Возбудитель сибирской язвы. Бактериологическая диагностика. Биопрепараты

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГБОУ ВО

Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия

Кафедра: «Микробиология, вирусология, биотехнология, радиобиология и безопасность жизнедеятельности»

Курсовая работа

по дисциплине: «Ветеринарная микробиология и микология»

на тему: «Возбудитель сибирской язвы. Бактериологическая диагностика. Биопрепараты»

Выполнила:

Студентка 3 курса

ветеринарного факультета

15 группы

Кузьмина А.В.

Проверила:

Каткова Анастасия Николаевна



Содержание:

Введение

1. Характеристика возбудителя

1.1 Морфология

1.2 Культуральные и биохимические свойства

1.3 Токсикообразование

1.4 Антигенная структура

1.5 Устойчивость

1.6 Патогенность

1.7 Патогенез

1.8 Течение и симптомы

2. Лабораторная диагностика

2.1 Материалы для исследования

2.2 Бактериологическая диагностика

2.2.1 Микроскопия

2.2.2 Выделение чистой культуры

2.3 Биопроба

2.4 Серологическая диагностика

2.5 Аллергическая диагностика

3. Биопрепараты

Заключение

Список литературы



Введение

сибирская язва возбудитель диагностика биопрепараты

Сибирская язва - острое инфекционное заболевание человека и животных. Инфекция имеет широкое распространение на территории Сибири Российской Федерации. Поэтому, в первую очередь ветеринарам и ученым нашей страны необходимо досконально её изучать, чтобы впоследствии истребить. Болезнь сопровождается значительным экономическим ущербом, падеж скота при инфицированности до 100%. Наиболее восприимчивыми считаются домашние животные - крупный рогатый скот, овцы, буйволы, лошади, ослы, олени и верблюды. Менее восприимчивы свиньи, еще меньше восприимчива домашняя птица (заражается только экспериментально).

Ареал сибирской язвы сельскохозяйственных и диких животных в настоящее время охватывает все континенты. Наиболее напряженная эпизоотологическая картина по антраксу животных сложилась в европейских странах Средиземноморья, в Центральной и Южной Америке, в Западной и Центральной Африке, в Центральной и Южной Азии. К концу XX в. число случаев болезни в России сократилось до 20 - 30 в год, в то же время в нашей стране имеется более 30 тыс. только учтенных пунктов, в которых регистрировали гибель животных от сибирской язвы.

Экономический ущерб от сибирской язвы связан в основном с затратами на осуществление противоэпизоотических мероприятий.

Ущерб в области экономики при осуществлении противоэпизоотических мероприятий довольно значительный, так как летальность при сибирской язве выше 60%. При проведении карантинных мероприятий уничтожается молоко, сжигаются трупы и навоз от больных. Особенно высокая летальность отмечается среди мелкого рогатого скота и лошадей (около 100 %).



1. Характеристика возбудителя

Сибирская язва (лат. - Febris carbunculosa; англ. - Anthrax) - зооантропоноз, который опасен для человека и животных. Это острая инфекционная болезнь вызывается бациллой антрацис (Bacillus anthracis), характеризующаяся септицемией, поражением кожи, кишечника, легких, лимфатических узлов и гибелью заболевших животных.

Классификация возбудителя:

Семейство Bacillaceae.

Род Bacillus.

Вид Bac. anthracis.

О сибирской язве писали ещё с глубокой древности. В Библии можно увидеть её под названием «шестая египетская язва», а в греческих, римских и древнеарабских источниках сибирскую язву нарекли как «священный огонь», «персидский огонь», считалось что дьявольская болезнь послана в качестве наказания за греховную натуру людей. Но страдают не только люди, но и животные. Сейчас в двадцать первом веке мы понимаем, что болезнь не щадит никого, и особенно братьев наших меньших. Только лишь благодаря профилактики и соблюдению мер борьбы с ней стало возможным утихомирить эту инфекцию.

Не малую роль в этом сыграл Л.Пастер, который изобрел вакцину против сибирской язвы в 1881 году. Он провел первые успешные опыты вакцинации животных ослабленными культурами. Через два года в России Л.С. Ценковский изготовил 1-ю и 2-ю вакцины против сибирской язвы, которые применяли в нашей стране в течение 80 лет. В дореволюционной России сибирская язва была одной из распространенных и опасных инфекционных болезней.



1.1 Морфология

Сибирская язва - это неподвижная, грамположительная палочка. Размеры 1-1,3 Ч 3,0-10,0 мкм. Может образовывать капсулу в организме и споры в окружающей среде. Микроорганизм встречается в двух видах: вегетативная форма представлена палочками с разной величиной клеток (капсульные и бескапсульные) и в виде споры. Споры могут быть упакованы в экзоспориум и оставаться внутри и вне палочки как изолированные тельца.

В препарате короткие цепочки или располагаются одиночно, прилегающие друг к другу концы бацилл закруглены. Иногда цепочки выглядят как бамбуковая трость. На жидких и плотных питательных средах палочки располагаются длинными цепочками.

В живом организме и при выращивании на искусственных питательных средах с содержанием нативного белка бацилла антракса формирует капсулу. Микроб в окружающей среде при неблагоприятных условиях образует споры. В каждой вегетативно клетке формируется только одна эндоспора, обычно находиться в центре, реже субтерминально. По форме споры овальные или круглые.

