Размещено на http://www.allbest.ru/

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

"НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

"ВЫСШАЯ ШКОЛА ЭКОНОМИКИ"

ФАКУЛЬТЕТ КОМПЬЮТЕРНЫХ НАУК

МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ

по направлению подготовки 01.04.02

Прикладная математика и информатика

образовательная программа «Анализ данных в биологии и медицине»

Коэволюция транскрипционных факторов с белками теплового шока у бактерий

Студент - Медведева Ксения Олеговна

Научный руководитель - Гельфанд М.С.

д-р биол. наук, канд. физ.-мат. наук, профессор

Москва

2019

Содержание

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Тепловой шок

1.1.1 Белки теплового шока

1.2 Транскрипционный фактор HspR

1.2.1 Общие сведения

1.2.2 Механизм регуляции и особенности взаимодействия

1.2.3 Состав регулона HspR

1.3 Транскрипционный фактор HrcA

1.3.1 Общие сведения

1.3.2 Механизм репрессии и особенности взаимодействия с белками шаперонами

1.3.3 Состав регулона HrcA

Глава 2. Методы

Глава 3. Результаты

Заключение

Библиографический список

Введение

Реакция теплового шока у бактерий изучается достаточно активно на протяжении последних 30 лет. За это время проведено множество экспериментальных исследований, посвященных изучению белков теплового шока и их регуляторов, в ограниченном ряду наиболее распространенных бактерий. Однако реакции теплового шока присущи всем организмам от Escherichia coli до человека. И в совокупности представляют собой сложную сеть хорошо скоординированных реакций и процессов. Несмотря на то, что в целом ответ на тепловой шок сохраняется на протяжении всей эволюции, выявлено большое разнообразие регуляторных стратегий и механизмов даже среди бактерий. Такой объем генов и белков экспериментально проанализировать не представляется возможным.

С другой стороны, количество секвенированных бактериологических геномов растет экспоненциально. В базах данных последовательностей ДНК их насчитываются тысячи. Поэтому для решения многих задач применяется биоинформатический анализ.

В данной работе методами биоинформатики исследуется глобальный вопрос совместной коэволюции транскрипционных репрессоров с белками теплового шока среди всех бактерий.

Объектами исследования данной работы являются транскрипционные факторы - HspR и HrcA, регулирующие экспрессию белков теплового шока, а также основные белки теплового шока в геномах бактерий. Экспериментально было показано взаимодействие транскрипционного фактора HspR с шаперонами DnaK [1] и CbpA [2] и транскрипционного фактора HrcA и с шапероном GroEL [3,4]. Эти взаимодействия были необходимы для правильного функционирования этих транскрипционных факторов.

Более конкретная цель работы - проанализировать совместную встречаемость регуляторных и функциональных белков теплового шока в геномах бактерий и проверить насколько она соответствует физическому взаимодействию этих белков. На основе совместной встречаемости проверить является ли физическое взаимодействие этих белков универсальным для всех бактерий.

В ходе данной работы решаются следующие задачи:

1. Поиск гомологов HrcA, HspR, CbpA, GroEL, DnaK в геномах бактерий

2. Отбор белков из базы данных RefSeq, представленных только в полногеномных штаммах

3. Поиск регулонов HspR и HrcA методами биоинформатики и анализ регулируемых генов

4. Анализ совместной встречаемости HspR и HrcA с белками теплового шока.

В результате работы был выявлен достаточно высокий процент совместной встречаемости для транскрипционного фактора HspR и шаперона DnaK. Более того, их гены закодированы близко в геномах большинства бактерий, среди которых встречаются оба. Однако подобной картины не наблюдалось для пар HspR и CbpA, HrcA и GroEL, здесь очень низкий процент геномов, в которых гены исследуемых белков закодированы близко. Следовательно, можно сделать вывод о том, что для правильной работы HspR действительно необходимо присутствие DnaK и взаимодействие с ним, но нет необходимости в CbpA. А HrcA не требует обязательного присутствия GroEL.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Тепловой шок

Практически все живые организмы имеют адаптивную реакцию на резкое повышение температуры окружающей среды. Ответ теплового шока и вовлеченные в него белки сохраняются на протяжении всей эволюции. На клеточном уровне суть реакции теплового шока состоит в глобальных изменениях транскрипции, трансляции и других важных процессах. Этот механизм состоит из ряда хорошо скоординированных реакций и процессов. На стресс клетка отвечает сокращением синтеза клеточных белков и начинает синтезировать ограниченный набор белков, которые были названы белками теплового шока [5,6]. Основная функция белков теплового шока - помогать организму выживать в условиях, которые обычно бывают летальными [7]. На самом деле, помимо повышения температуры некоторые другие стрессовые состояния могут вызывать реакцию теплового шока, такие как изменения осмотического давления, недостаток влажности, воздействие антибиотиков, растворителей или тяжелых металлов. Однако реакция теплового шока, вызванная внезапным повышением температуры, широко использовалась в качестве модельной системы для изучения воздействия стресса на биологические системы [8].

Хотя ответ на тепловой шок сохраняется как у прокариот, так и у эукариот, основные молекулярные механизмы, регулирующие экспрессию генов теплового шока, значительно различаются у разных видов бактерий. В частности, бактерии разработали различные регуляторные стратегии, которые сочетают транскрипционный и посттранскрипционный механизмы, чтобы быстро запустить синтез белков теплового шока строго по необходимости [9].

Транскрипционная регуляция генов теплового шока может осуществляться либо под положительным, либо под отрицательным контролем. Позитивная регуляция использует специфические альтернативные у-факторы для перенаправления РНК-полимеразы в определенные промоторы, в то время как негативная регуляция осуществляется репрессорами транскрипции. Интересно, что в то время как различные бактерии принимают либо исключительно положительные, либо отрицательные механизмы, у некоторых микроорганизмов эти две противоположные стратегии сосуществуют, создавая сложные сети, регулирующие гены теплового шока [9].

