Вірусологія як наука

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вірусологія як наука

1.Предмет і завдання вірусології

Вірусологія - наука про віруси - найдрібніші живі об'єкти, які нездатні проявляти ознаки живого поза клітиною-господарем. Віруси розмножуються тільки в клітинах, використовуючи клітинні структури і метаболізм. Віруси відкриті в кінці 19 століття, а в останні десятиріччя інтерес до них швидко зростає. Це зумовлено кількома причинами:

1) віруси є збудниками багатьох захворювань людини і тварин. Деякі смертельні захворювання майже повністю ліквідовані (натуральна віспа), але з'являються нові вірусні інфекції (ВІЛ, вірус атипової пневмонії SARS, нові штами вірусу грипу А), відбувається розширення ареалу локальних вірусних інфекцій (вірус Ебола, вірус Зіка), залишаються неподоланими гострі респіраторні інфекції, гепатити, шлунково-кишкові захворювання, спричинені вірусами;

2) існують віруси, що безпосередньо беруть участь в утворенні пухлин людини і тварин (онкогенні ретровіруси, папіломавіруси, деякі герпесвіруси);

3) віруси рослин викликають хвороби останніх і псують величезну кількість с/г продукції;

4) віруси уражають також гриби та бактерій (віруси можуть уражати як корисні для людини бактерії, так і патогенні, в останньому випадку віруси можна використовувати боротьби з бактеріальними інфекціями).

5) віруси - важливий об'єкт в генетиці, молекулярній біології та біотехнології (з використанням фагу Т2 E. coli доказано, що носієм генетичної інформації є ДНК; перші енхансери та перший транскрипційний фактор (трансплантаційний Т-антиген) були виявлені у вірусу SV40; інтрони вперше були відкриті під час транскрипції аденовірусів; роль кеп-структури на 5-кінці мРНК вперше були виявлені при дослідженні вірусу натуральної віспи та реовірусу; вперше ділянки внутрішньої посадки рибосоми (IRES - internal ribosomal entry site), які забезпечують кеп-незалежну, або внутрішню ініціацію трансляції були відкриті у поліомавірусів; перші псевдовузли на РНК були відкриті у вірусу жовтої мозаїки (пізніше у еукаріотичного ферменту теломерази)).

6) Деякі віруси можуть бути корисними: а) Фаготипування бактерій (деякі види сальмонел класифікуються за фагами, до яких вони чутливі); б) джерело ферментів (зворотня транскриптаза ретровірусів, РНК-полімераза фагів); в) пестициди (деякі комахи-шкідники контролюються бакуловірусами та міксомавірусами); г) антибактеріальні агенти (фаги використовуються для лікування бактеріальних захворювань, спричинених особливо актибіотико-резистентними бактеріями); д) протиракові агенти (генетично модифіковані штами вірусу простого герпесу першого типу і вірусу віспи досліджуються для лікування пухлин); е) вектори у генній інженерії (бакуловіруси та аденовіруси у культурі клітин тварин - для продукції важливих білків, зокрема компонентів вакцин); є) генетичні вектори для лікування генетичних захворювань (ретровіруси, н-д, використовуються як вектори для стовбурових клітин для лікування важкого комбінованого імунодефіциту у дітей («синдром хлопчика у міхурі»

Сучасну вірусологію поділяють на загальну і спеціальну.

Загальна вірусологія вивчає природу вірусів, їх будову, розмноження, взаємодію з клітиною-господарем, походження і поширення вірусів у природі.

Медична, ветеринарна і с/г вірусологія вивчають інфекційні властивості патогенних вірусів, розробляють заходи профілактики, діагностики та лікування вірусних захворювань.

Основні завдання сучасної вірусології:

1) Вивчення властивостей вірусів, особливостей їх взаємодії з клітинами, молекулярно-біологічних механізмів організації та експресії вірусного геному;

2) Вивчення патогенезу вірусних інфекцій;

3) Розроблення методів ідентифікації вірусів та діагностики, спричинених ними захворювань;

4) Розробка заходів боротьби з вірусними інфекціями та їх профілактика;

5) Розробка нових біотехнологічних схем з використанням вірусів;

6) Розробка біотехнологічних схем зі створення ефективних діагностичних і вакцинних препаратів.