1.2 Культуральные и биохимические свойства

Бактерия не прихотлива к питательным средам. Она хорошо размножается в кислородной среде и в условиях пониженного содержания кислорода. По типу дыхания является факультативным анаэробом. Температурный оптимум 35-37 °C. При температуре ниже 12 °C и выше 45 °C не растет. рН среды благоприятная для роста микроорганизма 7,2-7,6.

Из взвеси патологического материала пипеткой делают посев на МПБ, МПА. В МПЖ высевают в столбик среды уколом. На МПА через 24-48 часов микроорганизм образует шероховатые колонии R-формы с волнистыми краями. На МПБ через 16-24 часа образует на дне пробирки рыхлый белый осадок, бульон остается прозрачным, при встряхивании осадок разбивается на мелкие хлопья. Некоторые штаммы растут в виде нежных, мелких хлопьев, взвешенных в столбик бульона, которые через 48 часов оседают на дно пробирки. Единичные штаммы через 3-4 дня дают рыхлое пристеночное кольцо, пленка на поверхности среды не образуется. На МПЖ бактерия густо растет ближе к поверхности, так как там больше кислорода. Прорастает в виде ответвлений от места укола, похожа на «перевернутую ёлочку». Через 2-3 дня желатин постепенно разжижается в виде воронки. На кровяном агаре гемолиз не вызывает. На молоке возбудитель быстро размножается и вырабатывает кислоту, через 2-4 дня молоко свертывается с последующей пептонизацией сгустка. На картофеле образует обильный, сухой, серо-белый налет, порой с кремовым оттенком. Агаровые и бульонные культуры некоторые штаммы окрашивают в светло- коричневый цвет из-за окисления тирозина. Кроме этого микроорганизм может расти на растительных натуральных средах: настой соломы, сена, экстракт гороха, сои, вики, ломтики вареного картофеля, свеклы, моркови.

Возбудитель вырабатывает ферменты: липазу, диастазу, протеазу, желатиназу, дегидразу, цитохромоксидзу, пероксидазу, каталазу. Часть штаммов образуют сероводород, особенно часто это происходит на средах богатых пептонами. Так же выделяют аммиак. Бацилла антракса ферментирует глюкозу, медленно мальтозу, декстрин, трегалозу, фруктозу с образованием кислоты без газа. На средах с салицином и глицерином может образовывать кислоту в малых количествах. Арабинозу, рамнозу, галактозу, маннозу, рафинозу, инулин, манит, дульцит, сорбит, инозит не сбраживает. Утилизирует цитраты, синтезирует ацетал-метилкарбинол. Образует лецитиназу и медленно коагулирует яичный желток. Редуцирует метиленовый синий и восстанавливает нитраты в нитриты.



1.3 Токсинообразование

Возбудитель сибирской язвы образует комплексный экзотоксин, включающий три компонента: эдематогенный фактор (ЕF), протективный антиген (РА), летальный фактор (LF). Их синтезируют капсульные и бескапсульные вариации микроба. Экзотоксины обладают более выраженной ядовитостью и избирательностью на определенные органы и ткани нежели эндотоксины.

Эдематогенный фактор представлен липопротеином, вызывающий отекообразование. Протективный антиген имеет выраженное иммуногенное действие. Отвечает за защиту микроорганизма. В чистом виде нетоксичен. Летальный фактор так же нетоксичен в чистом виде, но в составе с протективным антигеном вызывает гибель лабораторных животных.

Протективный антиген и летальный фактор- гетерогенные белки с молекулярной точки зрения. Все три компонента экзотоксина составляют синергическую смесь, проявляющую одновременно эдематогенное и летальное действие. Но каждый из них обладает антигенной и серологической активностью.

Инвазивные свойства микроба обусловлены капсульным полипептидом d-глутаминовой кислоты и экзоферментами.

1.4 Антигенная структура

В число антигенов возбудителя входят неиммуногенный соматический полисахаридный комплекс и капсульный глутаминполипептид.

Из-за того что полисахарид плотно связан с телом бактерии, он получил название соматического антигена. Он не создает иммунитета у животных и не устанавливает агрессивных функций бактерии: всегда присутствует как у R-форм, так и у S-форм.

Капсульный антиген сибиреязвенного возбудителя состоит из сложного полипептида d-глутаминовой кислоты. Его считают группо-специфическим веществом, так как он дает перекрестные серологические реакции с полипептидом B.subtilis, B.cereus, B.megaterium.

Компоненты экзотоксина возбудителя также являются антигенами.

1.5 Устойчивость

У возбудителя сибирской язвы устойчивость и степень выживаемости в различных условиях окружающей среды как в споровой форме, так и в вегетативной неодинакова. Вегетативные формы являются более не устойчивыми чем споровые.

В невскрытом трупе вегетативная форма бактерии из-за влияния протеолитических ферментов разрушается в течение 2-3 дней, в зарытых трупах сохраняется до 4 дней, через 7 дней завершается гибель бактерий во всем организме.

В замороженном мясе при -15 °С разрушается через 15 дней, в засоленном мясе сохраняется до 1,5 месяца. Навозная жижа, смешанная с сибиреязвенной кровью, пагубно действует на вегетативные клетки уже через 2-3 часа, однако споры остаются в ней патогенными в течение многих месяцев и лет. Споры в запаянных ампулах сохраняют жизнеспособность и вирулентность до 63 лет, а в почве -- более 60 лет.

К влиянию различных химических веществ вегетативные клетки слабоустойчивы. Спирт, эфир, 2%-й формалин, 5%-й фенол, 5-10%-й хлорамин, свежий 5%-й раствор хлорной извести, пероксид водорода разрушают их в течение 5 мин.

