Изучение влияния препарата Габриглобин на иммунокомпетентные клетки больных хронической аутоиммунной крапивницей в тесте ex vito

Размещено на http://www.allbest.ru/

8

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРЕПАРАТА ГАБРИГЛОБИН НА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫЕ КЛЕТКИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ АУТОИММУННОЙ КРАПИВНИЦЕЙ В ТЕСТЕ EX VIVO

Ащина Л.А.,

Баранова Н.И.,

Орлова Е.А.,

Алешкин В.А.,

Новикова Л.И.,

Лютов А.Г.

Пензенский институт усовершенствования врачей

Введение

На сегодняшний день хроническая рецидивирующая крапивница (ХРК) занимает одно из ведущих мест в аллергопатологии и представляет собой сложную медико-социальную проблему [8]. В структуре ХРК выделяют аутоиммунную форму (ХАК), которая по данным разных авторов составляет от 30 до 50% [10, 12]. Пациенты с аутоиммунным механизмом развития крапивницы имеют наиболее тяжелое течение заболевания и с трудом поддаются лечению. Иммунные механизмы с участием цитокинов играют главную роль в патогенезе ХАК и до настоящего времени остаются мало изученной проблемой. Известно, что при аутоиммунных заболеваниях происходит активация CD4+ популяции по типу Th1, которая характеризуется избыточным синтезом интерферона-гамма (ИФН-г) и ИЛ-17 [11]. Высокие концентрации ИФН-г могут запускать аутоиммунный процесс и оказывать регулирующее действие на рецепторы клеток-мишеней [14]. Противоположным действием обладает ИЛ-10, который подавляет этот процесс и участвует в реакциях аутоиммунитета [16]. Участие в патогенезе ХАК ИЛ-18 доказано в плане фактора, высвобождающего гистамин [15]. В настоящее время актуальным направлением в лечении больных с аутоиммунным механизмом крапивницы является применение внутривенных иммуноглобулинов, одним из которых является отечественный препарат Габриглобин. Однако влияние данного препарата на иммунокомпетентные клетки (ИКК) больных ХАК не изучено. В последние годы проводятся многочисленные исследования с применением тестов ex vivo с целью изучения влияния лекарственных препаратов на состояние клеток иммунной системы, прогнозирования развития аллергических заболеваний [5, 6]. Метод ex vivo по мнению большинства исследователей должен занять центральное место в современной иммунодиагностике [9]. Преимуществами данного метода перед методами in vitro является использование цельной крови без выделения клеточных культур, что упрощает методику анализа и снижает нежелательную активацию или гибель клеток. Также, культивирование клеток крови идет в более естественном окружении, сохраняется баланс всех гуморальных факторов, что соответствует условиям in vivo.

Цель работы. Отработка диагностически значимой дозы препарата Габриглобин для оценки влияния данного препарата на продукцию цитокинов ИКК у больных ХАК.

Материалы и методы

В исследование было включено 22 пациента с хронической аутоиммунной крапивницей до и после лечения препаратом Габриглобин. Средний возраст пациентов составил 47±12 лет. В контрольную группу вошло 15 здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой. Диагноз ХАК устанавливался на основании жалоб, данных анамнеза, клинической картины, длительности заболевания, анализа данных сопутствующих заболеваний. Для подтверждения диагноза всем пациентам ставилась проба с аутосывороткой [13]. В исследование были взяты пациенты, имеющие положительную пробу с аутосывороткой диаметром 7 мм и более, которая является диагностическим критерием ХАК [4]. Подбор диагностически значимой дозы Габриглобина производился на 15 здоровых донорах методом ex vivo, в основе которого лежала запатентованная работа Исаченко Е.Г. о способе оценки резервных возможностей ИКК [7]. Критерий, по которому подбиралась диагностически значимая доза Габриглобина был процент здоровых людей с максимальной выработкой цитокинов ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и ИФН-г ИКК [2]. В работе были использованы концентрации Габриглобина 1:1, 1:3, 1:10. Пациентам до и после лечения препаратом Габриглобин был проведен тест ex vivo с диагностически значимыми концентрациями данного препарата.

Способ осуществления метода ex vivo

1 этап - забор крови. Кровь отбирали из локтевой вены в стерильную силиконизированную пробирку с гепарином. Далее кровь разбавляли в 5 раз стерильной питательной средой 199 с глутамином («Биолот», Санкт-Петербург).

