Маркеры апоптоза и пролиферации в диагностике неспецифического язвенного колита

Размещено на http://www.allbest.ru/

3

МАРКЕРЫ АПОПТОЗА И ПРОЛИФЕРАЦИИ В ДИАГНОСТИКЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ЯЗВЕННОГО КОЛИТА

Маркова А.А., Кашкина Е.И.

Саратовский государственный медицинский

университет им. В.И. Разумовского

Введение

В настоящее время во всем мире наблюдается значительный рост распространенности воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) [11,15,16,18,22]. Среди ВЗК неспецифический язвенный колит (НЯК) представляет особую актуальность, учитывая преимущественное поражение лиц молодого возраста, тяжелое течение и наличие опасных для жизни осложнений [3,7]. НЯК характеризуется хроническим рецидивирующим диффузным воспалением слизистой оболочки толстой кишки с развитием кишечных и внекишечных проявлений и осложнений [1,4,5,8]. В настоящее время для его диагностики используется комплексный подход с применением клинического обследования, рентгенологического, эндоскопического и гистологического методов исследования. Одним из современных способов оценки состояния слизистой оболочки толстой кишки является иммуногистохимическое исследование с определением маркеров пролиферации и апоптоза. Таким образом, с помощью моноклональных антител, специфичных фазе клеточного цикла, и последующей визуализацией их методами иммуногистохимии, можно оценить пролиферацию и процесс апоптоза в клетках [9]. Наиболее часто среди маркеров пролиферации используются такие антигены как PCNA и Ki-67. Известно, что PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) участвует не только в пролиферации клеток, но и в репарации ДНК после ее повреждения [13], что делает данный антиген условно специфичным к клеточному циклу, так как восстановление ДНК может осуществляться в фазе покоя [2,20]. Другим антигеном, достоверно ассоциированным с фазами клеточного цикла, является Ki-67. Экспрессия этого белка наступает во время фазы G1, нарастает в течение клеточного цикла и резко уменьшается в фазе митоза [14]. Этот белок, в отличие от PCNA, не участвует в репарации ДНК [19]. Таким образом, экспрессия Ki-67 дает возможность идентифицировать клетки, находящиеся во всех фазах клеточного цикла, кроме фазы покоя G0 [12,17]. Среди регуляторов апоптоза наиболее изучено семейство bcl и белок p53. Белок p53 нестабилен, локализуется в ядре клеток. При повреждении ДНК белок становится стабильным, и его концентрация в ядре резко повышается. Различают два типа p53 - «дикий» и мутантный. Первый образуется в норме, имеет очень короткий период полужизни и поэтому иммуногистохимически в тканях не определяется. Мутантный белок способен связываться с «диким», полностью его инактивируя, что может приводить к стимуляции опухолевого роста. Накопление р53 в ядре клетки инициирует апоптоз даже при отсутствии повреждения ДНК. [10,23]. Ген p53 управляет экспрессией генов семейства bcl2, расположенных на внутриклеточных мембранах [21], также регулирующих процесс апоптоза.

Цель исследования. Провести анализ экспрессии маркеров апоптоза (р53) и пролиферации (Ki-67) у больных НЯК в зависимости от длительности, степени тяжести заболевания, локализации и эндоскопической активности воспалительного процесса.

экспрессия маркер воспаление язвенный колит

Материалы и методы

Основную группу составили 80 пациентов с НЯК в возрасте от 18 до 66 лет (33 женщины и 47 мужчин), группу сравнения - 15 практически здоровых людей. Обследование пациентов проводилось с использованием клинических, лабораторных, эндоскопических, морфологических методов, а также с помощью иммуногистохимического исследования биоптатов слизистой оболочки толстой кишки. Пациенты с НЯК были разделены на группы в зависимости от степени тяжести клинических проявлений, длительности заболевания, локализации и активности воспалительного процесса. Индекс пролиферации Ki-67 (%) вычисляли путем подсчета количества иммунопозитивных ядер к общему количеству ядер. Подсчет производился не менее чем в 10 полях зрения. Об апоптозе судили по экспрессии белка p53 в поверхностном и железистом эпителии толстой кишки. При статистической обработке полученных данных, после проведения тестов на равенство дисперсий и нормальность распределения было доказано, что выборка не соответствует закону нормального распределения, поэтому для сравнения групп применялись непараметрические критерии. Для описания количественных признаков использовались медиана, верхний и нижний квартили. Результаты и обсуждение. У здоровых лиц ИП Ki-67 составил 54(46;67), что говорит о высокой пролиферативной активности клеток толстой кишки (табл.1).