1.1.1 Белки теплового шока

Основными белками теплового шока являются молекулярные шапероны, которые играют важную роль в правильной сборке полипептидов в клетке и АТФ-зависимые протеазы.

Во время стресса самопроизвольное сворачивание вновь синтезированных белков неэффективно и подвержено ошибкам. Белки теплового шока участвуют в нескольких процессах в бактериальных клетках, таких как содействие сворачиванию вновь синтезированных белков, предотвращение агрегации белков в условиях стресса, восстановление белков, которые были частично или полностью развернуты и расщепление денатурированных белков [10].

Некоторые белки теплового шока также необходимы при нормальных условиях роста, и они присутствуют в клетке в достаточном количестве в любых условиях.

Белки теплового шока (HSP, от англ. Heat Shock Protein) классифицируют в зависимости от массы [7]. GroEL и DnaK, представители двух основных семейств шаперонов Hsp60 и Hsp70, массой 60 кДа и 70 кДа соответственно, играют ключевую роль в сворачивании белка даже в условиях отсутствия стресса, хотя их действие становится более важным во время стресса. Они связывают гидрофобные поверхности развернутых белков и вместе с их совместными кошаперонами (GroES и DnaJ-GrpE) способствуют правильному свертыванию белкового субстрата с помощью различных механизмов, используя энергию АТФ. Мономеры GroEL собираются в цилиндрический комплекс, образуя два гептамерных кольца, которые заключают весь субстратный белок в большой полости, давая полипептиду возможность свернуться, не взаимодействуя с любыми другими белками. Шаперон GroEL образует комплекс с шапероном GroES семейства Hsp10, как показано на рис.1.1 [10,11].

Рис.1.1. Комплекс GroESL

коэволюция геном бактерия шок

Шаперон DnaK в основном мономерен. Он представляет собой сложную молекулярную машину, взаимодействующую с кофакторами DnaJ (Hsp40), GrpE (Hsp70-cofactor) [9,10]. Общая схема образования и работы комплекса изображена на рисунке 1.2.

Другая группа белков теплового шока, экспрессируемых бактериальной клеткой и активируемых во время стресса, состоит из протеаз. Эти белки ответственны в основном за удаление поврежденных полипептидов из стрессовых клеток. Некоторые протеазы являются многокомпонентными системами, в которых каталитическая субъединица (например, ClpP и HslV) связывается с субъединицами распознавания субстрата (ClpA, ClpB или ClpX для ClpP и HslU для HslV). Протеазы также используют энергию АТФ [8,13].



Рис. 1.2. Модель основного механизма Hsp70 в сворачивании белка. Адаптировано из статьи [12]

Малые белки теплового шока составляют высоко гетерогенную группу белков, молекулярной массой от 12 до 43 кДа. Их основная роль заключается в том, чтобы связывать и защищать развернутые белки, удерживая их в конформации, не подверженной деградации, до тех пор, пока они не будут переданы АТФ-управляемым шаперонам [14].

Наконец, некоторые белки теплового шока выполняют разнообразные функции, помимо простого сворачивания белка. Например, GroEL1 Mycobacterium smegmatis, паралог GroEL, участвует в синтезе миколевой кислоты и образовании биопленки [15]. Другой гомолог GroES в Helicobacter pylori помимо своей роли как кошаперона, играет роль транспортера ионов Ni2+ [16].

В последние годы было выявлено несколько белков-репрессоров теплового шока и охарактеризованы их механизмы регуляции посредством взаимодействия с консервативными элементами ДНК, расположенными в промоторах генов теплового шока. Общей особенностью репрессоров теплового шока является, помимо негативной регуляции, является их отрицательная авторегуляция, т.е. они репрессируют свой собственный промотор. Эта регуляторная схема довольно распространена среди транскрипционных репрессоров. Таким образом, за фазой индукции, которая быстро появляется при тепловом стрессе, немедленно следует фаза отключения транскрипции [17].

Два основных и наиболее распространенных репрессора транскрипции, которые будут рассмотрены в данной работе - HspR и HrcA [9,13,18-20].

1.2. Транскрипционный фактор HspR

1.2.1 Общие сведения

Репрессор транскрипции теплового шока HspR был впервые обнаружен и охарактеризован в Streptomyces coelicolor. В частности, было показано, что дистальный ген оперона dnaK кодирует новый белок теплового шока семейства транскрипционных регуляторов MerR [1]. Белки семейства MerR, содержат два домена: ДНК-связывающий и эффектор-связывающий домен. Первый располагается на N-конце относится к классу “спираль-поворот-спираль” (helix-turn-helix, HTH). Второй домен находится на C-конце и в зависимости от регуляторной функции имеет различную структуру. Он отвечает за связывание эффектора транскрипции или восприятие другого сигнала. Транскрипционные факторы MerR как правило димеры [5,21]. Ниже представлена 3D структура BmR, представителя семейства MerR, сходная со структурой HspR (рис. 1.3).

HspR обнаружен в нескольких грамположительных бактериях с высоким содержанием GC-состава, а также в некоторых грамотрицательных бактериях [5,22].

Сайт связывания HspR был назван HAIR (HspR Associated Inverted Repeats). Его консенсусная последовательность CTTGAGT-N7-ACTCAAG содержит два инвертированных повтора в 7 п.н. (рис. 1.4), что характерно для гомодимера [23].



Рис. 1.3. Структура BmrR, представителя семейства MerR, связанного с ДНК. Адаптировано из статьи [21]

Рис. 1.4. Диаграмма LOGO, построенная на основе сайтов связывания HspR. [А.Е. Казаков, неопубликованные данные]

Последовательности HAIR были обнаружены, в большинстве случаев, вблизи области промотора перед генами теплового шока, часто перекрывая область от -10 п.н. до -35 п.н., однако его расположение может колебаться в пределах от -150 до -10 п.н. относительно старта трансляции [1,22,23]. Перед опероном, содержащим dnaK, часто обнаружено два сайта HAIR [1,24,25]. Однако значение двух сайтов связывания изучены не были.