2 этап - инкубация крови, стимулированной Габриглобином для выработки ИКК цитокинов ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и ИФН-г. Для этого в 3 пробирки добавляли по 675 мкл разбавленной в 5 раз крови, далее в 1-ю пробирку - 75 мкл Габриглобина в концентрации 1:1, во 2-ю - 75 мкл Габриглобина в концентрации 1:3, в 3-ю - 75 мкл Габриглобина в концентрации 1:10. Пробирки инкубировали в термостате в течении 6 часов при 37°С. Затем охлаждали и центрифугировали 5 минут при 800g. Супернатант отбирали и замораживали при -20°С.

3 этап - определение концентрации цитокинов ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и ИФН-г в супернатанте методом иммуноферментного анализа наборами ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Статистическая обработка результатов проводилась на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0». Качественные переменные описывались абсолютными и относительными частотами, количественные переменные представлялись в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха от 25 до 75%. Сравнение количественных признаков в независимых группах проводили по методу Манна-Уитни, в зависимых - с использованием критерия Вилкоксона. Результаты считали достоверными при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе работы были получены следующие результаты. Как видно из данных табл. 1, у 67% здоровых людей максимальная выработка ИКК ИЛ-10 наблюдалась при концентрации Габриглобина 1:3, у 22% - при концентрации 1:10 и лишь у 11% при концентрации препарата 1:1. Из этого следует, что оптимальной концентрацией Габриглобина для выработки ИКК ИЛ-10 является концентрация 1:3. При изучении показателей выработки ИКК ИЛ-17 было установлено, что у 50% здоровых людей максимальная выработка ИКК достигалась при концентрации Габриглобина 1:3, у 30% - при концентрации Габриглобина 1:1 и у 20% - при концентрации 1:10. Поэтому, оптимальную концентрацию Габриглобина для выработки ИКК ИЛ-10 составляет концентрация 1:3. Также в работе было установлено, что у 70% здоровых доноров максимальная продукция ИКК ИЛ-18 наблюдалась при концентрации Габриглобина 1:10, у 20% - при концентрации 1:1 и лишь у 10% - при концентрации 1:3. Из это следует, что диагностически значимой концентрацией Габриглобина по выработке ИКК ИЛ-18 является концентрация 1:10. При исследовании показателей продукции ИФН-г было выявлено, что оптимальной концентрацией Габриглобина является концентрация 1:3, так как у 60% здоровых людей максимальная продукция этого цитокина ИКК была именно при концентрации Габриглобина 1:3 и лишь у 40% - при концентрации 1:10.

Таблица 1. Отработка диагностически значимых доз препарата Габриглобин в тесте ex vivo на здоровых людях

Таким образом, при изучении показателей продукции ИКК ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и ИФН-г было выявлено, что диагностически значимая концентрация Габриглобина для выработки ИЛ-10, ИЛ-17, ИФН-г составила концентрация 1:3, а для ИЛ18 - концентрация 1:10.

Следующим этапом работы было изучение влияния диагностически значимых доз препарата Габриглобин на выработку ИКК цитокинов ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и ИФН-г у больных ХАК в сравнении с показателями цитокинов у здоровых людей. Как видно из данных табл. 2, в группе больных ХАК наблюдался достоверно более высокий уровень ИЛ-17 (р=0,00123). Это согласуется с данными об участии ИЛ-17 в развитии аутоиммунной патологии и о повышенном уровне данного цитокина у больных ХАК [3, 16]. При изучении показателей цитокинов ИЛ-10, ИЛ-18 и ИФН-г в группе больных по сравнению с контрольной группой достоверных различий выявлено не было.

Следующим разделом работы было сравнительное исследование изучаемых цитокинов с диагностически значимыми концентрациями Габриглобина у больных ХАК до и после лечения данным препаратом. Согласно полученным результатам (таблица 2) было выявлено достоверное снижение уровня ИЛ-10 (р=0,0277) в группе больных ХАК после лечения препаратом Габриглобин по сравнению с группой больных до лечения. Этот факт можно объяснить тем, что после лечения препарат Габриглобин способствует связыванию и изменению свойств иммунных комплексов, а также выведению патологических аутоантител при аутоиммунной патологии [1]. При изучении показателей цитокинов ИЛ-17, ИЛ-18 и ИФН-г у больных ХАК до и после лечения препаратом Габриглобин достоверных различий выявлено не было.

Таблица 2. Сравнительная оценка влияния диагностически значимых доз препарата Габриглобин на выработку цитокинов ИКК у больных ХАК до и после лечения данным препаратом и здоровых лиц

Примечания: *- достоверность различий показателей цитокинов у больных до лечения и здоровых людей; ** - достоверность различий показателей цитокинов у больных до и после лечения

Выводы

1. Отработана диагностически значимая концентрация препарата Габриглобин для ИЛ-10, ИЛ-17, ИФН-г в тесте ex vivo, которая составляет 1:3, а для ИЛ-18 - концентрация 1:10.