Для уничтожения споровой формы микроорганизма требуется больше времени и более сильные концентрации химических веществ. 25% этиловый спирт и более разрушает споры в течение 50 дней, 5%-й фенол и 5-10%-й раствор хлорамина убивает споры через несколько часов и даже суток, 2%-й раствор формалина через 10-15мин, 1%-й раствор пероксида водорода через 1ч, 10%-й раствор гидроксида натрия через 2 ч.

Высушивание не оказывает вредного воздействия на споры. Сухой жар при 120-140°С убивает споры через 2-3 часа, а при 150°С только через 1 час.

Вегетативные формы возбудителя слабоустойчивы к большим температурам. При нагревании до 50-55 °С уничтожаются в течение 1часа, при 60 °С через 15 мин, при 75 °С через 1 мин, при 100°С мгновенно. Они чувствительны к высушиванию, но при медленном высушивании превращаются в споровую форму и не погибают. К низким температурам инфекция плохо чувствительна: при -10 °С сохраняются 24 дня, при -24 °С до 12 дней.

Микроорганизм очень чувствителен к антибиотикам. А воздействие прямых солнечных лучей обезвреживает его в течение нескольких часов.

1.6 Патогенность

К бацилле антракса восприимчивы все виды млекопитающих. В естественных условиях чаще инфицируются овцы, крупный рогатый скот, свиньи, лошади, реже ослы и мулы. Очень чувствительны северные олени, козы, буйволы и верблюды. У свиней сибирская язва длится с долгим бациллоносительством и хронически.

Среди диких животных восприимчивы все травоядные. Плотоядные малочувствительны к возбудителю и болеют лишь при массовом заражении. Хищные звери и птицы (грифы, ястребы, кобчики), заразившись при употребление в пищу трупов павших животных, могут длительное время выделять споры с каловыми массами. Зарегистрирована сибирская язва и среди грызунов (зайцев, хорьков, серых крыс, лесных мышей и др.). Среди птиц более восприимчивы к микроорганизму утки и страусы. Пресмыкающиеся, земноводные, рыбы и беспозвоночные невосприимчивы.

Отмечена разница в чувствительности к возбудителю сибирской язвы у животных одного вида, но разных пород. Например, алжирские овцы более устойчивы, чем овцы европейских пород. В отношении естественной восприимчивости иммунитета к возбудителю сибирской язвы, животные находящиеся в зоне риска инфицированности, по разному чувствительны к инфекции в течение своей жизни. Так, оленята к сибирской язве невосприимчивы, при гибели почти 100% взрослых животных. У новорожденных в период подсоса отмечается некоторая устойчивость, затем она снижается.

1.7 Патогенез

Сибиреязвенный возбудитель легко проникает через царапины кожи и слизистые оболочки. Чаще заражение происходит алиментарным путем. Через поврежденную слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта бактерия проникает в лимфатическую систему, а затем в кровь. Микроб поступив в кровь, вызывает септицемию, интоксикацию организма и гипоксию.

Особенно много микроорганизмов собирается в селезенке, которая в течение короткого времени бывает буквально насыщена возбудителем и переносит из-за этого сильные патологические изменения. Такая селезенка не имеет возможности сдерживать огромное количество бацилл, и они попадают в кровь. В результате жизнедеятельности возбудителя в крови уменьшается концентрация кислорода, нарушается кислотно-щелочное равновесие, кровь не свертывается. В организме бактерии образуют капсульный антиген - d-глутамин полипептид и экзотоксин. Капсульный антиген ингибирует опсонизацию (подавляет образование антител), экзотоксин разрушает фагоциты и вызывает отек тканей в местах продуцирования возбудителя, а также поражает центральную нервную систему. Экзотоксин бациллы антракса повреждает стенки сосудов, возникают многочисленные кровоизлияния на слизистых оболочках и в различных органах. Продукты распада бактерии способствуют разрушению тканей. Карбункулы, появляющиеся при заражении через поврежденную кожу, вторично представляют собой очаги серозно-геморрагического воспаления в местах локализации бацилл. Затем возбудитель попадает в регионарные лимфоузлы, вызывая геморрагический лимфаденит, а из лимфоузлов - в кровь. После чего снова проявляется септицемия. В терминальной фазе кислород в крови низко снижается, это приводит к шоку и наступает смерть.

При инфицировании ослабленного животного высоковирулентным штаммом септицемия может возникнуть сразу, и смерть наступает уже через несколько часов. Возбудитель сибирской язвы может выделяться из организма с бронхиальной слизью, слюной, молоком, мочой и испражнениями.

1.8 Течение и симптомы болезни

Характер течения и форма болезни зависят от места попадания возбудителя, его вирулентности и степени защищенности организма. Инкубационный период длится 1 - 3 дня. Заражение может возникнуть вследствие укуса жалящих насекомых, после чего образуется сибиреязвенный карбункул. Отмечают две основные формы сибирской язвы: септическую и карбункулезную.

По сосредоточенности специфических изменений различают: кожную, кишечную, легочную и тонзилярную (ангинозную) форму сибирской язвы. Течение болезни: молниеносное, острое, подострое и хроническое (зависит от иммунитета).

