Особенности экспрессии проангиогенных mir-126 и mir-155 у больных с гипертонической болезнью и постинфарктным кардиосклерозом

Размещено на http://www.allbest.ru/

Особенности экспрессии проангиогенных mir-126 и mir-155 у больных с гипертонической болезнью и постинфарктным кардиосклерозом

Щеглова Н.Е., Калинкин М.Н.

Актуальность. Многочисленные попытки доказать генетическую природу ишемической болезни сердца (ИБС), гипертонической болезни (ГБ) и атеросклероза привели к открытию новых маркеров, в роли которых выступает класс некодирующих рибонуклеиновых кислот (РНК), так называемые «малые РНК» [9, 14].

Микрорибонуклеиновые кислоты (микроРНК) - класс некодирующих РНК, обычно имеющих длину 19-24 нуклеотида, образуемые из более длинных РНК-предшественников и имеющих специфическую шпилечную структуру [13]. С момента открытия влияния микроРНК на биологические процессы предполагается, что мутации, поражающие микроРНК, могут играть патогенетическую роль в заболеваниях человека [10, 12].

Текущие доказательства указывают, что изменение экспрессии специфических микроРНК связано с широким диапазоном болезней человека, включая сахарный диабет, сердечно-сосудистые заболевания. Кроме того, микроРНК могут активировать или подавлять опухолевый рост в человеческом организме [12].

По механизму действия микроРНК могут быть разделены на проангиогенные микроРНК, запускающие ангиогенез, и антиангиогенные микроРНК, подавляющие его [14].

В настоящей статье изучены проангиогенные микроРНК на примере miR-126 и miR-155. Так, miR-126 специфически на высоком уровне экспрессируется в эндотелиальных клетках. В некоторых исследованиях было показано, что miR-126 регулирует экспрессию васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов (FGF), которые являются индукторами ангиогенеза [1]. Как известно, экспрессия этих факторов играет определяющую роль в развитии коллатеральных сосудов при ишемии миокарда. постинфарктный кардиосклероз ангиогенез

Другие исследования показывают, что 1 тип рецепторов к ангиотензину II (АТ1Р) и miR-155 совместно экспрессируются в эндотелиальных и гладкомышечных клетках, и что miR-155 подавляет экспрессию АТ1Р. Показано также, что, стимуляция фибробластов трансформирующим фактором роста-бета 1 уменьшает экспрессию микроРНК и повышает экспрессию человеческого АТ1Р, демонстрируя физиологическую регулирующую роль miR-155 [14].

Вместе с тем, следует указать, что данные об уровне проангиогенных miR-126 и miR-155 в условиях выраженного атерогенеза в литературе отсутствуют. В тоже время проведение подобного исследования представляется, безусловно, актуальным, особенно с учетом распространенности атеросклероза и его осложнений.

Цель исследования - изучение экспрессии miR-126 и miR-155 у больных с ГБ и ИБС постинфарктным кардиосклерозом (ИБС ПИКС).

Материалы и методы. Было обследовано 50 мужчин, находившихся на стационарном лечении в кардиологическом отделении Областной клинической больницы города Твери, и 15 здоровых мужчин.

Сформированы выборки из трех групп сравнения. В I группу включили 15 здоровых мужчин от 29 до 47 лет (средний возраст 33,93±1,14 лет), данная группа рассматривалась как контрольная. II группа состояла из 30 пациентов, страдающих ГБ в возрасте от 29 до 65 лет (средний возраст 47,73±1,97 лет). Критерии групповой принадлежности: мужской пол и наличие ГБ I-II стадии без систолической дисфункции миокарда левого желудочка [4] и отсутствие на момент обследования диагноза ИБС. В III группу были включены 20 мужчин, имеющих в анамнезе подтвержденный клинически и лабораторно инфаркт миокарда в возрасте от 46 до 84 лет (средний возраст 60,4±1,9 лет). Критерии включения в данную группу больных: наличие верифицированного диагноза ИБС ПИКС. Критерии исключения: лица, страдающие сахарным диабетом, сопутствующими заболеваниями почек, легких, желудочно-кишечного тракта, печени, заболеваниями крови и нарушениями обмена веществ, отягощенным аллергологическим анамнезом, аллергическими заболеваниями и профессиональными вредностями.