2. Сравнительный анализ выработки ИКК ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и ИФН-г под влиянием диагностически значимых концентраций препарата Габриглобин показал достоверно более высокий уровень ИЛ-17 в группе больных ХАК до лечения по сравнению с аналогичными показателями в группе здоровых лиц.

3. У больных ХАК после лечения препаратом Габриглобин в тесте ex vivo был выявлен более низкий уровень ИЛ-10 по сравнению с больными до лечения.

препарат габриглобин цитоклин крапивница

Список использованных источников:

1. Алешкин В.А., Лютов А.Г., Новикова Л.И., Борисова И.В., Кострова О.М., Волков А.В. Иммуноглобулиновые препараты и их иммуномодулирующее действие// Матер. Всеросс. НПК. 2008. - с. 11-15.

2. Баранова Н.И. Оценка реактивности Т-лимфоцитов к аллергенам Staphylococcus aureus и Candida ablicans у больных с аллергическими заболеваниями дыхательных путей: Дис. … канд. биол. наук. - Пенза-Москва, 1997, 100 с.

3. Бережная Н.М., Сепиашвили Р.И. Семейство интерлейкинов-17// Аллергология и иммунология. 2010. - Т. 11, №3. - С.213-223.

4. Больц Е.А. Методы диагностики аутоиммунной крапивницы и эффективность лечения с использованием отечественного препарата «Габриглобин IgG»: Дис … канд. мед. наук. - Пенза-Москва, 2012, 138 с.

5. Зурочка В.А., Долгушин И.И., Симбирцев А.С.Влияние иммуномодулятора Бестима in vitro на спонтанную и индуцированную продукцию цитокинов IFN?, IL-1?, IL-4, IL-8, IL-10 иммунокомпетентными клетками крови условно здоровых лиц// Цитокины и воспаление. 2007. - Т.6, №1. - С. 31-35.

6. Исаченко Е.Г. Виткина Т.И. Геронина С.А. Потапов В.Н., Бердышев Е.В. Спонтанный и липополисахаридный синтез цитокинов клетоками крови человека в норме и при аллергопатологиях// Иммунология. 1999.- №5.- С. 37-39.

7. Исаченко Е.Г. Способ оценки резервных возможностей иммунокомпетентных клеток// Аллергология. 2006. - №2.- С.44-47.

8. Таха Т.В. Новые возможности в терапии крапивницы. // Российский медицинский журнал. 2011. - №11.- с. 678-682.

9. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы. - М.- 2009.

10. Altrich M.L., Halsey J.F., Altman L.C. Comparison of the in vivo au-tologous skin test with in vitro diagnostic tests for diagnosis of chronic autoimmune urticaria.// Allergy Asthma Proc. 2009. Jan-Feb; 30(1):28-34.

11. Gluck J., Brzoza Z., Rogala B. Flow cytometric analysis of type 1 and type 2 subsets of CD4 and CD8 cells in intermittent allergic rhinitis and chronic ur¬ticaria - methodological aspects// Przegl Lek. 2004. 61(7):802-6.

12. Goh С.L, Tan K.T. Chronic autoimmune urticaria: where we stand?// Indian J Dermatol. 2009 Jul-Sep. 54(3): 269-274.

13. Нide M., Francis D.M., Grattan C.E., Hakimi J., Kochan J.P., Greaves M.W. Autoantibodies against high-affinity IgE receptor as a cause of histamine release of chronic urticaria// N. Engl. J. Med. - 1993. - № 328. - p. 1599-1604.

14. Kweon M., Takahashi I., Kiyono H. New insights into mechanism of in-flammatory and allergic diseases in mucosal tissues// Digestion. 2001; 63:1-11.

15. Ibrahim S.A, Khalifa N.A. Interleukin-18 correlates with dis-ease severity in chr6nic autoimmune urticaria// Egyptian Dermatology Online Journal. 2009 Jun; 5(1): 1.

16. Santos J.K, Azor M.H., Nojima V.Y. etc. Increased circulating pro-inflammatory cytokines and imbalanced regulatory T-cell cytokines production in chronic idiopatic urticaria// Int Immunopharmacol. 2008 oct; 8 (10): 1433-40.

17. Алешкин В.А., Молотилов Б.А., Орлова Е.А., Больц Е.А., Новикова Л.И., Лютов А.Г. Новый подход к лечению хронической аутоиммунной крапивницы// Врач-аспирант, №6.3(55), 2012. - С. 445-451

18. Орлова Е.А., Костина Е.М., Молотилов Б.А., Левашова О.А. Лейкотриеновый статус у больных хронической крапивницей и бронхиальной астмой// Врач-аспирант, №6.2(55), 2012. - С. 323-330

Размещено на Allbest.ru