Изменения паракринной регуляции межклеточных взаимодействий в патогенезе функциональных кист яичников

Размещено на http://www.allbest.ru//

Изменения паракринной регуляции межклеточных взаимодействий в патогенезе функциональных кист яичников

Волченок Д.А.

Введение

Актуальность исследования патогенеза функциональных кист яичников (ФКЯ) определяет высокая распространенность данной патологии среди женщин репродуктивного возраста (55,2% случаев), необходимость экстренной госпитализации и оперативного вмешательства при осложненном клиническом течении [1]. Рецидивирующее течение ФКЯ и низкая эффективность консервативного лечения могут становиться причиной инфертильности, а повреждения ткани яичника при оперативном лечении снижают овариальный резерв и негативно отражаются на результатах применения вспомогательных репродуктивных технологий у данных пациенток [2, 3]. Открытие роли факторов локальных внутрияичниковых механизмов паракринной регуляции в физиологическом течении фолликулогенеза и ангиогенеза позволяет более детально изучить цепочку регуляторных взаимодействий при различных патологиях [4, 5, 6, 7]. Изучение факторов паракринной регуляции взаимодействий между ооцитом и окружающими его клетками гранулезы позволит исследовать не только патогенез функциональных кист яичников, но и механизмы формирования сопутствующей овариальной недостаточности. Основными и наиболее изученными факторами взаимодействия в системе ово-соматического гистиона являются костный морфогенетический протеин (BMP) 15 [8, 9, 10], и коннексин (Cx) 37 [11].

Доказано, что фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является одним из важнейших факторов, обеспечивающих сосудистый рост в яичнике на этапах созревания и селекции фолликулов, а также фазах функционирования желтого тела [12].

Ангиогенез представляет собой сложный процесс взаимодействия стимулирующих и подавляющих сигналов, генерируемых множеством факторов микроокружения. VEGF стимулирует митогенную активность, подавляет апоптоз эндотелиоцитов, вызывает повышение сосудистой проницаемости. Кроме того, VEGF поддерживает транспорт энергетических субстратов в эндотелиоциты [13, 14, 15]. Интерес исследователей к изучению экспрессии данного фактора в патогенезе формирования ФКЯ обусловлен тем, что VEGF формирует стабильный кровоток в сосудах яичника, повышает проницаемость стенки микрососудов антрального фолликула с последующей аккумуляцией фолликулярной жидкости, ингибированием апоптоза [14, 15].

Цель исследования: изучить экспрессию BMP 15, Cx 37, VEGF при моделировании экспериментальных функциональных кист яичников.

Материал и методы. Экспериментальные животные - половозрелые самки крыс линии Wistar массой 180-220 г. I группа (основная, n=35) - моделирование функциональных кист яичников путем введения фолликулостимулирующего гормона. II группа (контроль, n=20) - интактные животные. Для формирования экспериментальных функциональных кист яичников экспериментальным животным вводился рекомбинантный ФСГ (рФСГ) 1,5 МЕ (производитель - «Индустрия Фармасьютика Сероно С.п.А.» Индустриальная зона Модугно, 1-70123 Бари, Италия) в течение 7 дней в первой половине дня внутримышечно в ягодичную область. Исследование одобрено Этическим комитетом ГБОУ ВПО СибГМУ Росздрава № 4356 от 30.11.2015.

Яичники экспериментальных животных фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин. Иммуногистохимическая методика исследования экспрессии BMP 15, Cx 37, VEGF включала в себя использование стрептавидин-биотиновой системы детекции Abcam®PLC (Великобритания) Rabbit Specific HRP/DAB (ABC) Detection IHC Kit. Для высокотемпературной демаскировки антигена. Результат определяли по коричневому окрашиванию цитоплазмы и мембраны. Полуколичественную оценку проводили по формуле H-score (1 х % слабо позитивных клеток) + (2 х % умеренно позитивных клеток) + (3 х % сильно позитивных клеток).

Методы статистики. Для статистической обработки и анализа результатов использовали программу IBM SPSS Statistics v.23.0 5. Для проверки формы распределения данных использовали разведочный анализ (критерий Шапиро-Уилка). Учитывая данные представленных выше критериев, проводилось исследование сравниваемых групп U-критерием Манна-Уитни (критический уровень значимости p=0,05).

Результаты. С применением методики иммуногистохимического анализа в яичниках дифференцированы маркёры взаимодействия ооцита и клеток гранулезы (BMP15, Cx37), а также фактор ангиогенеза VEGF. Экспрессия изучаемых факторов при моделировании ФКЯ оказывалась типичной. Для оценки степени экспрессии и её изменения у животных сравниваемых групп применялась методика H-score.