1.2.2 Механизм регуляции и особенности взаимодействия

HspR предотвращает связывание РНК-полимеразы при нормальной температуре посредством прямого препятствия на промоторе, т.к. его сайт зачастую перекрывает область от -10 п.н. до -35 п.н. Однако в некоторых случаях сайт HAIR находится далеко от старта трансляции, в нетипичной позиции для репрессора транскрипции, что подтверждает гипотезу о сложном механизме HspR-опосредованной репрессии транскрипции [9].

Наиболее изучен механизм репрессии HspR внутри типа Actinobacteria. Было показано его взаимодействие с белками-шаперонами DnaK и CbpA.

Функциональное взаимодействие DnaK-HspR первоначально было охарактеризовано для Streptomyces coelicolor. Анализы EMSA показали образование тройного комплекса DnaK-HspR-ДНК, где DnaK действует как корепрессор HspR без прямого контакта с ДНК. Интересно, что DnaK-опосредованная модуляция HspR не зависит от ко-шаперонов DnaJ и GrpE и не требует АТФ, тем самым исключая механизм, основанный на функции DnaK как шаперона [1]. Эта роль DnaK в регуляции генов теплового шока была дополнительно подтверждена как in vitro, так и in vivo [26]. То есть в нормальных условиях окружающей среды DnaK взаимодействует с HspR, и тройной комплекс связывается с ДНК-мишенью, что приводит к жесткой репрессии транскрипции. Во время теплового шока DnaK изолируется развернутыми белками, которые накапливаются в цитоплазме, и HspR менее эффективно способен подавлять транскрипцию

Недавно аналогичный механизм корепрессии DnaK был исследован и для Mycobacterium tuberculosis [27].

Любопытно действует шаперон CbpA в Helicobacter pylori. Он также участвует в контроле экспрессии белков теплового шока и является корепрессором транскрипции. Только влияние CbpA на ДНК-связывающую активность HspR (отрицательный эффект) противоположно модуляции, обычно оказываемой DnaK на HspR (положительный эффект). CbpA взаимодействует с HspR только тогда, когда репрессор не связан с сайтом HAIR, тем самым предотвращая его немедленное связывание с ДНК и подавление транскрипции [2,5].

1.2.3 Состав регулона HspR

Экспериментально определен и описан в литературе состав регулонов HspR для бактерий Helicobacter pylori, Mycobacterium tuberculosis, Streptomyces coelicolor, Campylobacter jejuni, Deinococcus radiodurans (рис. 1.5).

В большинстве описанных случаев HspR подавляет экспрессию ограниченного набора генов теплового шока, представленных на рисунке 1.5. Однако в некоторых исследованиях были идентифицированы новые гены, входящие в регулон HspR, такие как speA и tlpB, кодирующие аргинин декарбоксилазу и рецептор хемотаксиса соответственно [28]. Однако в параллельном исследовании с использованием матричной гибридизации зонда к ДНК (macroarray hybridization of cDNA) регуляцию этих новых генов не наблюдали, что, видимо, свидетельствует о предпочтении регуляции конкретного набора белков теплового шока [29].

Для Helicobacter pylori было показано, что HspR подавляет в нормальных условиях транскрипцию трех оперонов: hrcA-grpE-dnaK, groES-groEL и оперон, включающий собственный ген cbpA-hspR [2,16,29,32]. Такие же опероны входят в состав регулона HspR в Campylobacter jejuni, куда помимо описанных входят еще два гена, кодирующих АТФ-зависимые протеазы - clpB и lonA [18].

В Streptomyces coelicolor анализ на основе микрочипов экспрессии генов в мутантных штаммах и штаммах дикого типа привел к идентификации 17 генов, контролируемых HspR [33]. Из этого анализа выяснилось, что у Streptomyces coelicolor HspR непосредственно репрессирует транскрипцию генов, кодирующих шапероны (оперон dnaK-grpE-dnaJ-hspR) и протеазы (lon и clpB), а также один ген рибосомальной РНК и два гена тРНК.



Рис.1.5. Состав регулонов HspR в бактериях Helicobacter pylori [16,20,28,29], Mycobacterium tuberculosis [25,27,30], Streptomyces coelicolor [1,23,26], Campylobacter jejuni [18], Deinococcus radiodurans [31]

HspR связывается с последовательностью HAIR и репрессирует транскрипцию в промоторных областях перед опероном dnaK-grpE-dnaJ, генами ftsH, clpB, lonB и hsp20 в Deinococcus radiodurans. FtsH является протеазой и действует совместно с DnaKJ-GrpE комплексом [31].

В Mycobacterium tuberculosis под отрицательным контролем HspR находятся опероны dnaKJE-hspR, clpB; а также ген б-кристалина acr2, относящегося к малым белкам теплового шока Hsp20. Белок б-кристаллин Acr2, обладает шапероноподобными свойствами, включая способность предотвращать осаждение денатурированных белков и повышать клеточную толерантность к стрессу; а также повышает выживаемость в условиях фагоцитоза [25,27,30].

1.3 Транскрипционный фактор HrcA

1.3.1 Общие сведения

Репрессор HrcA - один из самых распространенных репрессоров теплового шока у бактерий. Впервые экспериментально был обнаружен в Bacillus subtilis перед опероном dnaK [34]. Его сайт связывания, называемый CIRCE (Controlling Inverted Repeat of Chaperone Expression) состоит из консервативных инвертированных повторов в 9 п.н., разделенных последовательностью в 9 п.н. - TTAGCACTC-N9-GAGTGCTAA. Впервые CIRCE был идентифицирован вблизи сайта начала транскрипции генов dnaK и groESL [35,36].

На сегодняшний день кристаллическая структура репрессора HrcA термофильной бактерии Thermotoga maritima - единственная подробная структура для этого регулятора теплового шока - представлена на рисунке 1.6 [37].

Рис.1.6. Структура димера HrcA [37]

HrcA образует димерную структуру, где каждый мономер состоит из N-концевого домена, включающего “спираль-поворот-спираль” (HTH), центрального GAF-подобного домена (вероятно, участвующего в димеризации) и C-концевого домена димеризации (IDD) [37].