7) Розробка методів і засобів лікування вірусних інфекцій.

Вірусологія тісно пов'язана з біохімією, генетикою, молекулярною біологією, біофізикою, мікробіологією, імунологією, медициною, ветеринарією, фітопатологією.

2.Історичний розвиток вірусології

вірус лікування сучасний

Вірусні захворювання відомі здавна - віспа, сказ, жовта лихоманка, проте до кінця 19 століття їхній збудник залишався невідомий. В 1796 році англійський лікар Едвард Дженнер запропонував першу вакцину проти вірусної інфекції - віспи. Це було майже за 100 років до відкриття вірусів. Друга вакцина - проти сказу (антирабічна) була запропонована засновником мікробіології - Луї Пастером в 1885 році.

Вакцина - це ослаблений збудник, який не може викликати інфекційного процесу і розмножуватися в організмі, проте він здатен розпізнаватись імунною системою організму і знешкоджуватись.

Віруси відкрив російський вчений Д.І. Івановський. Івановський був фітопатологом, зокрема вивчав захворювання тютюну - тютюнову мозаїку, але добре знав методи мікробіології. У 1892 році вийшла його праця «Про дві хвороби тютюну», в якій він описав невідомих збудників, відмінних від бактерій. Він виявив, якщо сік ураженої рослини пропустити через бактеріальні фільтри (свічки Шамберлана), він зберігає інфекційні властивості. При нагріванні до 60-70°С фільтрат втрачав інфекційні властивості. Збудника тютюнової мозаїки Івановський назвав - «бактерії, що фільтруються». Голландський вчений Мартін Бейєрінк повторив і відтворив через 6 років досліди Івановського, запропонувавши власне термін «вірус», що у перекладі з латинської означає «отрута».

1898 р. - Лефлер і Фрош відкрили збудника ящура (хвороба ВРХ);

1902 р. - Рід і Керрол відкрили перший вірус людини - вірус жовтої лихоманки;

1911 р. - Раус відкрив вірусну природу саркоми курей - перший онкогенний вірус;

1915 р. - Туорт і д'Ерель відкрили бактеріофаги («пожирачів бактерій») (склоподібне переродження мікрококів та збудника дизентерії, відповідно);

1935 р. - Вендел Стенлі отримав чистий препарат вірусу тютюнової мозаїки у вигляді кристалів, за що в 1944 р. отримав Нобелівську премію;

1952 - Чейз і Херші довели генетичну роль ДНК - на бактеріофагах показали, що ДНК виконує спадкову функцію.

3.Періоди розвитку вірусології

Розвиток вірусології умовно поділяють на кілька періодів.

1) 30-40 рр. 20 ст. - період вивчення вірусології на рівні організму. У цей період були розроблені методи культивування вірусів. Основними експериментальним моделями для вивчення вірусів були щурі, миші, кролики, хом'яки. Основний модельний об'єкт - вірус грипу. В 40-ві роки розроблено метод культивування вірусів у курячих ембріонах. 1941 р. - американський вчений Херст відкрив явище гемаглютинації - злипання еритроцитів. Це дало початок дослідженням взаємодії вірусів з клітиною на моделі вірус грипу-еритроцити.

В цей період інтенсивно почали вивчатись ендемічні енцефаліти. В 1937 році експедиція Зільбера - відкрито вірус японського кліщового енцефаліту.

2) 50-ті рр. 20 ст. - вивчення вірусів на рівні клітини. В 1954 р. Джон Ендерс, Томас Уеллер і Фредерік Робінс отримали Нобелівську премію за розробку методів культивування вірусів в культурі клітин. Ці вчені працювали з вірусом поліомієліту. Їхнє відкриття дало змогу отримувати культуральні вакцини, зокрема отримана вакцина проти поліомієліту, пізніше енцефаліту, ящура тощо.

3) 60-ті рр. 20 ст. - почалось вивчення вірусів на молекулярному рівні. В цей час були встановлені деталі будови вібріона, механізм їх проникнення в клітину, номенклатура вірусів.

