однократном введении. Применяемые дозы не должны снижать фертильность более чем 50 %. В противном случае их уменьшают и повторяют эксперимент. Исследование проводят в течение 3 недель на постмейотических стадиях сперматогенеза. На каждую дозу и контроль берут не менее И 5 самцов. Сразу же после затравки к каждому обработанному или контрольному самцу подсаживается по 3 виргинных самки. Подсадки самок проводятся еженедельно, с тем, чтобы вести анализ доминантной летальности соответственно стадиям сперматогенеза обработанных самцов. Эмбриональная смертность плодов у самок, забеременевших в первую неделю после введения химического вещества, будет свидетельвотвовать о мутационных событиях, произошедших в зрелых сперматозоидах, 2 неделя соответствует поздним сперматидам, 3 неделя - ранним и средним сперматидам.

Отсаженных от самцов самок вскрывают на 15-17 день беременности. Большая часть доминантных леталей вызывает смерть эмбрионов при или вскоре после имплантации. Погибшие на этой стадии мертвые эмбрионы выглядят как темные гомогенные округлые тела диаметром 2,5-3 мм. При вскрытии регистрируют количество живых и мертвых эмбрионов у каждой самки отдельно. Рекомендуется вскрывать ножницами оба рога матки, особенное внимание обращая на дисталь-ные отделы, так как именно там часто располагаются мертвые эмбрионы, которые в силу своих небольших размеров могут быть неучтены при обычном просмотре матки, растягиваемой двумя пинцетами. Данные вскрытия фиксируют по следующей форме (таблица 5). 

Таблица 5.Форма регистрации первичного экспериментального материалов в тесте на доминантные летальные мутации

Номер самца	Номер самки	Число живых эмбрионов	Число мертвых эмбрионов

Контроли 

В качестве позитивных контролей целесообразно использовать фотрин, циклофосфамид или любой другой известный агент, заведомо обладающий мутагенной активностью на зародышевых клетках млекопитающих. 

Негативным контролем является используемый растворитель. 

7. Учет хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови леченных больных 

Цель исследования и принцип метода.

Выявление и количественная оценка потенциальной цито-генетической активности фармакологических средств в клетках периферической крови больных, подвергавшихся лечению исследуемым лекарственным препаратом. В основе метода лежит регистрация видимых на стадии метафазы структурных нарушений хромосом в культуре клеток периферической крови, стимулируемых к пролиферации действием митогена. 

Процедура тестирования

Для исследования используется цельная гепаринизированная венозная кровь больных, находящихся на стационарном лечении. Взятие крови у, каждого больного проводят стерильно дважды - до начала лечения препаратом и не позднее 24 часов после завершения курса. Численность группы составляет 12-15 человек вне зависимости от пола и возраста. В случае необходимости возможно включение в одну группу больных, находящихся в разных лечебных учреждениях. При этом, следует избегать включение в цитогенетическое обследование пациентов, подвергающихся рентгенодиагностическим процедурам и приему заведомо мутагенных лекарств (цитостатики и пр.). 

Подготовка и проведение эксперимента

Взятие венозной крови производится стерильно в шприцы, содержащие 50 мкл стерильного водного раствора гепарина (30 МЕ/мл). От каждого больного ставится 4 культуры - 2 для проб крови, взятых до начала лечения препаратом и 2 - для проб, взятых после окончания лечения. 

Необходимые для проведения эксперимента оборудование, посуда, реактивы, питательные смеси и растворы, регламент работы с культурами клеток, условия фиксации и подготовка препаратов для цитогенетического анализа описаны.

Цитогенетический анализ

Перед анализом препараты шифруют. На каждого больного анализируют не менее 200 метафазных пластинок; 100 до и 100 после приема препарата. 

Для анализа отбирают метафазные пластинки правильной формы, с хорошим разбросом хромосом и модульным числом 46. 

Учитывают число одиночных и парных фрагментов, хроматидных и хромосомных обменов, число клеток с множественными аберрациями и клеток с полной деструкцией хромосом.

Ахроматические пробелы (гепы), разрывы по центромере и клетки с рано разошедшимися хромосомами, анеуплоидные клетки и клетки с эндоредупликациями оценивают отдельно и не включают в общее число аберраций. 

Дополнительно определяют пролиферативную активность клеток (митотический индекс). Для этого, определяют долю ядер, находящихся на всех стадиях митоза, при тотальном подсчете 1000 ядер на каждый препарат. 

Статистическая обработка полученных результатов.

Заключение о мутагенной активности исследуемого фармакологического средства делают при сравнении уровней клеток с аберрациями хромосом у больных до и после лечения с использованием критерия Уилкоксона для разности пар.



Заключение

Решение о наличии у исследуемого фармакологического средства мутагенных свойств выносится, если позитивный мутагенный эффект зарегистрирован хотя бы в одном тесте.

Исследование мутагенных свойств фармакологических средств, также как и экспертную оценку результатов, должны проводить специалисты, имеющие достаточные профессиональные навыки по применению методов, составляющих систему тестирования.



Литература

1. Ashby J. International Commission for protection against Environmenral Mutagens and Carcinogens. Two million rodent carcinogens? The role of SAR and QSAR in their detection. - Mutation Research, 1994, Feb 1, 305 (1), P. 3-12.

2. Klopman G., Rozenkranz H.S. International Commission fpr protection against Environmenral Mutagens and Carcino gens. Approaches to SAR in carcinogenesis and mutagen- esis. Prediction of carcinogenicity/mutagenicity using MUL TI-CASE. - Mutation Research, 1994, Feb 1, 305 (1), P. 33- 46.

3. Гуськова Т.Д. Оценка безопасности лекарственных средств на стадии доклинического изучения. - Химико-фармацевтический журнал, 1990, 7, С. 10-15. 

4. Определение мутагенности химических соединений (генетический скрининг) на лабораторных мышах (методические указания). М., Медицина, 1977, 12с. 

5. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ. Гигиенические критерии состояния окружающей среды 51. ВОЗ, Женева, 1989, 212с. 

6. Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность. Методические указания. Вильнюс, 1989. 

7. Оценка мутагенной активности химических веществ микроядерным методом (методические рекомендации). М., 1984, 17с. 

8. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем (методические указание ). М.,1985,34 с. 

9. Maron D.M., Ames B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutat. Res., 1983, 113, №3-4, P.173-215. 

10. Белицкий Г.А., Фонштейн Л.М., Худолей В.В. и др. Совол как индуктор микросомальных ферментов, акитивирующих проканцерогены. Экспериментальная онкология, 1987, т.9, № 3, С. 20-23. 

11. Медведев Н.Н. Практическая генетика. М., Наука, 1968, 294с. 

12. Методические рекомендации по применению соматического мутагенеза у Dr. melanogaster в качестве тест-системы для ускоренного определения канцерогенов. МЗ СССР, М., 1982. 

13. Ehling U.H., J.Machemer, W. Buselmaier et al. Standard protocol for the dominant lethal test on male mice, set up By the Work Group Dominant Lethal Mutations of the ad hoc Committee Chemogenetic., - "Arch.Toxicol.", 1978, y. 39, 173-185. 

14. Оценка мутагенности новых лекарственных средств. Методические рекомендации. М., 1994, 20 с. 

Размещено на Allbest.ru

...