1.3.2 Механизм репрессии и особенности взаимодействия с белками шаперонами

Подобно HAIR, положение элемента CIRCE почти всегда находится в области, близкой к сайту начала транскрипции, перекрывая часть ДНК, с которой контактирует РНК-полимераза во время инициации транскрипции.

В экспериментальном исследовании Mogk и др. выявили роль шаперона GroEL в качестве модулятора активности HrcA. Они показали, что уменьшение концентрации GroESL в клетке было связано с высокой экспрессией HrcA-контролируемого оперона dnaK при всех температурах. Напротив, избыточная экспрессия GroESL приводила к гиперрепрессии транскрипции промотора [10]. Более подробные исследования в Chlamydia trachomatis, показали что GroEL непосредственно взаимодействует с комплексом HrcA-CIRCE и улучшает связывание HrcA с его сайтом CIRCE [38]. Экспериментальные результаты в Helicobacter pylori показывают, что именно HrcA является термодатчиком, воспринимающим колебания температуры окружающей среды. При повышении температуры на несколько градусов выше 37 ° C, происходит денатурация HrcA, тем самым вызывая полную потерю его ДНК-связывающей активности, и соответственно, транскрипцию генов теплового шока. В условиях in vivo было показано, что после спада теплового стресса часть денатурированного HrcA может восстанавливать свою функцию репрессора транскрипции благодаря взаимодействию с шаперонным комплексом GroESL. Для HspR такой термочувствительной активности не наблюдалось [37].



Рис. 1.7. Общая схема действия репрессоров HrcA (А) и HspR (Б). Адаптировано из статьи [9]

Таким образом, HrcA поддерживается в активной конформации благодаря шаперонному комплексу GroESL. При стрессовом воздействии накопившиеся неправильно свернутые полипептиды в клетке изолируют и “забирают” шаперон, который больше не может взаимодействовать с репрессором HrcA. Без присутствия связанного шаперона HrcA теряет ДНК-связывающую способность, и репрессия генов теплового шока уменьшается [3,29,39]. Подобный контроль обратной связи репрессорной активности HrcA с помощью комплекса GroESL выявлен у нескольких отдаленных видов бактерий, как, например, у Caulobacter crescentus и Helicobacter pylori [29,40]. Исходя из чего можно предположить, что это общий механизм посттранскрипционного контроля активности репрессора в ответ на раздражители окружающей среды.

Общая схема взаимодействия репрессоров HrcA и HspR с шаперонами представлена на рисунке 1.7.

1.3.3 Состав регулона HrcA

В экспериментальных исследованиях продемонстрировано, что два основных оперона groES-groEL и hrcA-grpE-dnaK с различными вариациями контролируются HrcA. Регулоны наиболее изученных бактерий изображены на рисунке 1.8.



Рис. 1.8. Состав регулонов HrcA в бактериях Helicobacter pylori [20,29,39], Streptomyces coelicolor [26,33,41], Mycoplasma genitalium [42], Bacillus subtilis [10,34,43]

Именно эти два канонических оперона - groESL и hrcA-dnaK-grpE включающие гены шаперонов и собственный ген - репрессируются HrcA в нормальных условиях в Bacillus subtilis [10].

В Streptomyces coelicolor в состав регулона HrcA входят опероны hrcA-dnaJ, groES-groEL1 и groEL2 [41].

Помимо оперонов dnaK и groESL HrcA прямо или косвенно участвует в регуляции нескольких генов. Например, в человеческом патогене Mycoplasma genitalium гены, кодирующие протеазы Lon и ClpB, обладают консервативным элементом CIRCE в своих промоторных областях, что указывает на HrcA-опосредованную негативную регуляцию [42]. Более того, различные данные свидетельствуют о том, что экспрессия генов clp у нескольких видов Lactobacillus находится под отрицательным контролем HrcA вместо регулятора CtsR [44], в то время как у Streptococcus salivarus эти два репрессора теплового шока участвуют в регуляции транскрипции гена clpP [45].

В Campilobacter jejuni только один оперон groES-groEL находится под контролем HrcA. Причем он регулируется совместно с HspR. Т.е. для репрессии требуются оба регулятора. В то время как оперон, включающий ген самого репрессора HrcA, hrcA-grpE-dnaK регулируется исключительно HspR [15].

Совместная регуляция обоими репрессорами присутствует также и в Helicobacter pylori [20]. Roncarati и др. экспериментально подтвердили модель, в которой белки теплового шока регулируются следующим образом (рис. 1.9): HspR способен репрессировать собственную транскрипцию, в то время как оба регулятора HspR и HrcA необходимы для репрессии транскрипции оперонов groES-groEL и hrcA-grpE-dnaK [20,29].

Рис.1.9. Схематическое отображение оперонов, включающих основные гены теплового шока в Helicobacter pylori [20]

Из исследования ясно, что двойная репрессия способствует кинетике быстрого ответа, т.е. при внезапном повышении температуры гены теплового шока быстро экспрессируются, а при возврате к нормальным условиям репрессия быстро восстанавливается.

Описанные выше примеры дают сложную картину регуляции генов теплового шока и ставят интересные вопросы об их роли и эволюции. Гипотеза о том, что гомеостатический контроль регуляторов транскрипции шаперонами может представлять новую общую тему в регуляции генов теплового шока, подтверждается описанными взаимодействиями HspR и HrcA с шаперонами DnaK, CbpA и GroEL.

Глава 2. Методы

В первой части работы по реконструкции регулонов HspR в геномах бактерий [5] поиск гомологов HspR осуществлялся с помощью программы BLAST-P [46]. Из базы данных GenBank были взяты локус-теги (locus tag) для каждого гомолога [47]. С помощью инструмента RegPredict [48] были построены позиционно-весовые матрицы (positional weighted matrices, PWM) и осуществлен поиск потенциальных сайтов связывания HspR в геномах бактерий. Анализ позиций сайтов связывания транскрипционного фактора и построение графиков были произведены в программе RStudio.

