Пролиферативная активность и апоптотическая реактивность клеток шейки матки при предраковых состояниях и неоплазии шейки матки

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Пролиферативная активность и апоптотическая реактивность клеток шейки матки при предраковых состояниях и неоплазии шейки матки

Рак шейки матки (РШМ) является одной из самых распространенных онкологических патологий во всем мире, в динамичном и стадийном патогенезе которого главную роль играет инфекция, индуцированная вирусом папилломы человека (ВПЧ). В настоящее время убедительно доказано, что ключевыми моментами канцерогенеза опухолей различных локализаций являются неограниченная пролиферация, ослабление апоптоза, дестабилизация фаз клеточного цикла [2].

Цель настоящего исследования дать оценку апоптотической реактивности, пролиферативной способности и кинетики клеточного цикла клеток шейки матки при предраковых состояниях и неоплазии.

Материалы и методы. В исследование были включены 58 женщин в возрасте от 26 до 48 лет, проходивших обследование и лечение в Забайкальском краевом онкологическом диспансере. Средний возраст пациенток составил 38±8,26 лет. В качестве образцов для исследования служили фрагменты ткани шейки матки, полученные путем прицельной ножевой биопсии или интраоперационно входе проведения оперативного пособия (радиоволновая эксцизия шейки матки, экстирпация матки). Одновременно проводился их морфологический контроль. В соответствии с данными гистологического исследования было выделено 2 сопоставимых клинических группы:

I - пациентки с неоплазией шейки матки (n=20 - гистологически плоскоклеточный рак Iа1 стадии),

II - больные с предраковыми заболеваниями шейки матки: цервикальная интраэпителиальная неоплазия (ЦИН) II-III степени (n=20),

Контрольную группу составили практически здоровые женщины (n=18), проходившие диспансерное обследование.

Все обследуемые лица были информированы о проводимой работе и дали свое письменное согласие на участие в ней. Исследование проведено с соблюдением принципов Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (The World Medical Association Declaration of Helsinki, 1964, 2013 ред.) [11].

Для реализации поставленных целей в каждой группе выделены 2 фрагмента исследования: А - участок злокачественной трансформации или предопухолевое поражение шейки матки; В - пограничная ткань без признаков злокачественного роста и воспаления.

Для получения клеточной суспензии кусочки биоптата измельчали и гомогенизировали в гомогенизаторе «Gentle MACS Dissociator» (Miltenyi Biotec GmbH, Германия) с пробирками С типа и с использованием набора реагентов Tumor Dissociation Kit (Miltenyi Biotec GmbH, Германия). Затем суспензию клеток фильтровали через капроновый фильтр размером ячеек 30 мкм. Полученные клетки отмывали в среде RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium-1640) с добавлением 10 % телячьей сыворотки и стандартного набора антибиотиков.

Регистрацию апоптоза, фаз клеточного цикла в выделенных клетках осуществляли с помощью проточной цитофлуометрии «FC500» (Beckman Coulter, Соединенные Штаты Америки) с использованием набора реагентов Annexin V Kit (Beckman Coulter, Соединенные Штаты Америки), окрашивание проводилось согласно прилагаемой инструкции. Измеряли процент позитивных клеток по аннексин-V-FIТС и йодистому пропидию, собирали не менее 10000 событий. Первоначально производилось типирование клеток шейки матки из общей популяции по отсутствию экспрессии на них лейкоцитарного антигена CD45. Из всей массы CD45 негативных клеток гейтировались Ki-67 позитивные.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью компьютерной программы «BIOSTAT». Полученные результаты представлены как медиана с указанием 25-го и 75-го перцентилей. Использовались методы непараметрической статистики с применением U-критерия Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при уровне достоверности р<0,05.

Типирование клеток шейки матки по CD45. CD45 - общий лейкоцитарный антиген, уровень локальной экспрессии которого отражает степень лейкоцитарной инфильтрации, величину местного иммунного ответа в опухолей ткани, коррелирует со степенью дифференцировки неоплазии, ее размерами, стадией злокачественного процесса, с показателями рецидирования и выживаемости, и, в конечном счете, является одним из прогностических предикторов опухолевого процесса [8, 9].

Наибольшее количество CD45 позитивных клеток типировано в паранеопластических 66,07% (58,45% 72,18%) и парадиспластических 66,52% (66,34%; 66,71%) биоптатах шейки матки, однако, достоверных различий между ними, контрольной величиной, уровнем CD45 (+) клеток в очаге цервикального рака и в локусе дисплазии не было выявлено (р>0,05).