При молниеносном течении (чаще регистрируется у овец и коз, реже у крупного рогатого скота и лошадей) регистрируют возбуждение. Заболевание обнаруживается внезапно. Животное шатается, падает, теряет сознание, дыхание затрудняется, видимые слизистые оболочки становятся сине-красными. Изо рта и носа течет кровянистая пена, из заднего прохода - кровь. У лошадей при этом часто возникают колики. Смерть наступает быстро, через несколько минут, реже через несколько часов. Животное резко начинает биться в конвульсиях и погибает. Заболевшая овца, например, тяжело дышит, дрожит, в припадке судорог падает на землю и через несколько минут погибает. Смертность достигает 100%.

При остром течении болезнь развивается с увеличением температуры тела до 41 - 42°С, учащения дыхания и пульса, мышечной дрожи. У животных снижается аппетит. У лошадей регистрируют приступы колик, у крупного рогатого скота нарушается акт жвачки, может возникать тимпания, у дойных коров останавливается лактация. Отмечается расстройства желудочно-кишечного тракта, каловые массы водянистые с кровью. Животные быстро угасают, дыхание затрудняется, наблюдается цианоз видимых слизистых оболочек, зачастую с петехиями. Могут возникать отеки в области глотки и гортани, шеи, подгрудка, живота, геморрагические инфильтраты на слизистой оболочке ротовой полости и языка. Продолжительность острого периода 2-3 дня. Во время агонии наблюдают выделение из естественных отверстий кровянистой пенистой жидкости. Смертность достигает 80%.

При подостром течении регистрируют те же клинические признаки, что и при остром, но течение болезни протяженно во времени и длится 5-8 дней.

При хроническом течение главным признаком болезни является истощение, и чаще всего это характерно для свиней. Возникают инфильтраты под нижней челюстью, а так же болезнь характеризуется поражением заглоточных лимфоузлов. Болезнь длится 2-3 и более месяцев.

Абортивное течение болезни характеризуется небольшим подъемом температуры тела, угнетением, отказ от пищи, уменьшением секреции молока, кахексическим состоянием животного. Длительность болезни обычно до 2 недель, редко больше. Больное животное, как правило, выздоравливает.

При кишечной форме сибирской язвы одновременно с септицемии наблюдают приступы колик, запор, а затем кровавый понос. Болезнь отмечается высоким подъёмом температуры.

Для легочной формы болезни свойственны признаки быстро прогрессирующей геморрагической пневмонии и острого отека легких. Обнаруживается редко и только у овец.

Ангинозная (тонзилярная) форма наиболее распространена у свиней с продолжительным течением болезни. Отмечается воспаление глотки с дальнейшим опуханием шеи и подгрудка. Зараженная свинья хрипит, давится при поедание корма, наблюдается цианоз видимых слизистых оболочек. При сильном отеке глотки и гортани животное может погибнуть от удушья. Незначительно увеличивается температура, болезнь сходна с ангиной и фарингитом. Фиксируются случаи заболевания свиней без отеков. Животные становятся вялыми, зарываются в подстилку, у них появляется сильный понос. Через несколько дней наступает смерть. В большинстве случаев симптомы ангины и фарингита слабо развиты, и опасения в отношении сибирской язвы возникают лишь при послеубойном осмотре свиных туш.

Кожная форма сибирской язвы у животных как первичное поражение отмечается крайне редко. Чаще всего карбункулы образуются как вторичные признаки поражения. Характеризуется как острым, так и подострым течением болезни. В различных частях тела, но чаще в области головы, груди, плеч и живота образуются отечные припухлости -- плотные, горячие и болезненные. Позже они превращаются в безболезненные и холодные пустулы. В центре припухлости может начаться некроз и изъязвление ткани. Иногда геморрагические инфильтраты обнаруживают на слизистой оболочке ротовой полости.



2. Лабораторная диагностика

2.1 Материалы для исследования

У павших животных отрезают ухо с той стороны, на которой лежал труп. Прежде чем отрезать ухо, на него накладывают две лигатуры: одну ближе к голове, у основания уха, другую, отступая на 1 см от первой, затем между ними делают разрез. Разрезанную поверхность на трупе прижигают раскаленным металлом (шпателем) или химическими средствами (кристаллическим перманганатом калия, фенолом, формалином). Отрезанное ухо помещают в пергаментную бумагу или целлофан, упаковывают в герметичный деревянный или железный ящик (пенал, коробку).

Вместо уха в качестве патматериала может использоваться кровянисто-пенистое истечение из естественных отверстий трупа (носовое истечение, из глаз, рта, анального отверстия). Истечения наносят на чистое стекло в виде толстого мазка, сверху накрывают другим стеклом, помещают в пергаментную бумагу или целлофан, упаковывают в коробку. Кровянистые истечения можно взять методом пропитывания кусочка мела. В случаях, когда труп вскрыт или подозрение на сибирскую язву появилось при разделке туши после убоя животного, для бактериологического исследования направляют кровь из сердца, кусочки паренхиматозных органов, лимфоузлы. Патологический материал помещают в банки с притертой пробкой или целлофановые мешки, заворачивают в ткань, смоченной дезинфицирующим раствором, упаковывают и срочно с нарочным и сопроводительным письмом отсылают в лабораторию.

Соблюдая правила личной профилактики, в лаборатории ухо животного фиксируют в кюветке, подрезают и препарируют кожу в виде треугольника снаружи уха, там где она более подвижна. Подкожную клетчатку мелко нарезают маленькими стерильными ножницами и растирают в стерильной ступке с песком и физиологическим раствором. Эту тканевую взвесь используют для посева на питательные среды и заражения лабораторных животных.