Для анализа совместной встречаемости поиск гомологов HrcA, HspR, CbpA, GroEL и DnaK в геномах бактерий производился по консервативным доменам в базе данных NCBI CDD [49]. Были выбраны только репрезентативные белки, содержащие данные домены, из базы данных RefSeq. Для анализа были скачаны все бактериальные геномы и протеомы из базы данных RefSeq, имеющие значение поля RefSeq Category: Reference или Representative. Построение таблиц, поиск белков в геномах, фильтрация белков и другие операции были выполнены с помощью языка программирования Python. Поиск регулонов транскрипционных факторов был выполнен программой z-scan.py, которая использует инструменты поиска сайтов связывания, подобные программам RegPredict и GenomeExplorer.

Диаграммы Logo для сайтов связывания транскрипционных факторов были построены с помощью веб-сервиса WebLogo [50].

Глава 3. Результаты

3.1 Реконструкция регулонов HspR

Данная часть исследовательской работы, включающая в себя поиск регулонов HspR и анализ сайтов связывания, была выполнена в рамках курсового проекта [5].

В дaнном исследовaнии реконструкция регулонов HspR былa произведенa с помощью инструментa RegPredict, в группaх геномов, сформировaнных aвторaми прогрaммы. В них входят избрaнные репрезентaтивные геномы для основных тaксономических групп бaктерий. 92 геномa среди них содержaли HspR.

Тaблицa 3.1 покaзывaет количество нaйденных оперонов. Отсюдa видно, что больше всех оперонов регулируется в Helicobacteracea, Campylobacteraceae - по 4 оперонa в регулоне. Минимaльное количество, лишь по 1 оперону, в регулоне у предстaвителей Deinococcus-Thermus.

Тaблицa 3.1. Количество регулируемых оперонов в группaх RegPredict

Группa в RegPredict	Количество геномов в группе	Количество геномов, в которых нaйден ген hspR	Количество регулируемых оперонов
Actinobacteria
Nocardiacea	4	4	12
Pseudonocardiaceae	3	3	7
Bifidobacteriaceae	11	11	22
Frankinieae Streptomyceneae	7	7	19
Propionebacteriniae	2	2	4
Micrococciniae	14	13	25
Mycobacteriniaceae	12	12	35
Corynebacteriaceae	8	8	19
Chloroflexi
Chloroflexi	8	5	4
Deinococcus Thermus
Deinococcus Thermus	5	5	5
е-Proteobacteria
Helicobacteraceae	9	6	25
Campylobacteraceae	9	9	35
Всего:	92	85	212

Состaв регулонов покaзaн нa рисунке 3.1. Нaблюдaется высокaя консервaтивность оперонов внутри типa.

Для всех групп из типa Actinobacteria хaрaктерно нaличие оперонa dnaKJE-hspR, a тaкже оперонa clpB, что соглaсуется с литерaтурными дaнными [24,27,30,51]. Примечaтельно, что перед опероном dnaKJE-hspR всегдa нaблюдaется двa сaйтa связывaния. В большинстве групп в регулон включaются только вышенaзвaнные опероны, лишь в группaх Nocardiaceae, Frankinieae Streptomyces и Mycobacteriaceae были нaйдены тaкже гены, кодирующие протеaзу lonA, мaлый белок теплового шокa б-кристaлин acr2 и ряд генов, кодирующих белки с неизвестной функцией.

В клaссе е-Proteobacteria регулируется с помощью HspR оперон cbpA-hspR-orf, что подтверждaется в предыдущих исследовaниях [2,18,32,52]. Кaк и в е-Proteobacteria, в типе Chloroflexi репрессор HspR трaнскрибируется из одного оперонa с CbpA. В Actinobacteria ген hspR входит в оперон с геном dnaK. Гены, кодирующие белки шaперонного мехaнизмa DnaK, у е-Proteobacteria входят в состaв оперонa hrcA-grpE-dnaK. Гены groES и groEL, отвечaющие зa еще один шaперонный мехaнизм, здесь тоже регулируются HspR.



Рис. 3.1. Состaв реконструировaнных регулонов HspR. Слевa укaзaны группы геномов из RegPredict. Кружкaми покaзaны потенциaльные сaйты связывaния HspR. Стрелкaми одного цветa покaзaны ортологичные гены. Белым цветом обознaчены гены с неизвестной функцией, звездочкой - ген оксидоредуктaзы, двумя звездочкaми - ген хеликaзы [5]

Для более подробного aнaлизa взaимного рaсположения сaйтов в случaе пaрных сaйтов были построены рaспределения позиций одиночных и пaрных сaйтов связывaния HspR (рис. 3.2). В пaрных сaйтaх рaссмотрены отдельно дистaльный - дaльний от стaртa трaнсляции (рис. 3.2a) и проксимaльный - ближний к стaрту трaнсляции (рис. 3.2Б) регулируемого оперонa.



Рис. 3.2. Плотности рaспределения позиций сaйтов связывaния относительно стaртa трaнсляции регулируемого оперонa: a - дистaльного в пaрных сaйтaх связывaния; Б - проксимaльного в пaрных сaйтов связывaния; В - одиночного сaйтa связывaния; Г- плотность рaспределения рaсстояния между пaрными сaйтaми связывaния, n - рaзмер выборки, м - среднее aрифметическое, у - среднее квaдрaтичное отклонение.

Нa грaфикaх зaметно, что позиции широко вaрьируют кaк в пaрных сaйтaх (у = 38,49 для проксимaльного сaйтa, у = 44,82 для дистaльного), тaк и в одиночных (у=51,04). Однaко рaсстояние между пaрными сaйтaми вaрьирует в узких пределaх. Нa грaфике плотности рaспределения между сaйтaми связывaния нaблюдaется узкий пик. (рис. 3.2Г).