Рисунок 1. Экспрессия BMP 15 и Cx 37 на 7-е сутки эксперимента. Черная стрелка указывает на овоцит, желтая - на фолликулоцит. А - экспрессия BMP 15 в первичном фолликуле на 7 сутки моделирования ФКЯ; В - экспрессия BMP 15 в третичном фолликуле на 7 сутки моделирования ФКЯ; С - экспрессия Cx 37 во вторичном фолликуле на 7 сутки моделирования ФКЯ. Окраска DAB, докраска гематоксилином. Ув. Х 400.

киста яичник ооцит межклеточный

Экспрессия BMP-15 выявлялась в овоцитах, фолликулоцитах яйценосного бугорка, тека-клетках, стромальных клетках коркового вещества, лютеоцитах желтого тела, поверхностных эпителиоцитах. В овоцитах примордиальных (ПФ) и первичных фолликулов (ПРФ), а также в овоцитах растущих фолликулов с начальными признаками атрезии, в которых половая клетка была сохранна, интенсивность экспрессии была наиболее выраженной, в овоцитах вторичных (ВРФ) и третичных фолликулов (ТРФ) - наименее выраженной. Фолликулярный эпителий окрашивался менее интенсивно, экспрессия усиливалась соответственно стадии развития фолликулов. На 7-е сутки введения ФСГ увеличивалась интенсивность иммуноокраски овоцитов всех типов фолликулов (рис. 1А, рис. 1В). В ранние сроки опыта (7-е сутки) в ПФ повышалась интенсивность окраски эпителиоцитов гранулёзы, во ВРФ и ТРФ изменений не обнаруживалось. К 15-м суткам опыта экспрессия BMP-15 снижалась во всех типах фолликулов, а к 30-м соответствовала таковой в контроле (рис. 2).

Рисунок 2. Экспрессия BMP 15 в ооцитах и фолликулярном эпителии различных типов фолликулов (H-score, M).

Примечание: ПФ - примордиальные фолликулы, ПРФ - первичные фолликулы, ВРФ - вторичные фолликулы, ТРФ - третичные и зрелые фолликулы, АФ - атретические фолликулы и тела, * - значимые отличия от контроля тестом Манна-Уитни (критическое p=0,05).

Экспрессия Cx 37 была выявлена в ооцитах, zona pellucida, висцеральных фолликулоцитах, клетках кумулюса, отдельных лютеоцитах и эндотелиоцитах сосудов яичников крыс. Ооциты окрашивались более интенсивно, чем фолликулоциты (рис. 1С). Динамика изменения интенсивности окраски овоцитов и фолликулоцитов соответствовала стадии развития фолликулов. Экспрессия Cx 37 усиливалась в конце преантральной стадии. Фолликулы антральной и преовуляторной стадии (ВРФ и ТРФ) окрашивались диффузно, что связано с неравномерной иммунолокализацией маркёра в фолликулоцитах, снижением экспрессии фактора в ооците.

При моделировании ФКЯ с помощью введения ФСГ отмечалась волнообразная динамика окрашивания ооцитов, аналогичная контролю, более выраженная в ооцитах ВРФ и ТРФ на 7-х сутках эксперимента (рис. 3). Фолликулярный эпителий ПРФ окрашивался слабее контроля. От 15-х до 30-х суток опыта экспрессия белка щелевого взаимодействия в ооцитах не отличалась от таковой в контроле, однако снижение иммунной окраски в фолликулоцитах отмечалось до 30-х суток эксперимента.

Рисунок 3. Экспрессия Cx 37 в ооцитах и фолликулярном эпителии различных типов фолликулов (H-score, M). Примечание: аналогично предыдущей диаграмме.

Экспрессия VEGF проявлялась в виде коричневого окрашивания мембраны и цитоплазмы фолликулоцитов и клеток эндотелия. Выявлена высокая частота положительной экспрессии VEGF в эндокриноцитах функциональных кист яичника. Иммунопозитивное окрашивание слабой и умеренной интенсивности наблюдалось на поверхности ооцитов (мембранное) и лютеоцитах желтого тела. На 7-е сутки моделирования ФКЯ экспрессия фактора была максимально выраженной в фолликулоцитах растущих фолликулов, с 15-х суток экспрессия VEGF не отличалась от контроля (таблица 1). Экспрессия маркера в эндотелиоцитах на 30-е сутки не отличалась от контроля.