4) Від 70 рр. 20 ст. до сьогодні - вивчення вірусів на субмолекулярному рівні. У цей період розроблені методи визначення нуклеотидної послідовності НК та послідовності амінокислот у вірусних білках. Завдяки цьому були отримані карти вірусних геномів. 1972 р. - Пол Берк отримав рекомбінантні молекули ДНК з допомогою вірусів бактерій. 1975 р. - Девід Балтімор, Гарвард Темін отримали Нобелівську премію за відкриття зворотної транскриптази у віріонах РНК-вмісних онкогенних вірусів. Завдяки цьому ферменту стало можливим створення штучних генів на основі мРНК. Після цього стало можливим вводити в геном бактерій гени інших організмів. На сьогодні, віруси - важливий інструмент у генній інженерії бактерій та тварин. У 80-тих роках 20 ст. відкритті вірус Т-клітинного лейкозу людини, та ВІЛ; у 1997 р. було вручено Нобелівську премію американському вченому Стенлі Прузінеру за відкриття пріонів - білкових інфекційних агентів, які викликають нейродегенеративні захворювання у людини та тварин. Продовжується відкриття нових вірусів і у наш час (нові штами вірусу грипу А, коронавірус SARS (2003 р.).

Внесок українських вчених - самостійно.

1. Природа вірусів. Віруси як неклітинні форми життя

Від інших біологічних об'єктів, віруси відрізняються наступними властивостями:

1. Віруси не мають клітинної будови.

2. Віруси містять один тип нуклеїнової кислоти - або ДНК, або РНК.

3. Для розмноження вірусу достатньо лише нуклеїнової кислоти.

4. Віруси не мають метаболічних систем і здатні репродукуватись тільки в клітині-господарі, використовуючи її біосинтетичний апарат.

5. Віруси не здатні до росту і поділу.

6. Поза клітиною віруси неактивні і перебувають у формі віріонів - спеціалізованих частинок, які містять генетичний матеріал вірусу (НК), оточений білковою оболонкою; у складних вірусів наявна ще ліпідна оболонка.

7. Більшість вірусів спричиняє захворювання людини, тварин та рослин.

З моменту відкриття вірусів не раз виникало питання: живі чи неживі віруси? В різні періоди думки змінювалися. Івановський відносив вірусів до мікроорганізмів. Коли Стенлі отримав кристали ВТМ, віруси стали вважати неживими істотами. З часом з'ясувалось, що віруси мають спадковість і здатність розмножуватися. На сьогодні встановлено, що віруси мають ознаки живого і неживого.

Ознаки неживого: 1) неклітинна будова, 2) відсутність власної системи синтезу білка; 3) вірус - це, по суті, молекула нуклеопротеїду; 4) деякі віруси здатні кристалізуватися.

Ознаки живого: 1) розмноження, яке проте відрізняється від розмноження клітин - віруси не ростуть, а їхні компоненти синтезуються у різних місцях клітини і не обов'язково зразу формуються віріони. 2) спадковість - кожен вірус має своє коло господарів, кожна вірусна хвороба має свої симптоми, протягом століть симптоми зберігаються. 3) фенотипова мінливість - у різних умовах генотип проявляється по-різному - в залежності, наприклад, від стану імунної системи; 4) пристосованість до умов зовнішнього середовища і здатність до еволюції - кожен вірус має певну екологічну нішу - має коло природніх господарів, циркуляція вірусів може відбуватися із зміною господарів та без неї, бути горизонтальною або вертикальною. Еволюцію вірусів добре вивчено на прикладі вірусу грипу, в якого щорічно відбуваються дрібні зміни в геномі, а раз на 10-15 років - різкі зміни в геномі і відповідно в складі антигенів, що призводить до виникнення пандемій грипу. 5) паразитизм: віруси - генетичні паразити, геноми вірусів і клітин конкурують. Вірусний геном, що проникає у клітину, гальмує діяльність її геному і стимулює синтез вірусних компонентів - НК і білків.

Найпростіше визначення вірусу:

Вірус - це молекула ДНК або РНК, оточена білковою оболонкою, у складних вірусів є ще ліпідна оболонка.

Французький вірусолог Андре Львов запропонував визначення вірусів як суворо внутрішньоклітинних потенційно патогенних агентів, які мають інфекційну фазу, містять один тип нуклеїнових кислот, репродукуються у формі генетичного матеріалу, нездатні до росту і поділу і позбавлені систем, що виробляють енергію.