Общая РНК, включая микроРНК, была получена комбинированным методом из плазмы крови с помощью набора miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) и лизирующего реагента TRIzol® LS Reagent (Invitrogen, США), описанным в литературе [6]. Для образцов микроРНК с концентрациями от 25 нг/мкл проводили обратную транскрипцию на четырехканальном амплификаторе «Veriti» («Applied Biosystems», США) для получения комплементарной дезоксирибонукленовой кислоты (кДНК) с использованием набора TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit по стандартной схеме, представленной производителем. Реакционную смесь, содержащую тотальную микроРНК и смесь для проведения обратной транскрипции, подвергали нагреванию в несколько циклов:

- 30 минут при 16°С,

- 30 минут при 42°С,

- 5 минут при 85 °С,

- и далее нагревание при 4°С.

Экспрессию miR-126 и miR-155 оценивали с помощью показателя ?С_t [11], который определяли трижды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на приборе «ABI Prism 7500» с помощью набора Taq Man Small RNA Assays («Applied Biosystems», США) с применением полученной кДНК и праймеров miR-126, miR-155 с использованием стандартного протокола, предложенного производителем. В качестве эндогенного контроля использовали праймер RNU6B, показывающий относительно стабильную экспрессию, независимо от того в каких тканях и клеточных культурах определяется [7].

Методы статистической обработки данных. Накопление, корректировка, систематизация и визуализация полученных результатов проводилась в электронных таблицах «Excel». Для расчета количественного изменения микроРНК использовали метод 2 ^-??Сt, предложенный K. J. Livak и T. D. Schmittgen [8], где Ct - это пороговое значение цикла, где флуоресценция впервые фиксируется достоверно выше порогового уровня.

Попарное сравнение показателей ДCt контрольной группы с группами ГБ и ИБС ПИКС проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни, который используется для оценки различий между двумя малыми выборками по уровню количественно измеряемого признака. Биометрический анализ осуществлялся с использованием пакета WINPEPI (PEPI-for-Windows).

За уровень статистической значимости принимали p < 0,05.

Результаты и обсуждение. Согласно данным литературы, нарушение функционирования определенных микроРНК может способствовать развитию сердечно-сосудистых заболеваний, в частности, ИБС, атеросклероза, постинфарктного ремоделирования миокарда, хронической сердечной недостаточности и сократительной дисфункции сердца [3]. При этом, как правило, при каждой патологии меняется экспрессия не одной, а множества микроРНК, а для ряда заболеваний спектр задействованных микроРНК перекрывается [2].

Считается, что повышением или понижением уровня экспрессии микроРНК в исследуемом образце крови или ткани является изменение значения уровня этой экспрессии в пять и более раз по отношению к контрольному образцу [5].

Полученные результаты изучения уровня экспрессии микроРНК у больных ГБ и ИБС ПИКС представлены в табл. 1 - 2.

В табл. 1 показано, что в настоящем исследовании уровень экспрессии miR-126 оказался в 256 раз выше у больных с ГБ и почти в 267 раз выше раз у больных ИБС ПИКС по сравнению с контрольной группой.

Таблица 1. Показатели уровня экспрессии miR-126 у больных ГБ и ИБС ПИКС

Примечания: здесь и далее: ДCt - разность между значениями Ct исследуемой микроРНК и эндогенного контроля, M - среднее значение уровня экспрессии микроРНК, m - стандартная ошибка среднего, ДДCt - разность между значениями ДCt исследуемого образца и контрольного, 2^-??Ct - формула для подсчета уровня экспрессии исследуемой микроРНК.

Прямых доказательств участия данной микроРНК в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний в литературе не описано, хотя по данным некоторых авторов miR-126 может играть важную роль в развитии сосудистой патологии и процессах внутрисосудистого ремоделирования [14]. Также проведенное в 2011 году исследование, показало существование обратной корреляции увеличения уровня miR-126 с улучшением ряда физиологических параметров у пациентов с сердечной недостаточностью [3].

Анализ табл. 2 показывает, что в данном исследовании уровень экспрессии miR-155 остается неизменном как у больных ГБ, так и у пациентов с ИБС ПИКС.

Таблица 2. Показатели уровня экспрессии miR-155 у больных ГБ и ИБС ПИКС

Правильность сделанных выводов была подтверждена проведением попарного сравнения показателей ДCt контрольной группы с группами ГБ и ИБС ПИКС с помощью U-критерия Манна-Уитни. При этом были получены сходные результаты. Так, было показано, что группы больных ГБ и ИБС ПИКС достоверно отличаются от контрольной группы по уровню плазменной miR-126 (p<0,001), для miR-155 достоверных различий получено не было (табл. 3).