Таблица 1. Экспрессия VEGF (H-score, Me; Q25-Q75)

Примечание: 1 Ме - медиана; Q25 и Q75- 25- и 75 процентили, соответственно; *- выявлены различия в сравнении с контролем со значимостью р < 0,05.

Обсуждение и выводы. Исследование впервые установило изменения факторов паракринной регуляции ово-соматического взаимодействия и ангиогенеза при формировании экспериментальных функциональных кист яичников. При моделировании ФКЯ на 7-е сутки введения рФСГ выявлено повышение экспрессии BMP 15 в ооцитах во всех типах растущих фолликулов и Cx 37 в антральных фолликулах. К 15-м суткам опыта экспрессия BMP 15 наиболее выражена в ооцитах растущих фолликулов, появляется в примордиальных, снижается в фолликулах с признаками атрезии, в которых половая клетка была сохранна. В фолликулоцитах первичных фолликулов наблюдается снижение Cx 37, усиление экспрессии BMP 15. На 30-е сутки эксперимента высокая экспрессия BMP 15 сохраняется в ооцитах первичных фолликулов.

Роль BMP 15 заключается в росте и дифференцировке клеток гранулезы и теки на гонадотропин-независимой стадии фолликулогенеза [8]. Подтверждением является максимальная экспрессия данного фактора в преантральных фолликулах в проведённом исследовании, что согласуется с данными литературы [8]. ВМР-15 синтезируется овоцитом. Генеральная концепция последних лет заключается в том, что в регуляции преантральных стадий фолликулогенеза, включая многослойные фолликулы, главную роль играет сам овоцит. Овоцит человека экспрессирует большие количества регуляторных белков GDF-9 и BMP-15, которые способны стимулировать рост многослойных фолликулов в условиях in vitro и осуществлять защиту клеток фолликула от апоптоза. Считается, что указанные вещества, синтезируемые овоцитом, стимулируют митозы фолликулярных эпителиоцитов и пространственное оформление слоев фолликулярного эпителия в первичных многослойных фолликулах, при этом существует определенная динамика их синтеза в течение половых циклов. Усиление экспрессии BMP 15 предотвращает апоптоз клеток гранулёзы, что проявляется активацией фолликулярного роста, увеличением растущих фолликулов.

Важным событием в развитии первичных фолликулов, способствующим активации пролиферации и гипертрофии эпителиальных клеток, является начало экспрессии белков группы коннексинов и образование межклеточных щелевых контактов (GJ) между овоцитом и клетками фолликулярного эпителия [11]. Благодаря этим контактам осуществляется диффузия ионов, метаболитов и потенциальных сигнальных единиц (цАМФ, Са2+) в овоцит и обратно - к клеткам фолликулярного эпителия.

Полагают также, что белковые субстраты группы коннексина-37 используются овоцитом для трофики, а в последующем совместно с другими регуляторными сигналами реинициируют мейоз. Как и в примордиальных фолликулах, овоциты первичных фолликулов пребывают в состоянии блока мейоза, несмотря на то что рост половых клеток существенно активизируется.

В ходе формирования фолликулярной полости (кавитации) в клетках фолликулярного эпителия облигатно экспрессируются кит-лиганд, а в овоците - Сх37. Если в регионе фолликула данные белки отсутствуют, полостной фолликул не развивается, и возникают ановуляторные формы бесплодия.

В проведенном исследовании было выявлено усиление экспрессии Сх37 в ооцитах полостных фолликулов на 7-е сутки, что является необходимым условием для нормального течения поздних стадий фолликулогенеза, и характерно для доминантного фолликула до овуляции. Экспрессия протеина в фолликулярном эпителии первичных фолликулов снижается, однако не приводят к нарушению возобновления мейоза в ооците растущего фолликула [11].

На 15-е сутки эксперимента экспрессия BMP 15 в ооцитах всех типов растущих фолликулов наиболее выражена по сравнению с контролем и 7-ми сутками. Следует отметить появление значимо более высокой экспрессии BMP 15 в ооцитах уже со стадии примордиальных фолликулов, что согласуется со вступлением избыточного количества фолликулов в рост.

На 30-е сутки опыта сохраняется высокая экспрессии BMP 15 в первичных фолликулах, что соотносится с завершением цикла фолликулогенеза. По данным литературы, ВМР 15 и Cx37 являются протекторами клеток гранулезы не только от апоптоза, но и преждевременной лютеинизации [9, 10]. В проведённом исследовании экспрессия BMP 15 и Cx 37 в ооцитах ВРФ и ТРФ не отличается от таковых в контроле, но снижается по сравнению с предыдущими точками опыта.