В пастеровскую пипетку капли межтканевой жидкости подкожной клетчатки, кровь и приготовленную взвесь набирают с помощью резиновой груши. Аналогично исследуют и другой материал.

2.2 Бактериологическая диагностика

2.2.1 Микроскопия

Препараты фиксируют и окрашивают по Граму, и специально по Михину, Романовскому-Гимзы азур-эозином, Ольту сафранином. В частности по одному из этих трех методов окрашивают возбудитель сибирской язвы для обнаружение капсулы. Бацилла антракса неподвижная, грамположительная, палочковидной формы бактерия. В препаратах из патологического материала располагается короткими цепочками по нескольку клеток или одиночно. Длина 4-8 мкм, ширина 0,5-1 мкм. Прилегающие друг к другу концы бацилл кажутся обрубленными, а наружные закругленными. В организме формирует капсулу. В препаратах-мазках из культуры характерно расположение длинными нитевидными цепочками (стрептобациллы). В культурах почве, воде, кормах формирует спору. Для спорообразования необходим доступ кислорода и температура 12-42 °С.

При окраске мазков возбудителя сибирской язвы на капсулы, бактерия полученная из свежего патологического материала будет окружена капсулой. А из несвежего микроорганизм будет несколько увеличен, иногда наблюдают «тени», а вместо капсул плохо окрашенные обрывки. При обработке препаратов люминесцирующими сыворотками в мазке наблюдают особенное свечение, говорящее о наличии в исследуемой пробе возбудителя сибирской язвы.



2.2.2 Выделение чистой культуры

Патологический материал высевают на чашки Петри с МПА, агаром Хоттингера (рН 7,2), селективную дифференциально-диагностическую среду с 0,01% натрия фенол-фталеинфосфата и пробирку с МПБ. Для того чтобы засеять одну пробу необходимо использовать не меньше 5 чашек. Нужно учитывать, что перед посевом поверхность агара должна быть абсолютно сухой. Посев осуществляют посредствам шпателя с заранее нанесенным на поверхность агара исследуемым материалом в количестве 1-2 капли. Если материал для исследования сильно обсеменен косвенной микрофлорой (почва, корм и т.д), то на питательную среду делают посевы методом истощения. Этот метод заключается в тщательном распределение материала по поверхности агара шпателем с переносом на 2-3 чашки. Если материал для исследования слабо загрязнен посторонней микрофлорой (кровь, кусочки органов), то проводить посевы микробиологической петлей методом истощения нет необходимости. Засевать при этом патологический материал можно на такие питательные среды как МПА, агар Хоттингера, кровяной агар и МПБ. В термостате посевы находятся 18-20 часов при 36-37 °С, и если рост в питательных средах отсутствует, то культуры оставляют в термостате ещё на 48 часов при такой же температуре.

Затем культуру сибиреязвенного микроба оценивают по характеру роста и форме колоний.

Из бульонной питательной среды (МПБ) делают мазки, подвергают окраске по Граму и микроскопируют. Далее из МПБ делают посевы на плотные питательные среды для того чтобы получить изолированные колонии в чистой культуре. Спустя сутки необходимо визуально и под микроскопом при малом увеличение оценить плотные питательные среды.

При исследование питательных сред кроме роста колоний возбудителя сибирской язвы, можно увидеть рост спорообразующих сапрофитов, которые трудно морфологически различать. Сибиреязвенная бактерия будет представлена R-формами: плоские, серые, шероховатые, центр затемнен, края бахромчатые с отростками. Микробиологической петлей с поверхности агара В.anthracis снимается тяжелее, чем колонии схожих сапрофитов. Для получения чистой культуры на питательной среде для отбора ищут не меньше 10 шероховатых колоний. А если такового количества нет, то отбирают все шероховатые колонии что присутствуют на среде. Но так же следует знать, что существуют редкие варианты возбудителя сибирской язвы, которые способны образовывать слизистые колонии на обычных питательных средах.

Посевы возбудителя сибирской язвы делают и на специальные среды. Одна из них селективная дифференциально диагностическая среда с фенолфталеинфосфотом натрия. Для её приготовления необходим расплавленный агар, полимиксин сульфат М и триметоприм, которые смешивают вместе. Перед тем как охлажденную питательную среду разлить по чашкам Петри, в неё добавляют раствор фенолфталеинфосфат натрия. Но перед этим его нагревают до 56°С в течение 20 минут. Это делается для того, чтобы получить конечную концентрацию 0,01%. Далее среду снова перемешивают, разливают по чашкам Петри, и слегка высушивают на протяжение 1,5 часов с открытыми крышками. Чашки с полученной питательной средой допустимо хранить в холодильнике 2-3 суток. Перед визуальным исследованием колоний сибиреязвенного микроба на специальной селективной среде, среду подвергают обработке парами аммиака. Для этой манипуляции на крышку от чашки Петри кладут фильтровальную бумагу и заливают её 1-2 мл водного аммиака. Далее чашку с колониями, обязательно агаром вверх, помещают в крышку с аммиаком, пока колонии сапрофитов не порозовеют. По времени это занимает несколько секунд. Подобным образом обрабатывают все посевы. Колонии В.anthracis не изменяют цвет, при воздействии на них паров аммиака, так как просто не образуют фосфатазу, либо слишком мало её образуют. Поэтому слабый розовый цвет на колониях сибирской язвы тоже возможен. Посевы спорообразующих сапрофитов окрашиваются под действием аммиака в розовый или красный цвет. После того как выросшие колонии обработали парами аммиака, их отбирают. Это делается визуально и под малым увеличением микроскопа. Отбор проходят колонии не изменившие свой цвет, либо слабо порозовевшие.