Стaндaртное отклонение рaсстояния между пaрными сaйтaми (у = 10,14) сильно меньше, чем стaндaртное отклонение координaт отдельно дистaльного и проксимaльного сaйтов. В среднем сaйты нaходятся нa рaсстоянии 53,35 п.н. друг от другa. Возможно, тaкое постоянство интервaлa между пaрными сaйтaми при широком вaрьировaнии кaждого из сaйтов объясняется специфическим мехaнизмом репрессии. Среди рaзличных мехaнизмов репрессии, один из вaриaнтов предполaгaет изгиб ДНК в петлю [53]. В нaшем исследовaнии среднее рaсстояние между пaрными сaйтaми в 53,35 п.н. примерно рaвно пяти виткaм спирaли ДНК: 53,35 : 10,6 = 5,03 (длинa одного виткa 10,6 п.н.). Это ознaчaет, что сaйты связывaния в пaре рaсположены одинaково относительно оси двойной спирaли ДНК. Предпочтение пaрных сaйтов именно перед опероном, из которого трaнскрибируется DnaK, их рaсположение с рaсстоянием в 5 витков ДНК, и обрaзовaние комплексa DnaK-HspR позволяют предположить возможный мехaнизм репрессии с изгибом ДНК с помощью комплексa из двух димеров, кaк покaзaно нa рис. 3.3.

Рис.8. Возможный мехaнизм репрессии с изгибом ДНК посредством обрaзовaния комплексa DnaK-HspR. Стрелкой обознaчен регулируемый ген

3.2 Анализ совместной встречаемости транскрипционных факторов и шаперонов

Для дальнейшего исследования было решено расширить область анализируемых геномов, рассматривая все репрезентативные геномы бактерий, не ограничиваясь только группами RegPredict. И для более глобального рассмотрения регуляции теплового шока - провести анализ для двух основных репрессоров теплового шока - HrcA и HspR.

В ходе работы были отобраны все гомологи HrcA, HspR, CbpA, GroEL, и DnaK, в которых аннотированы соответствующие консервативные домены.

Для каждого белка были выбраны следующие домены с идентификатором в базе данных NCBI CDD (табл. 3.2)

Таблица 3.2. Консервативные домены белков теплового шока

Белок	Домен (идентификатор в базе данных NCBI CDD)
HrcA	PRK00082
HspR	cd01279
CbpA	TIGR02349
GroEL	PRK00013
DnaK	PRK00290

Всего было идентифицировано достаточно большое количество гомологов в базе данных RefSeq. Особенно распространены белки DnaK и GroEL, выполняющие функцию шаперонов.

Чтобы в дальнейшем рассматривать только по одному штамму из каждого представленного вида, были отобраны только те штаммы бактерий, которые имели полностью собранный геном (т.е. имеющие в базе данных GenBank Assembly значение поля RefSeq Category: Reference или Representative).

Было определено распространение белков теплового шока среди разных типов бактерий. Из таблицы 3.3 видно, что все белки представлены больше всего в типах Actinobacteria и Proteobacteria. Некоторые из них широко представлены еще и в Firmicutes (HrcA, DnaK, GroEL), Bacteroidetes (GroEL, DnaK).

Таблица 3.3 Количество бактерий, имеющих исследуемые белки

Тип бактерии	HrcA	HspR	CbpA	DnaK	GroEL
Actinobacteria	797	462	0	975	1057
Deferribacteres	4	5	0	5	5
Firmicutes	991	2	0	1067	1074
Gemmatimonadetes	2	0	0	2	2
Thermodesulfobacteria	3	0	0	9	9
Armatimonadetes	2	0	0	2	4
Fusobacteria	11	0	0	25	25
Synergistetes	14	0	0	18	14
Tenericutes	71	0	0	96	15
Spirochaetes	2	0	0	64	61
Acidobacteria	12	12	0	18	16
Chloroflexi	3	3	0	47	36
Aquificae	2	10	0	8	11
Proteobacteria	894	77	26	1675	1901
Dictyoglomi	3	0	0	2	2
Ignavibacteriae	2	0	0	2	2
Chlamydiae	9	0	0	16	22
Bacteroidetes	3	0	0	431	440
Cyanobacteria	67	3	0	92	66
Chlorobi	1	0	0	13	12
Elusimicrobia	2	0	0	2	3

Таблица 3.3 Количество бактерий, имеющих исследуемые белки (продолжение)

Calditrichaeota	1	0	0	1	1
Nitrospirae	5	0	0	8	7
Deinococcus-Thermus	0	1	0	40	40
Planctomycetes	0	0	0	18	47
Fibrobacteres	0	0	0	2	3
Thermotogae	0	0	0	22	23
Verrucomicrobia	0	0	0	17	18
Coprothermobacterota	0	0	0	2	2
Nitrospinae	0	0	0	0	1
Lentisphaerae	0	0	0	1	1
Balneolaeota	0	0	0	4	4
Chrysiogenetes	0	0	0	4	2
Caldiserica	0	0	0	1	1
Kiritimatiellaeota	0	0	0	1	1
Итого:	2937	577	26	4690	4928

Далее были скачаны все геномы и протеомы бактерий из базы данных RefSeq, также имеющие значение поля RefSeq Category: Reference или Representative. Таким было проанализировано 5549 геномов.

Зачастую гены, которые кодируют взаимодействующие друг с другом белки, близко расположены в геноме или находятся в одном опероне [54]. Поэтому, чтобы оценить вероятность функционального взаимодействия и физического контакта проведем анализ совместной встречаемости и расстояний между генами следующих пар “регулятор-шаперон”: HspR - DnaK, HspR - CbpA, HrcA - GroEL.

Будем считать, близко расположенными те пары генов, расстояние между которыми <10 000 п.н.