Наименьший пул CD45(+) клеток зарегистрирован в очаге предрака 50,03% (34,73%; 65,33%), что на 18,5% и 28,4% меньше соответствующих показателей в образцах неоплазии (61,35% (52,92%; 72,12%)) и контроле (69,91% (58,81%; 71,11%)) (p<0001).

Для реализации поставленной цели был гейтирован пул клеток, неэкспрессирующих CD45 антиген.

В I группе независимо от локализации биоптатов: цервикальный рак или условно здоровый участок тканей количество типированных CD45 негативных клеток достоверно не отличалось и составило 38,64% (27,88%; 47,8%) и 33,93% (27,82%; 41,55%) соответственно. Эти данные были сопоставимы с контрольными образцами, где доля исследуемых клеток была на уровне 30,09% (28,89; 41,19), при этом достоверных отличий между ними не выявлено (p>0,05).

Наибольшее количество клеток, неэкспрессирующих лейкоцитарный CD45 маркер, верифицировано в локусе предрака - 49,97% (34,67%; 65,27%), что больше, чем в очаге злокачественной трансформации и в группе контроля на 11,3% и 15,4% соответственно (p < 0,001).

Выявленные изменения указывают на тенденцию к депрессии местного иммунного ответа в обеих исследуемых группах, что согласуется с данными источников литературы [6, 7, 10]. Однако, следует подчеркнуть, что достоверные различия по уровню экспрессии антигена CD45 в биоптатах шейки матки по сравнению с контрольными образцами нами выявлены только в локусе предрака.

Определение пролиферативной активности CD45 негативных клеток шейки матки по уровню экспрессии Ki-67. У больных, страдающих раком шейки матки, в CD45 негативных клетках всех фрагментов тканей наблюдается наиболее высокая экспрессия пролиферативного маркера Ki-67 по сравнению с контрольными образцами (p<0,001) (рис. 1).

Рис. 1. Уровень экспрессии Ki-67 в CD45 негативных клетках шейки матки при их злокачественной трансформации и дисплазии тяжелой степени: здесь и далее *достоверные отличия между соответствующей подгруппой и контролем.

Так 75,6% (65,73%; 88,32%) CD45 (-) клеток в очаге неоплазии и 86,9% (84,4%; 93,4%) CD45 (-) клеток на границе с опухолью экспрессируют Ki-67, что для каждой группы в отдельности почти в 10 раз (8 и 9 раз соответственно) больше, чем аналогичный показатель среди пула клеток в здоровой ткани (p<0,001).

У пациенток с предраковыми заболеваниями шейки матки (II группа) в очаге цервикального поражения и в участке здоровой ткани в CD45 (-) клетках также наблюдается положительная экспрессия антигена Ki-67, уровень которой в 4,7 и 2 раза соответственно больше, чем в группе контроля (p<0,001). При этом в локусе предопухолевого поражения экспрессия Ki-67 достоверно больше в 2,3 раза, чем в участках шейки матки без признаков атипии (p<0,001).

При сравнении уровня пролиферативной активности CD45 (-) клеток экзоцервикса в локусе рака и ЦИН III степени, выявлено, что в очаге злокачественной трансформации количество клеток, экспрессирующих Ki-67, на 30% больше (p < 0,001).

Эти данные сопоставимы с результатами Н.В. Даниловой и соавт. (2013 г.), А.А. Должикова (2013) и свидетельствуют о прогностическом значении Ki-67 для определения злокачественного потенциала предраковых изменений эпителия шейки матки [1, 4].

Оценка апоптотической реактивности клеток шейки матки, негативных по CD45 и экспрессирующих Ki-67. В локусе цервикального рака и в клетках условно здоровой зоны шейки матки выявлено наибольшее количество нежизнеспособных клеток - 68,78% (46,63%; 83,34%) и 91,55% (86,96%; 91,28%) соответственно, что в 1,5 и 2 раза больше, чем в группе контроля (р<0,001) (рис. 2).

Рис. 2. Соотношение живых и нежизнеспособных клеток шейки матки при предраковых состояниях и неоплазии.