Белок VEGF - один из основных стимуляторов ангиогенеза и повышения проницаемости сосудов [13]. Полученные результаты согласуются с опубликованными иммуногистохимическими исследованиями, показавшими повышенную экспрессию VEGF в стенке функциональных кист яичников [15]. Усиление процессов ангиогенеза (повышением экспрессии VEGF) в ранние сроки моделирования функциональных кист связано с усилением пролиферации фолликулоцитов, что является одним из звеньев патогенеза ФКЯ и ответом на стимуляцию фолликулярного эпителия ФСГ.

Заключение

Усиление экспрессии факторов ово-соматического взаимодействия (BMP 15 и Cx 37) и ангиогенеза (VEGF) в ранние сроки моделирования функциональных кист согласуется с усилением пролиферации фолликулоцитов.

Список использованных источников

И.В. Сорокина, В.Д. Марковский, И.В. Борзенкова, Е.А. Кулакова, М.С. Мирошниченко, О.Н. Плитень, С.А. Мирошниченко. Кистозные образования яичников у женщин: клинические и морфологические особенности. Морфология. 2015; 9 (2): 78-84.

Гасымова Д.М., Рухляда Н.Н. Клинико-анамнестические особенности пациенток с осложнениями доброкачественных опухолей и опухолевидных образований яичников. Российский вестник акушера-гинеколога. 2017; 17 (4): 72-77. https://doi.org/10.17116/rosakush201717472-77

Никогосян С.О., Кузнецов В.В., Загаштоков А.З. Экстренное и плановое лечение новообразований придатков матки. Акушерство и гинекология. 2017; 6: 10-16. https://dx.doi.org/10.18565/aig.2017.6.10-6

Боярский К.Ю., Гайдуков С.Н. Молекулярные основы фолликулогенеза: от стадии больших антральных фолликулов до овуляции. Проблемы репродукции. 2010; 5: 13-23.

Flor Sanches, Johan Smitz. Molecular control of oogenesis. Biochimica et Biophisica Acta. 2012; 1822: 1896-1912.

Erickson G., Shimasaki S. The physiology of folliculogenesis: the role of novel growth factors. Fertil Steril. 2001; 76: 943--949.

Зенкина В. Г., Солодкова О. А., Погукай О. Н., Каредина В. С. Современные представления об интраорганной регуляции фолликулогенеза в яичнике. Современные проблемы науки и образования. 2012; 2. https://science-education.ru/ru/article/view?id=5739

Qinglei L., McKenzie L. J., Matzuk M. M. Revisiting oocyte-somatic cell interactions: in search of novel intrafollicular predictors and regulators of oocyte developmental competence. Mol. Hum. Reprod. 2008; 14 (12): 673-678.

Su YQ, Sugiura K., Wigglesworth K., O'Brien MJ, Affourtit JP, Pangas SA, et all. Oocyte regulation of metabolic cooperativity between mouse cumulus cells and oocytes: BMP15 and GDF9 control cholesterol biosynthesis in cumulus cells. Development. 2008; 135; 111-21.

Erickson G., Shimasaki S., Moore R. K. The role of the oocyte in folliculogenesis. Trends Endocrinol Metab 2000; 11: 193-198.

Richard S, Baltz JM. Prophase I arrest of mouse oocytes mediated by natriuretic peptide precursor C requires GJA1 (connexin-43) and GJA4 (connexin-37) gap junctions in the antral follicle and cumulus-oocyte complex. Biol Reprod. 2014; 90(6): 137.

Козырева Е.В., Давидян Л.Ю. Роль факторов роста в патогенезе бесплодия и невынашивания беременности. Современные проблемы науки и образования. 2015; 4. https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=20811

Bilotas M., Meresman G., Buquet R., Sueldo C., Baraсao R.I. Effect of vascular endothelial growth factor and interleukin-1beta on apoptosis in endometrial cell cultures from patients with endometriosis and controls. J. Reprod. Immunol. 2010; 84 (2): 193-198.

Ярмолинская М.И., Денисова В.М. Значение генитального эндометриоза в патогенезе бесплодия. Журнал акушерства и женских болезней. 2013; LXII (6): 67-77. https://elibrary.ru/item.asp?id=21280646

Кузнецова И.В. Роль ангиогенеза в патогенезе эндометриоза // Акушерство и гинекология. 2011; 5: 16-22.

Размещено на Allbest.ru