3.2.1. HspR и DnaK

Таблица 3.4. Количество геномов, в которых DnaK регулируется транскрипционным фактором HspR

Бактериальный тип	Количество геномов, в которых DnaK регулируется транскрипционным фактором HspR
Actinobacteria	704
Deinococcus-Thermus	25
Deferribacteres	1
Proteobacteria	32
Aquificae	3
Firmicutes	1
Acidobacteria	5
Spirochaetes	1
Planctomycetes	1
Chlamydiae	1

3.2.2 HrcA и GroEL

Таблица 3.5. Количество геномов в шаперон GroEL регулируется транскрипционным фактором HrcA

Тип бактерии	Количество геномов, в которых шаперон GroEL регулируется HrcA
Firmicutes	963
Proteobacteria	584
Actinobacteria	279
Chlamydiae	4
Cyanobacteria	59
Chlorobi	12
Thermotogae	21
Chloroflexi	20
Dictyoglomi	2
Acidobacteria	10
Fusobacteria	13
Synergistetes	14
Deferribacteres	3
Deinococcus-Thermus	1
Aquificae	2
Haloplasmales	1
Ignavibacteriae	2
Nitrospirae	2
Thermodesulfobacteria	2
Armatimonadetes	1

Таблица 3.6. Количество геномов в шаперон GroEL регулируется транскрипционным фактором HrcA (продолжение)

Bacteroidetes	2
Gemmatimonadetes	1
Tenericutes	1
Calditrichaeota	1

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют в пользу наличия взаимодействия между белками HspR и DnaK, и отсутствия обязательного взаимодействия между белками HspR и CbpA, HrcA и GroEL.

Библиографический список

1. Bucca G. et al. The HspR regulon of Streptomyces coelicolor: a role for the DnaK chaperone as a transcriptional co-repressordagger // Mol. Microbiol. 2000. Vol. 38, № 5. P. 1093-1103.

2. Roncarati D., Danielli A., Scarlato V. CbpA acts as a modulator of HspR repressor DNA binding activity in Helicobacter pylori // J. Bacteriol. 2011. Vol. 193, № 20. P. 5629-5636.

3. Wilson A.C., Tan M. Stress Response Gene Regulation in Chlamydia Is Dependent on HrcA-CIRCE Interactions // J. Bacteriol. 2004. Vol. 186, № 11. P. 3384-3391.

4. Reischl S., Wiegert T., Schumann W. Isolation and analysis of mutant alleles of the Bacillus subtilis HrcA repressor with reduced dependency on GroE function // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, № 36. P. 32659-32667.

5. Медведева К.О. Реконструкция регулонов HspR в геномах бактерий. НИУ ВШЭ, Москва, 2017.

6. Morimoto R.I. Cells in stress: transcriptional activation of heat shock genes // Science. 1993. Vol. 259, № 5100. P. 1409-1410.

7. Hartl F.U. Molecular chaperones in cellular protein folding // Nature. 1996. Vol. 381, № 6583. P. 571-579.

8. Schlesinger M.J. Heat shock proteins // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265, № 21. P. 12111-12114.

9. Roncarati D., Scarlato V. Regulation of heat-shock genes in bacteria: from signal sensing to gene expression output // FEMS Microbiol. Rev. 2017. Vol. 41, № 4. P. 549-574.

10. Mogk A. et al. The GroE chaperonin machine is a major modulator of the CIRCE heat shock regulon of Bacillus subtilis // EMBO J. 1997. Vol. 16, № 15. P. 4579-4590.

11. Xu Z., Horwich A.L., Sigler P.B. The crystal structure of the asymmetric GroEL-GroES-(ADP)7 chaperonin complex // Nature. 1997. Vol. 388, № 6644. P. 741-750.

12. Kampinga H.H., Craig E.A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010. Vol. 11, № 8. P. 579-592.

13. Maleki F. et al. Bacterial Heat Shock Protein Activity // J. Clin. Diagn. Res. JCDR. 2016. Vol. 10, № 3. P. BE01-03.

14. Ingolia T.D., Craig E.A. Four small Drosophila heat shock proteins are related to each other and to mammalian alpha-crystallin. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1982. Vol. 79, № 7. P. 2360-2364.

15. Ojha A. et al. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria // Cell. 2005. Vol. 123, № 5. P. 861-873.

16. de Reuse H., Vinella D., Cavazza C. Common themes and unique proteins for the uptake and trafficking of nickel, a metal essential for the virulence of Helicobacter pylori // Front. Cell. Infect. Microbiol. 2013. Vol. 3. P. 94.

17. Alon U. Network motifs: theory and experimental approaches // Nat. Rev. Genet. 2007. Vol. 8, № 6. P. 450-461.

18. Holmes C.W., Penn C.W., Lund P.A. The hrcA and hspR regulons of Campylobacter jejuni // Microbiol. Read. Engl. 2010. Vol. 156, № Pt 1. P. 158-166.

19. Schumann W. Regulation of bacterial heat shock stimulons // Cell Stress Chaperones. 2016. Vol. 21, № 6. P. 959-968.

20. Roncarati D., Scarlato V. The Interplay between Two Transcriptional Repressors and Chaperones Orchestrates Helicobacter pylori Heat-Shock Response // Int. J. Mol. Sci. 2018. Vol. 19, № 6.

21. Brown N.L. et al. The MerR family of transcriptional regulators // FEMS Microbiol. Rev. 2003. Vol. 27, № 2-3. P. 145-163.

22. Narberhaus F. Negative regulation of bacterial heat shock genes // Mol. Microbiol. 1999. Vol. 31, № 1. P. 1-8.

23. Grandvalet C., Servant P., Mazodier P. Disruption of hspR, the repressor gene of the dnaK operon in Streptomyces albus G // Mol. Microbiol. 1997. Vol. 23, № 1. P. 77-84.

24. Zomer A. et al. An interactive regulatory network controls stress response in Bifidobacterium breve UCC2003 // J. Bacteriol. 2009. Vol. 191, № 22. P. 7039-7049.

25. Stewart G.R. et al. Overexpression of heat-shock proteins reduces survival of Mycobacterium tuberculosis in the chronic phase of infection // Nat. Med. 2001. Vol. 7, № 6. P. 732-737.

26. Bucca G. et al. Development and application of versatile high density microarrays for genome-wide analysis of Streptomyces coelicolor: characterization of the HspR regulon // Genome Biol. 2009. Vol. 10, № 1. P. R5.