Таблица 3. Сравнение показателей ДCt в контрольной группе, у больных ГБ и ИБС ПИКС с помощью U-критерия Манна-Уитни

Примечания: * - статистическая значимость различий (р<0,05) между группой больных ГБ и контрольной, ** - статистическая значимость различий (р<0,05) между группой больных ИБС ПИКС и контрольной.

Выводы

Таким образом, в результате проведенных нами исследований обнаружено, что уровень экспрессии miR-126 у больных ГБ и ИБС ПИКС достоверно отличается от контрольной группы здоровых людей. С другой стороны, изменение уровня экспрессии miR-155 не удалось ассоциировать с изученными заболеваниями, что, возможно, указывает на отсутствие выраженной роли miR-155 в патогенезе сердечно-сосудистой патологии.

Полученные данные свидетельствуют о том, что miR-126 может использоваться в качестве специфической микроРНК для изучения патогенеза и разработки патогенетической терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

Список использованных источников

1. Ишемическая болезнь сердца: регулирование с помощью микроРНК / Коробов Г.А. и др. // Кардиологический вестник. - 2011. - Т. VI (XVIII). - №2. - С. 5-9.

2. Роль микро-РНК, генов их биогенеза и функционирования в развитии патологических состояний у человека / А.Н. Кучер, Н.П. Бабушкина // Медицинская генетика. - 2011. - №1. - С. 3 - 13.

3. Перспективы применения микроРНК в диагностике и терапии сердечной недостаточности / Кочетов А.Г. и др. // Кардиологический вестник. - 2014. - №2. - С. 62 - 67.

4. Чазова И.Е. Диагностика и лечение артериальной гипертензии (Рекомендации Российского медицинского общества по артериальной гипертонии и Всероссийского научного общества кардиологов) // Системные гипертензии. - 2010. - № 3. - С. 5-27.

5. Шевченко С. П. Современные клинические и молекулярно-генетические подходы к диагностике и лечению рака щитовидной железы: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. - Новосибирск, 2011. - 40 с.

6. Keller A., Leidinger P., Borries A., Wendschlag A., Wuncherpfenning F., Scheffler M., Huwer H., Lonhof H-P., Meese E. miRNA in lung cancer - Stadying complex fingerprints in patient's blood cells by microarray experiments // BMC Cancer 2009, 9:353 doi:10.1186/1471-2407-9-353.

7. Lamba1 V., Ghodke-Puranik1 Y., Guan W., Lamba1J. K. Identification of suitable reference genes for hepatic microRNA quantitation // BMC Research Notes 2014, 7:129 doi:10.1186/1756-0500-7-129.

8. Livak K. J., Schmittgen T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real- Time Quantitative PCR and the 2-??Ct Method // METHODS 25. 2001. P. 402-408.

9. Meder B., Keller A., Vogel B., Haas J., Sedaghat-Hamedani F., Kayvanpour E., Juas S., Borries A., Rudloff J., Leidinger P., Meese E., Katus H.A., Rottbauer W. MicroRNA signatures in total peripheral blood as novel biomarkers for acute myocardial infarction // Basic Res. Cardiol. - 2010. DOI 10.1007/s00395-010-0123-2.

10. Meola N., Alessandro A.G., Banti S. microRNAs and genetic diseases // PathoGenetics 2009, 2:7. doi:10.1186/1755-8417-2-7.

11. M. Tevfik Dorak Real-time PCR. - Taylor & Francis Group, an informa business. - 2006. - 333 p.

12. Shah А. А., Leidinger P., Blin N. and Meese E. miRNA: Small Molecules as Potential Novel Biomarkers in Cancer // Current Medicinal Chemistry. -2010. Vol. 17. - P. 4427-4432.

13. Shah A.A., Meese E., Blin N. Profiling of regulatory microRNA transcriptomes in various biological processes: a review// J. Appl. Genet. - 2010. Vol. 51(4). - P.501-507.

14. Urbich C., Kuehbacher A., Dimmeler S. Role of microRNAs in vascular diseases, inflammation, and angiogenesis // Cardiovascular Research. - 2008. Vol. 79. - P. 581-588.

Размещено на Allbest.ru