После выращивания колоний сибирской язвы на разных питательных средах и их отбора, от них берут мазки на два и более предметных стекла. Обычно полученные мазки фиксируют и окрашивают по Робигеру, Граму или сибиреязвенной люминесцирующей соматической сывороткой. При исследование мазков учитывают характерную морфологию палочек сибирской язвы, при окраске люминесцирующими сыворотками отмечают специфическое свечение. Для идентификации отбирают только колонии чистой культуры. Их распределяют на секторы МПА или агара Хоттингера. Исследуемый материал, полученный от других отобранных колоний, засевают микробиологической петлей на МПА и агар Хоттингера для образования изолированных колоний.

На этом этапе получения чистых культур возбудителя сибирской язвы важно делать посев на неселективные среды. Затем колонии убирают в термостат на 18-20 часов, далее отбирают нужные колонии для предстоящей идентификации сибиреязвенного возбудителя.

Для изолированных колоний проводят точно такие же манипуляции (берут мазки, фиксируют, окрашивают). Если культуры для исследования недостаточно, то исследование проводят на следующий день для накапливания биомассы.

2.3 Биопроба

Для того чтобы провести биологическую пробу применяют беспородных белых мышей массой 18-20 г, морских свинок массой 350-400 г, золотистых хомяков массой 60-80 г. Патологический материал, приготовленный подходящим способом, суспензируют в растворе 0,9% хлорида натрия и вводят подкожно с внутренней стороны бедра двум мышам по 0,2-0,5 мл, двум морским свинкам или двум золотистым хомякам по 0,5-1,0 мл. Смерть лабораторных животных фиксируют через 1-3 дня. Во время вскрытия погибших лабораторных животных, наблюдают характерный желеобразный отек подкожной клетчатки геморрагического характера на месте введеного материала, опухание внутренних органов с гиперемическим покраснением, увеличение селезенки и несвернувшуюся кровь. Затем от зараженных тканей и органов биопробных животных делают мазки-отпечатки, и посевы на МПА, агар Хоттингера и селективную среду. Мазки-отпечатки фиксируют в спирте с 3% перекиси водорода в течение 30 мин, а затем окрашивают раствором Ребигера или метиленовой синью. Далее полученные мазки-отпечатки микроскопируют.

Если чистая культура сибиреязвенного микроба из посевов исходного материала на питательные среды проросла раньше, чем была получена от зараженных лабораторных животных, то дополнительно заражают двух мышей или двух морских свинок суточной бульонной культурой.

За инфицированным лабораторными животными следят в течение 10 дней, затем проводят исследования. Для ускорения анализа заражают ещё 6-10 мышей, и убивают по одной мыши каждые 2-3 дня от каждой пробы после введения начального инокулюма. При вскрытие особый интерес имеет место введения. Если животные погибли именно от сибирской язвы, то на месте укола в области подкожной клетчатки будет отек. В мазках-отпечатках с места введения можно увидеть капсульные формы бациллы, а в посевах типичные колонии.

2.4 Серологическая диагностика

Реакция преципитации по Асколи.

Реакция дает возможность за короткое время выявить сибиреязвенного возбудителя в патологическом материале из органов павших животных. Исследовать методом реакции преципитации по Асколи можно и уже разложившийся биоматериал. Для проведения метода нужны: преципитирующая сибиреязвенная сыворотка, экстракт из патологического материала и сибиреязвенный бактерийный антиген для контроля.

Перед проведением реакции биоматериал помещают в термостат на 18-20 часов. Получить экстракт можно горячим и холодным способами. Но при этом необходимо знать, что в экстрактах, извлеченных из биоматериала горячим способом, меньше преципитиногенов.

При горячем способе биоматериал размельчают, заливают 0,9% физиологическим раствором с 0,3% раствором фенола в количественном соотношение 1:10 и кипятят на протяжение 30-40 минут для получения экстракта. При холодном способе экстракт не кипятят, а просто оставляют при комнатной температуре на 16-18 часов настаиваться. Затем экстракт процеживают до прозрачного состояние через пропитанную физиологическим раствором фильтровальную бумагу или вату. В узкие пробирки заливают 0,2-0,3 мл прозрачной сибиреязвенной преципитирующей сыворотки, а после пастеровской пипеткой осторожно наслаивают на нее такое же количество полученного экстракта. Если через 15 мин после этого на границе между соприкасающимися жидкостями образуется мутно-белое кольцо, то можно будет говорить о положительной реакции. При появление пристеночного кольца более чем через 15 мин, реакцию считают сомнительной. Если кольцо так и не появилось, то реакцию принято считать отрицательной. Параллельно следует ставить три контрольных пробы: преципитирующая сыворотка плюс коммерческий стандартный сибиреязвенный антиген, преципитирующая сыворотка плюс экстрагирующая жидкость, нормальная лошадиная сыворотка плюс коммерческий стандартный сибиреязвенный антиген. В будущем оценка всех контрольных проб, кроме первой, должна быть отрицательной.

Реакцию преципитации по Асколи применяют и для выявления возбудителя сибирской язвы в кожевенном и меховом сырье. Для проведения этого метода следует знать, что применяемые для изготовления кожевенного сырья кислоты и щелочи могут искажать результаты реакции. Водородный показатель полученных экстрактов в ходе реакции должен быть в пределах от 6,0 до 8,0. К тому же, этот метод является недостаточно чувствительным, и нередко дает неправильные результаты.