Наиболее высокий уровень апоптотической активности в I группе зафиксирован в клетках паранеопластической зоны (табл. 1). В этом локусе количество клеток, находящихся в раннем апоптозе в 2,5 раза больше, чем в контрольной группе (р<0,001), на 4,7% и 3,3% больше, чем в очаге неоплазии и локусе ЦИН III степени соответственно (р<0,001). В стадии позднего апоптоза зафиксировано 50% (48,97%; 60,80%) клеток этой локализации, что также превышает уровень контроля и данный показатель в клетках цервикального рака на 35% и 15,7% соответственно (р<0,001).

В очаге рака шейки матки также преобладают клетки, находящиеся в стадии деструкции, из них 15,14% (13,07%; 21,28%) являются некротическими, что превосходит соответствующий пул клеток в контрольных образцах в 1,6 раза (р<0,001). Более 40% клеток являются апоптотическими: 11,22% (9,96%; 12,34%) - ранний апоптоз и 34,33% (25,85%; 50,84%) - поздний апоптоз, что достоверно больше, чем в группе контроля в 1,8 и 2,3 раза соответственно.

В шейке матки в локусе предопухолевых изменений увеличивается доля живых клеток (45%), однако достоверных различий с фокусом цервикального рака не выявлено (р>0.005). Для клеток этой локализации не обнаружено достоверных отличий по пулу апоптотирующих и некротических клеток по сравнению с соответствующими показателями клеток неоплазии шейки матки.

Таблица 1. Апоптотическая реактивность клеток шейки матки, негативных по CD45 и экспрессирующих Ki-67, при цервикальном раке и ЦИН III степени

Примечание: здесь и далее достоверность различий между патологическими подгруппами указана в тексте.

Полученные данные согласуются с данными литературных источников. З.Ф. Хараева и соавт. (2013), указывают на снижение интенсивности апоптоза в клетках цервикального эпителия при их злокачественной трансформации. Ученые обнаружили уменьшение количества лигандов апоптоза (sFasl и TRAIL) в сыворотки крови у больных с предопухолевыми состояниями и цервикальным раком [3]. И.И. Антонеева и соавт. (2012) сообщают о снижении экспрессии проапоптотического гена р53 и повышении экспрессии антиапоптотического гена Bcl-2 в клетках рака шейки матки [5].

Определение клеточного цикла. У больных с цервикальным раком в CD45 (-) клетках, экспрессирующих Ki-67, независимо от их локализации наблюдается нарушение кинетики клеточного цикла по всем фазам по сравнению с группой контроля (табл. 2).

В очаге злокачественной трансформации большинство CD45 негативных клеток (84%), экспрессирующих Ki-67, находятся в фазах G0-G1, что достоверно больше, чем в контрольных образцах тканей на 30% (p < 0,001). В локусе неоплазии доля клеток в синтетической фазе и фазе митоза минимальна: меньше соответствующих величин в контрольных участках и локусе предопухолевого поражения шейки матки (p < 0,001).

Таблица 2. Фазы клеточного цикла в клетках шейки матки при их злокачественной трансформации и предопухолевом поражении

Выявленные изменения согласуются с данными литературы о развитии неопластического процесса в шейке матки под действием ВПЧ-инфекции. Для поддержания трансформированного состояния клеткам необходима экспрессия онкогена - синтез рибонуклеиновой кислоты и определенных вирусспецифических белков, что осуществляется в G1 фазе клеточного цикла. Кроме того, установлено, что в очагах инвазивного плоскоклеточного рака шейки матки снижена или отсутствует экспрессия циклина D1, который и определяет G1-S переход клеток. Таким образом, клетки задерживаются в фазе G1 [1].

В I группе в клетках шейки матки, неэкспрессирующих лейкоцитарный антиген, Ki-67 положительных, по мере их отдаления от опухолевого поражения наблюдается положительный вектор в сторону увеличения клеток, находящихся в синтетической фазе и фазе митоза на 10% и 24% соответственно (p < 0,002). Эти изменения определяют возрастающий индекс пролиферации клеток (IP) от 14,51 в зоне неоплазии до 50,48 в клетках без признаков злокачественного роста и указывают на их высокую пролиферативную активность (рис. 3).

Рис. 3. Индекс IP в CD45 негативных клетках шейки матки, экспрессирующих Ki-67, при их злокачественной трансформации и дисплазии тяжелой степени: IP = количество клеток, находящихся в фазе S + количество клеток, находящихся в фазе G2.

В группе II с предопухолевыми поражениями шейки матки достоверные отличия выявлены для клеток, находящихся в фазе SubG0 и G1 (табл. 2), доля которых на 5% и 4,7% больше в условно здоровых биоптатах по сравнению с фокусом ЦИН II-III степени. Пул клеток в G2-М фазе больше в фокусе предопухолевого поражения на 10,6% (p < 0,001).