Одним з найбільш загальним сучасним визначенням вірусів є наступне:

Віруси - це об'єкти, геном яких представлений НК (РНК або ДНК), ця НК репродукується в живих клітинах і використовує їх біосинтетичний апарат для синтезу спеціалізованих частинок - віріонів. Віріон - позаклітинна форма існування вірусу, містить геном вірусу і переносить його в інші клітини.

Надсен: вірус - це речовина, що має властивості істоти, або істота, що має властивості речовини.

4.Походження вірусів. Роль вірусів в еволюції

вірус лікування сучасний

Про походження вірусів існує кілька гіпотез.

1) Гіпотеза «першовірусів» базується на гіпотезі світу РНК: до появи життя, існували молекули РНК з каталітичною активністю, які могли самореплікуватися, вони дали початок давнім доклітинним форм життя - протобіонтам, від яких пішли дві гілки - віруси і клітинні організми (LUCA, Last Universal Cellular Ancestor) (коеволюція вірусів та клітинних форм). Вважають, що віроїди (малі реплікуючі РНК без білкової оболонки) є древніми формами вірусів і доказом даної гіпотези. Також гіпотезується, що віруси могли виникнути перед LUCA. Припускається, що в еру нуклеїнових кислот, нуклеїнові кислоти могли розвинули здатність захоплення доступних пептидів у середовищі з утворенням нуклеопротеїдів РНК-віруси еволюціонували перші з світу нуклеопротеїдів, потім з'явилися ретровіруси і ДНК-віруси. Дволанцювогі(+)-РНК-віруси вважаються реліктами РНК світу. Ретровіруси і вірус гепатиту В - релікти етапу переходу від РНК до ДНК-вірусів.

Недоліки гіпотези: 1) реплікація вірусів можлива тільки у клітині, тому віруси з'явилися після появи клітинних організмів. 2) хоч віруси є малими, вони не є примітивнішими, ніж прокаріоти - той самий генетичний код, склад нуклеїнових кислот, принципи передачі генетичної інформації.

2) Гіпотеза «редукційної еволюції»: віруси - продукт регресивної еволюції бактерій та інших одноклітинних організмів. Багато дослідників вважають, що наприклад, вірус віспи - потомок бактерій, які стали облігатними внутрішньоклітинними паразитами і еволюціонували в напрямку дегенерації.

Таблиця

Заперечення цієї гіпотези: неклітинна будова вірусів, важко пояснити появу різноманітних форм генетичного матеріалу у вірусів.

В останні роки з'явилися нові повідомлення на користь редукційної гіпотези. Були відкриті гігантські віруси амеб (мімівіруси), розміри яких сягають 450 нм (нижня межа розмірів клітин - 150-200 нм). У Мамавірусів та Мімівірусів виявлені ґени білків, які раніше ніколи не знаходили у жодного з вірусів - це ферменти репарації ДНК, збирання і навіть синтезу білків (три типи аміноацил-т-РНК синтетази). У Мамавірусів (2008 р.) виявлений невідомий раніше тип суперпаразитів - вірусів-сателітів, так званих, Вірофагів Спутніків (Sputnik Virophage), які нагадують, радше, внутрішньоклітинних, а ніж вірусних паразитів. Пізніше також були відкриті гігантські ДНК-вмісні віруси Мегавірус (2011, 1,2 Мbp) та Парвовірус (2013, 2,5 Mbp). На основі цих досліджень, віруси відносять до окремого - 4-го домену життя.

3) Гіпотеза «генів-втікачів» - віруси походять від клітинних генів, які стали автономними, тобто вийшли з-під контролю клітини («гіпотеза скажених генів»). Згідно гіпотези, віруси виникли від клітинних компонентів, таких як плазміди, інтрони та транспозони, які набули відносної автономності і стали паразитами клітин. Серед компонентів клітин є структури, НК яких являють собою основні типи генного апарату вірусів:

- двохспіральні лінійні ДНК - у хромосомах,

- двохспіральні кільцеві ДНК - у мітохондріях та плазмідах,

- односпіральні лінійні РНК - в рибосомах і в іРНК,

- останнім часом у клітинах знайдено і двохспіральні РНК.