Идентификация возбудителя сибирской язвы.

Кроме возбудителя сибирской язвы в природе существуют и другие аэробные споровые сапрофиты, которые похожи по морфологическим и культуральным свойствам на В. Anthracis.

Существуют главные и дополнительные признаки, по которым и определяют подлинность сибиреязвенного возбудителя. К главным относится: патогенность, капсулообразование, определение подвижности, тест «жемчужного ожерелья», проба со специфическим фагом, иммунофлюоресцентный тест. К дополнительным признакам относят тесты на отсутствие гемолиза, лицетиназной активности и образования фосфатазы.

Патогенность бациллы антракса определяют по её способности вызывать заболевание Сибирской язвы у лабораторных животных, а в дальнейшем и гибель. В то время как схожие с ней споровые сапрофиты не вызывают падеж биопробных животных, кроме В.cereus, которая убивает белых мышей при внутрибрюшинном введение. В организме такую большую и четко очерченную капсулу может формировать только возбудитель сибирской язвы.

Тест «жемчужного ожерелья», который открыли 1953 г. Иенсен и Клеемейер, базируется на свойстве пенициллина подавлять синтез клеточной стенки сибиреязвенной бациллы и формировать сферопласты. Для проведения теста требуется 3 чашки Петри с мясопептонным агаром, куда вносят исследуемую культуру. В первую чашку к исследуемой культуре добавляют 0,5 ЕД пенициллина на 1 мл среды, во вторую добавляют 0,05 ЕД пенициллина на 1 мл среды, третья является контрольной. Затем посевы помещают в термостат на 3 часа при 37 °С. При исследование сред после инкубирования можно увидеть, что культура сибирской язвы растет в виде шарообразных цепочек, напоминающих ожерелье из жемчуга. Сибиреязвенноподобные сапрофиты на средах с пенициллином не растут таким образом.

Для идентификации микроорганизма также используют сибиреязвенный бактериофаг, который вызывает лизис В. Anthracis. На споровые сапрофиты данный бактериофаг не действует. В России в качестве таких фагов производят фаг ВНИИВВиМ и гаммафаг МВА.

Подвижность микроорганизмов определяют путем микроскопирования, либо делают посев исследуемой культуры уколом в столбик 0,3% МПА. Если культура растет по ходу укола, значит бактерии неподвижны. Если колонии дают диффузный рост, то бактерии подвижны. Возбудитель сибирской язвы неподвижен, в то время как ложноподобные сапрофиты подвижны.

Признак гемолитической активности является дополнительным для возбудителя сибирской язвы, так как бацилла в основном не вызывает гемолиз эритроцитов. Но в редких случаях все же возможен медленный и незначительный гемолиз. Параллельно с этим, гемолиз могут вызывать некоторые аэробные сапрофиты, но не все.

Сибиреязвенный микроорганизм медленно свертывает или совсем не свертывает желток куриного яйца, поэтому его лецитиназная активность низкая. В.cereus усиленно продуцирует лецитиназу и свертывает желток через 6-10 часов. Так же сибиреязвенный микроб не образует фосфатазу, тогда как споровые сапрофиты её производят.

2.5 Аллергическая диагностика

Для проведения аллергической диагностики используют сибиреязвенный аллерген - антраксин. Он подходит для диагностики сибирской язвы у свиней, у привитых лошадей, крупного и мелкого рогатого скота. Аллерген всем перечисленным животным вводят внутрикожно в количестве 0,2 мл. Свиньям в среднюю часть наружной стороны уха, крупному и мелкому рогатому скоту в область промежности, лошадям в области средней трети шеи.

Кожно-аллергическая реакция у свиней будет считаться положительной, если через 5 - 6 часов после введения возникает гиперемия и инфильтрат в диаметре 10 мм и более, либо утолщение кожи в этой области на 3 мм и более. Такое животное признают больным и изолируют. Если при оценке пробы отмечают сомнительную реакцию, то аллерген вводят снова через 24 часа. Животное будет считаться больным, если после повторной оценки пробы результат будет положительным или сомнительным. Такое животное так же изолируют от остальных. У лошадей, крупного и мелкого рогатого скота результаты аллергической пробы получают через 20 - 24 часа. Реакция является положительной и говорит о наличии иммунитета у вакцинированного животного, если на месте введения аллергена выявлен инфильтрат при утолщении кожи на 3-10 мм. Появление на месте введения аллергена болезненного отека, и утолщения кожи более чем на 10 мм может свидетельствовать о заражение сибирской язвой. В этом случае животных изолируют, проводят дополнительное исследование и лечат в соответствии с действующей инструкцией.



3. Биопрепараты

Для борьбы с сибирской язвой применяют специфические средства профилактики - вакцины.

У возбудителя сибирской язвы существует протективный антиген, который вызывает образование антитоксического иммунитета к этому заболеванию, так как он является одним из факторов патогенности.

Инфицирование животного сибирской язвой или же его вакцинация сопровождаются развитием гиперчувствительности замедленного типа. Вследствие естественного заражения и переболевания сибирской язвой у животных возникает длительный иммунитет.

К активной защите животных от сибирской язвы относится вакцинация. Для этого используют живые споровые сибиреязвенные вакцины.