Рис. 4. Выраженность пролиферативной активности CD45 (-), Ki-67 (+) клеток шейки матки при их злокачественной трансформации и дисплазии тяжелой степени.

Для оценки выраженности пролиферативных изменений в клетках шейки матки нами было рассчитано соотношение клеток, находящихся в фазе пролиферации к клеткам, находящимся в стадии покоя как частное IP и SubG0 (рис. 4). Оно максимально для условно здорового участка в группе опухолевого поражения и минимально - в аналогичном локусе в группе предопухолевых изменений (p<0,001).

Таким образом, установленные закономерности изменений апоптотической реактивности, пролиферативной способности и кинетики клеточного цикла при дис- и неопластических изменениях цервикального эпителия играют важное значение в понимании некоторых аспектов канцерогенеза шейки матки, что в дальнейшем может быть использовано как критерии ранней диагностики опухолевого процесса этой локализации.

Выводы

Величина экспрессии пролиферативного маркера Ki-67 в клетках шейки матки имеет дифференциальное значение и отражает их злокачественный потенциал. В локусе опухолевого поражения и паранеопластических участках тканей наблюдается выраженная деструкция клеток по сравнению с очагом предракового поражения, его границей и контролем.

По мере отдаления клеток от опухолевого поражения наблюдается положительный вектор в сторону увеличения клеток, находящихся в синтетической фазе и фазе митоза, рост их пролиферативной активности, что можно объяснить особенностями ВПЧ- индуцированнного канцерогенеза.

Индекс пролиферации уменьшатся в ряду паранеопластический очаг > опухоль > предопухолевый очаг > условно здоровая зона, его окружающая > контроль.

Наиболее высокий уровень апоптотической активности зафиксирован в клетках паранеопластической зоны. В локусе цервикального рака наблюдается ослабление апоптоза на фоне высокой пролиферативной активности клеток.

Выявленные закономерности подлежат дальнейшему изучению и могут быть использованы в качестве маркера ранней злокачественной трансформации клеток шейки матки.

Список использованных источников

шейка матка апоптотический онкологический

1. Должиков А.А. Иммуноморфологическое исследование метаболических и пролиферативных маркеров при плоскоклеточном раке шейки матки // Вестник новых медицинских технологий. - 2013. - №1. - http://medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2013-1/4619.pdf

2. Копнин Б.П. Неопластическая клетка: основные свойства и пути ее возникновения // Практическая онкология. - 2002. - Т. 3, №4. - С. 229-235.

3. Лиганды апоптоза при папилломавирус-ассоциированных заболеваниях шейки матки / З.Ф. Хараева и др. // Медицинские науки. - 2013. - №3. - С. 396-399.

4. Маркеры апоптоза и белки-регуляторы клеточного цикла при фоновых и предраковых изменениях железистого эпителия шейки матки / Н.В. Данилова Н.В. и др. // Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. - 2013. - №1. - С. 12-16.

5. Экспрессия белков, ассоциированных с опухолевой прогрессией в злокачественных новообразованиях шейки матки / И.И. Антонеева и др. // Фундаментальные исследования. - 2012. - №7, ч. 2. - С. 269-272.

6. HPV infection: immunological aspects and their utility in future therapy / E. Deligeoroglou et al. // Infect Dis Obstet Gynecol. - 2013. - doi: 10.1155/2013/540850

7. Immunohistochemical analysis of CD4+ and CD8+ T-cell subsets in high risk human papillomavirus-associated pre-malignant and malignant lesions of the uterine cervix / S. Monnier-Benoit et al. // Gynecol Oncol. - 2006. - №102(1). - P. 22-31.

8. Potential value of in situ cellular immune response in HPV subtype 16 and 18 positive cervical cancer / E. Ancuюa et al. // Rom J Morphol Embryol. - 2014. - №55 (3). -Р. 817-822.

9. Predictive value of cellular immune response in cervical cancer / E. Ancuюa et al. // Rom J Morphol Embryol. - 2009. - №50 (4). -Р. 651-655.

10. Role of IL-10 and TGF-в1 in local immunosuppression in HPV-associated cervical neoplasia / K. Torres-Poveda et al. // World J Clin Oncol. - 2014. - №10;5(4). - Р. 753-763.

11. WMA Declaration of Helsinki - Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects.

Размещено на Allbest.ru