27. Bandyopadhyay B. et al. DnaK Dependence of the Mycobacterial Stress-Responsive Regulator HspR Is Mediated through Its Hydrophobic C-Terminal Tail // J. Bacteriol. 2012. Vol. 194, № 17. P. 4688-4697.

28. Delany I. et al. In vitro selection of high affinity HspR-binding sites within the genome of Helicobacter pylori // Gene. 2002. Vol. 283, № 1-2. P. 63-69.

29. Roncarati D. et al. Transcriptional regulation of stress response and motility functions in Helicobacter pylori is mediated by HspR and HrcA // J. Bacteriol. 2007. Vol. 189, № 20. P. 7234-7243.

30. Das Gupta T., Bandyopadhyay B., Das Gupta S.K. Modulation of DNA-binding activity of Mycobacterium tuberculosis HspR by chaperones // Microbiol. Read. Engl. 2008. Vol. 154, № Pt 2. P. 484-490.

31. Schmid A.K. et al. HspR is a global negative regulator of heat shock gene expression in Deinococcus radiodurans // Mol. Microbiol. 2005. Vol. 55, № 5. P. 1579-1590.

32. Pepe S. et al. The Helicobacter pylori Heat-Shock Repressor HspR: Definition of Its Direct Regulon and Characterization of the Cooperative DNA-Binding Mechanism on Its Own Promoter // Front. Microbiol. 2018. Vol. 9. P. 1887.

33. Bucca G. et al. Negative feedback regulation of dnaK, clpB and lon expression by the DnaK chaperone machine in Streptomyces coelicolor, identified by transcriptome and in vivo DnaK-depletion analysis // Mol. Microbiol. 2003. Vol. 50, № 1. P. 153-166.

34. Yuan G., Wong S.L. Regulation of groE expression in Bacillus subtilis: the involvement of the sigma A-like promoter and the roles of the inverted repeat sequence (CIRCE) // J. Bacteriol. 1995. Vol. 177, № 19. P. 5427-5433.

35. Schmidt A. et al. Cloning, sequencing, mapping, and transcriptional analysis of the groESL operon from Bacillus subtilis. // J. Bacteriol. 1992. Vol. 174, № 12. P. 3993-3999.

36. Wetzstein M. et al. Cloning, sequencing, and molecular analysis of the dnaK locus from Bacillus subtilis. // J. Bacteriol. 1992. Vol. 174, № 10. P. 3300-3310.

37. Liu J. et al. Crystal Structure of a Heat-inducible Transcriptional Repressor HrcA from Thermotoga maritima: Structural Insight into DNA Binding and Dimerization // J. Mol. Biol. 2005. Vol. 350, № 5. P. 987-996.

38. Chen A.L., Wilson A.C., Tan M. A Chlamydia-specific C-terminal region of the stress response regulator HrcA modulates its repressor activity // J. Bacteriol. 2011. Vol. 193, № 23. P. 6733-6741.

39. Roncarati D., Danielli A., Scarlato V. The HrcA repressor is the thermosensor of the heat-shock regulatory circuit in the human pathogen Helicobacter pylori // Mol. Microbiol. 2014. Vol. 92, № 5. P. 910-920.

40. Susin M.F. et al. Functional and structural analysis of HrcA repressor protein from Caulobacter crescentus // J. Bacteriol. 2004. Vol. 186, № 20. P. 6759-6767.

41. Servant P., Mazodier P. Negative regulation of the heat shock response in Streptomyces // Arch. Microbiol. 2001. Vol. 176, № 4. P. 237-242.

42. Musatovova O., Dhandayuthapani S., Baseman J.B. Transcriptional heat shock response in the smallest known self-replicating cell, Mycoplasma genitalium // J. Bacteriol. 2006. Vol. 188, № 8. P. 2845-2855.

43. Schmidt A. et al. Cloning, sequencing, mapping, and transcriptional analysis of the groESL operon from Bacillus subtilis // J. Bacteriol. 1992. Vol. 174, № 12. P. 3993-3999.

44. Suokko A. et al. ClpL is essential for induction of thermotolerance and is potentially part of the HrcA regulon in Lactobacillus gasseri // Proteomics. 2008. Vol. 8, № 5. P. 1029-1041.

45. Chastanet A., Msadek T. clpP of Streptococcus salivarius Is a Novel Member of the Dually Regulated Class of Stress Response Genes in Gram-Positive Bacteria // J. Bacteriol. 2003. Vol. 185, № 2. P. 683-687.

46. Altschul S.F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. Vol. 25, № 17. P. 3389-3402.

47. Benson D.A. et al. GenBank // Nucleic Acids Res. 2013. Vol. 41, № Database issue. P. D36-42.

48. Novichkov P.S. et al. RegPredict: an integrated system for regulon inference in prokaryotes by comparative genomics approach // Nucleic Acids Res. 2010. Vol. 38, № Web Server issue. P. W299-307.

49. Marchler-Bauer A. et al. CDD: NCBI's conserved domain database // Nucleic Acids Res. 2015. Vol. 43, № Database issue. P. D222-226.

50. Crooks G.E. et al. WebLogo: a sequence logo generator // Genome Res. 2004. Vol. 14, № 6. P. 1188-1190.

51. Stewart G.R. et al. Dissection of the heat-shock response in Mycobacterium tuberculosis using mutants and microarrays // Microbiol. Read. Engl. 2002. Vol. 148, № Pt 10. P. 3129-3138.

52. Spohn G. et al. Characterization of the HspR-mediated stress response in Helicobacter pylori // J. Bacteriol. 2002. Vol. 184, № 11. P. 2925-2930.

53. Rodionov D.A. Comparative genomic reconstruction of transcriptional regulatory networks in bacteria // Chem. Rev. 2007. Vol. 107, № 8. P. 3467-3497.

54. Keskin O., Tuncbag N., Gursoy A. Predicting Protein-Protein Interactions from the Molecular to the Proteome Level // Chem. Rev. 2016. Vol. 116, № 8. P. 4884-4909.

Размещено на Allbest.ru

...