Н.Н. Гинсбург в 1940 г. Получил из культуры вирулентного штамма вакцинный бескапсульный мутант СТИ. Затем долгое время с 1942 года вакцину СТИ, полученную из данного варианта микроорганизмов, применяли в качестве профилактики против сибирской язвы животных. И с тех пор она давала очень хорошие результаты.

Вакцину СТИ в споровой форме использовали для вакцинации животных против сибирской язвы. Иммунитет наступает через 10 дней и продолжается не менее 12 месяцев.

В практике используют также живую вакцину ВГНКИ, ассоциированную живую вакцину против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота.

К дополнительным мерам лечения и профилактики относятся антибиотики, противосибиреязвенная гипериммунная сыворотка и гамма-глобулин. После применения такой терапии пассивный иммунитет появляется через несколько часов и остается до 14 дней.

К современным методам создания активного искусственного иммунитета относится живая споровая лиофилизированная и жидкая вакцина из штамма 55-ВНИИВВиМ. Иммунитет формируется через 10 дней после прививки и сохраняется более 1 года. Есть и другая вакцина против сибирской язвы, созданная из бескапсульного авирулентного штамма 55, которую производят в жидком и лиофилизированном виде. Вакцину вводят животным один раз с 3-хмесячного возраста подкожно. Иммунитет появляется через 10 дней и сохраняется на 1 год.

Создана также универсальная вакцина против сибирской язвы человека и животных «УНИВАК», которую вводят безыгольным способом или подкожно шприцем. Иммунитет развивается через 7 дней, продолжительность 1,5 года.



Заключение

Сибирская язва это острое инфекционное заболевание, возникающее из-за грамположительной спорообразующей палочки. Возбудитель сибирской язвы -- микроб-аэроб, существующий в 2 формах: вегетативной и споровой. Вегетативная форма формирует в организме капсулы. Такие формы характеризуются высокой вирулентностью, бескапсульные формы ее лишаются.

При попадание микроорганизма в окружающую среду, бактерия образует спору. Это возможно только вне организма и при благоприятных факторах окружающей среды. В организме спор нет, так как для их развития необходим кислород.

Болезнь может протекать в кожной, легочной, септической и кишечной форме. Заболевание у животных протекает сверхостро, остро и подостро, а у свиней бессимптомно, в основном в локальной ангинозной форме.

Заражение осуществляется через инфицированное животное, которое выделяет экскреты в окружающую среду. Экскреты содержат бактерии, превращающиеся в споры на воздухе. Обсемененные патогенной микрофлорой почва и объекты внешней среды могут сохранять возбудитель до 60 лет, и быть источниками распространения инфекции.

Основные пути заражения животных: алиментарный через пищу, трансмиссивный и аспирационный.

Заражение человека может возникнуть вследствие его взаимодействия с зараженным животным и продуктами животноводства. Возможно заражение человека при контакте с обсемененной почвой, а также аспирационным и трансмиссивным путями.

Все профилактические мероприятия по поводу сибирской язвы и борьба с ней должны проводиться комплексно, в тесном взаимодействии с ветеринарной службой.

Важной ролью в профилактике сибирской язвы является вакцинация, которая осуществляется живой споровой бескапсульной сибиреязвенной вакциной СТИ.

Проблема профилактики заражения сибирской язвой на современном этапе все еще актуальна.



Список литературы:

1. Госманов, Р.Г., Колычев Н.М., Барсков А.А. Практикум по ветеринарной микробиологии и микологии: Учебное пособие. -- СПб.: изд-во «Лань», 2014. -- 384с.

2. Ипатенко, Н.Г. Сибирская язва / Н.Г. Ипатенко, B.C. Зелепукин; под. ред. Ф.М. Орлова // Инфекционные болезни крупного рогатого скота.-М.: Колос, 1974.-С. 516 с.

3. Кисленко, В.Н. Ветеринарная микробиология и иммунология. Практикум: учебное пособие. -- СПб.: Лань, 2012. -- 368 с.

4. Колесов. С. Г, Сибирская язва. / Под ред. С.Г. Колесова. - М.: Колос, 1976. - 228 с.

5. Колычев, Н.М. Ветеринарная микробиология и микология: учебник. -- СПб. : Лань, 2014. -- 632 с.

6. Нафеев. А. А, Сибирская язва : учебно-методическое пособие / А. А. Нафеев. - Ульяновск : УлГУ, 2017. - 48 с. - (Новые и возвращающиеся инфекции).

7. Перетрухина А. Т., Блинова Е. И. Бактерийные и вирусные препараты: Учебник. - М.: Академия Естествознания, 2010. -- 241 с. ISBN 978-5-91327-156-3.

8. Сидорчук. А. А, Инфекционные болезни сельскохозяйственных животных. / Под ред. Сидорчука А.А. - М.: Колос, 2007. - 671 с.

9. Соляник, Т.В. Микробиология: курс лекций. В 5 ч. Ч. 3. Частная микробиология / Т.В. Соляник, М.А. Гласкович, А.А. Гласкович. - Горки: БГСХА, 2014. - 126 с.

10. Тимаков В. Д, Левашев В. С, Борисов Л. Б. Микробиология: Учебник. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1983, 512 с.

11. Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы: Методические указания. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора.2009. - 69 с.

12. Сибирская язва: Учебное пособие. - Улан-Удэ: Изд-во БГСХА, 2005. - 47 с.

13. Сибирская язва: URL: http://www.vevivi.ru/best/Sibirskaya-yazva-ref219473.html / посещение сайта 05.11.2018

Размещено на Allbest.ru

...