- структура інтронів генів еукаріотів близька до структури РНК віроїдів. Віроїди викликають захворювання рослин і передаються як звичайні інфекційні віруси, проте на відміну від вірусів, віроїди не мають білків, у них є тільки невелика кільцева або лінійна РНК (300-400 нуклеотидів), розмножуються завдяки клітинним ферментам.

- прикладом вірусів, які виникли у результаті «втечі генів» є вірус гепатиту Д людини (дельта-вірус), який містить рибозимну послідовність, гомологічну до рибозиму CPEB3 у інтронів людини.

Недоліки: відсутність пояснення різноманіття структури віріонів у вірусів, вірусних ферментів та механізмів проникнення у клітину.

5.Роль вірусів в еволюції

Віруси - не тільки паразити, а й важливий фактор еволюції. Вони здатні переносити окремі гени від одних клітин до інших навіть через видовий бар'єр. Після включення вірусних ДНК в геном господаря в останнього появляються нові гени, а білки цих генів можуть виявитися корисними для цього організму. Таким чином віруси можуть здійснювати горизонтальну передачу генетичної інформації.

6.Методи виділення та культивування вірусів

вірус лікування сучасний

Віруси можна виділити із зараженого біологічного матеріалу - органи рослин (листки, плоди, квіти, корінь), лізати бактерій, тканини тварин, сироватка крові, змиви з верхніх дихальних шляхів у людини тощо. Для виділення вірусів використовують найчастіше диференційне центрифугування або зональне центрифугування у градієнті густини сахарози або хлориду цезію. Диференціальне центрифугування полягає у низці центрифугувань з високими та низькими швидкостями, які замінюють одна одну. При 20-50 тис. об/хв. осідають віруси і інші важкі компоненти (н-д, клітини), а розчинні компоненти з масою менше 10 Да, залишаються в розчині. Отриманий осад ресуспендують у буфері і центрифугують при 8-10 тис. об/хв. для осадження частин клітин та денатурованих білків (віруси залишаються в розчині). Наступне центрифугування при 30-50 тис. об/хв. призводить знову до осадження вірусів, але вже очищених від різних домішок. Зональне центрифугування забезпечує краще очищення вірусу від інших компонентів. У центрифужну пробірку нашаровують за допомогою шприца розчин сахарози (5-25%) або хлориду цезію (1-2 г/cм3) з різною концентрацією (від більшої знизу до меншої зверху). При центрифугуванні частинки розподіляються за масою - зупиняючись у шарі речовини, який має таку ж густину. Опісля відбирають відповідний шар (фракцію), де зупинилися віруси. Таким чином, можна виділити і вірусні компоненти (нуклеїнові кислоти та білки). Наприклад, у CsCl: вірусна ДНК зупиняється у шарі з густиною 1,5 г/см3, а звичайна ДНК - 1,7 г/см3.

Для вивчення та очищення вірусних білків та нуклеїнових кислот використовують методи електрофоретичного розділення (детальніше про гель-електрофорез у курсі біоорганічної хімії).

Віруси не ростуть на найскладніших живильних середовищах, оскільки можуть розмножуватися лише у живих організмах. Для культивування вірусів тварин використовують лабораторних тварин (щурі, миші, кролики, хом'яки). Вперше лабораторних тварин для вирощування вірусів почав використовувати ще Луї Пастер. Використання лабораторних тварин для дослідження вірусів дозволяє вивчити симптоми захворювання, чутливі клітини та органи, формування противірусного імунітету. Водночас є недоліки: не всі віруси людини заражають і викликають такі ж симптоми у тварин, тварини можуть бути заражені іншими прихованими вірусними інфекціями; для досліджень потрібна велика кількість тварин, що є затратним. Водночас, деякі віруси людини можна культивувати лише в організмі певних тварин (н-д, вірус гепатиту В людини розмножується лише у шимпанзе).

В 1932 р. Ернест Гудпасчур запропонував використовувати для культивування вірусів курячі ембріони. Матеріал, який містить вірус, вводять за допомогою шприца у курячий ембріон на 8-12-ий день його розвитку. Більшість вірусів тварин добре розвивається в амніоні, жовточному мішку, хоріналантоїсній оболонці та інших частинах ембріону. Переваги порівняно з цілим організмом: курячі ембріони рідко бувають заражені іншими вірусами, менш ресурсозатратно.

Для кількісного накопичення вірусів найбільш ефективним є використання культури клітин, запроваджені у практику у 50-их роках 20 ст. Тепер віруси успішно культивують у культурах одношарових трипсинізованих клітин, які виготовляють з ембріональних тканин курей, кроликів, морських свинок, мишей, нирок мавп і ембріонів людини. Широко використовують віруси у так званих перещеплюваних культурах клітин - н-д, злоякісних пухлин. Порівняно з первинними культурами, перещеплювані клітинні лінії можна розмножувати послідовними пересівом (пасажуванням) протягом тривалого часу. Н-д, культура клітин Hela, отримана з пухлини хворої жінки Генрієти Лекс ще в 1950 р., пройшла тисячі генерацій і використовується і сьогодні у багатьох вірусологічних лабораторіях. Іноді важко знайти культуру клітин для культивування вірусів. Довший час не вдавалося це для вірусу гепатиту С, поки нарешті культура клітин гепатоми виявилася здатною підтримувати реплікацію вірусу.

Культури клітин використовують як для отримання вірусних частинок, так і для отримання вакцин та для біохімічних досліджень. Культури клітин вирощують у спеціальних пляшках, чашках та плашках. Культуральне середовище повинно містити всі необхідні компоненти для росту клітин (найчастіше основа - сироватка крові, додатково - глюкоза, амінокислоти, фактори росту, мікро-і мікроелементи, вітаміни, антибіотики, потрібна підтримка відповідного рН та рівня СО2). Важлива умова - дотримання стерильності та уникнення забруднення. Більшість клітин ростуть на пластиковій чи скляній поверхні, утворюючи моношар, хоча клітини можна і суспендувати в середовищі, отримуючи суспензію клітин. При внесенні вірусів на моношар клітин, віруси розмножуються у клітинах, викликаючи лізис останніх. За невеликої концентрації вірусу не всі клітини будуть заражені тому на моношарі будуть видні так звані зони лізису - бляшки. Бляшка формується, коли інфекція поширюється із зараженої клітини до сусідніх, одна бляшка відповідає одній вірусній частинці. Бляшки також утворюють фаги у бактеріальних газонах

Питання для самоконтролю

1. Які існують причини для вивчення вірусів?

2. Яку позитивну роль можуть мати віруси для людини?

3. Які завдання вирішує сучасна вірусологія?

4. Обґрунтуйте взаємозв'язок вірусології з іншими науками.

5. Як і ким були відкриті віруси?

6. Які етапи виділяють в історичному розвитку вірусології?

7. Які українські вчені зробили внесок у розвиток вірусології?

8. Дайте визначення терміну "вірус". Які властивості мають віруси?

9. Які ознаки живого та неживого поєднують у собі віруси?

10. Які гіпотези пояснюють виникнення вірусів? Яка з гіпотез, на Вашу думку, є найбільш переконливою?

11. Як можна виділити віруси з біологічного матеріалу?

12. Як можна виділити та очистити нуклеїнові кислоти та білки вірусів?

13. Які переваги та недоліки має культивування вірусів в організмі лабораторних тварин порівняно з культивуванням у культурі клітин?

Література

1. Гудзь С.П., Перетятко Т.Б., Павлова Ю.О. Загальна вірусологія. Л.: Видавництво: Видавничий центр ЛНУ ім. Івана Франка, 2010. - 264 с.

1. Букринская А.Г. Вирусология. М.: Медицина, 1986. - 336 с.

2. Ташута Т.Г. Загальна вірусологія: посібник. К.: 2004. - 328 с.

4. Dimmock N.J., Easton A.J., Leppard K.N. Introduction to modern virology. - 6th ed., 2007. - 515 pp.

5. Carter J., Saunders V. Virology: principles and applications. John Wiley & Sons Ltd, 2007. - 358 pp.

6. Wessner D.R. The origins of viruses // Nature Education. - 2010. - Vol. 3(9):37.

Размещено на Allbest.ru