Как следует из таблицы 1, повышение ИП Ki-67 в группе больных с длительностью НЯК от 1 года до 5 лет по сравнению с 1 группой (р?0,06), можно объяснить повышенной пролиферативной активностью клеток, отражающей репаративные процессы в слизистой оболочке толстой кишки на фоне проводимой терапии.

Таблица 1. Индекс пролиферации Ki-67 клеток эпителия слизистой оболочки толстой кишки (%) у здоровых людей и больных НЯК.

Примечание: р0 - достоверность различий с группой контроля, р1 - достоверность различий с длительностью заболевания менее 1 года, р2 - достоверность различий с легким течением заболевания, р3 - достоверность различий с дистальной локализацией заболевания, р4 - достоверность различий с I степенью эндоскопической активности.

При увеличении длительности заболевания способность клеток к пролиферации снижается, о чем свидетельствует низкий показатель ИП Ki-67 в третьей группе больных. В зависимости от тяжести клинических проявлений НЯК также было выявлено изменение ИП Ki-67 (табл. 1). ИП Ki-67 уменьшался у больных со среднетяжелой формой заболевания (р?0,0006) и тяжелой формой ( р?0,002) по сравнению с пациентами, имеющими легкое течение, также имелось различие между группой здоровых лиц и пациентами с НЯК любой степени тяжести (р?0,05). При анализе зависимости ИП Ki-67 от локализации воспалительного процесса было выявлено значительное снижение экспрессии маркера в группе больных НЯК с тотальным поражением толстого кишечника 30(28;31), тогда как при дистальном колите ИП составил 45(37;46) (р? 0,0009). Из таблицы 1 также видно, что при увеличении активности заболевания ИП Ki-67 снижается. Имеются достоверные различия между пациентами с I и II (р ? 0,002), I и III (р ? 0,02) степенями активности. Экспрессия р 53 не наблюдалась ни в одном случае в эпителии слизистой оболочки толстой кишки у практически здоровых людей. Результаты экспрессии данного белка у 48 больных НЯК представлены в таблице 2.

Таблица 2. Экспрессия белка р53 у больных НЯК.

При исследовании показателя p53 в зависимости от длительности НЯК, закономерности экспрессии этого белка не выявлено, однако имеется различие в экспрессии этого маркера между группой здоровых лиц и группой пациентов с длительностью заболевания до 1 года (р?0,05) и более 5 лет (р?0,03). Экспрессия маркера p53 была взаимосвязана с тяжестью течения НЯК (12,5% при легком течении; 35,7 % при средней степени тяжести и 50% при тяжелом). Статистически значимые различия получены между группами здоровых лиц и пациентов со средней и тяжелой формами заболевания (р?0,03). У больных с дистальным колитом положительный результат был получен только в 20,2% случаев, с левосторонним у 18,1% больных. При тотальном поражении кишечника экспрессия р53 обнаруживалась в 100% случаев (р?0,03 по сравнению с дистальным колитом). Следует отметить, что экспрессия была наиболее интенсивна в участках с признаками метаплазии эпителия. Так же была выявлена зависимость от эндоскопической активности заболевания: при ее увеличении экспрессия р53 возрастала (р?0,05).

Выводы:

1. При неспецифическом язвенном колите в фазе обострения пролиферативная активность клеток эпителия слизистой оболочки толстой кишки значительно снижена, о чем свидетельствует снижение ИП Ki-67 по сравнению с практически здоровыми людьми.

2. Отмечается увеличение экспрессии белка р53 в слизистой оболочке толстой кишки у больных НЯК по сравнению со слизистой оболочкой без воспалительных изменений.

3. При длительности неспецифического язвенного колита менее 1 года наблюдается наиболее низкий ИП Ki-67.

4. Увеличение клинической и эндоскопической активности неспецифического язвенного колита, а также протяженности патологического процесса в толстой кишке сопровождается снижением пролиферативной активности клеток эпителия толстой кишки и увеличением показателей активации апоптоза.

Список использованных источников:

1. Адлер Г. Болезнь Крона и язвенный колит / Пер. с нем. А.А. Шептулин. М.: ГЭОТАР МЕД, 2001. - 500 с.

2. Аруин Л.И. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника / Л.И Аруин, Л.Л. Капуллер, В.А. Исаков. - М.: «Триада-Х», 1998. - 496 с.

3. Белоусова Е.А. Язвенный колит и болезнь Крона / Е.А. Белоусова. - Тверь: «Триада», 2002. - 128 с.

4. Гастроэнтерология и гепатология: диагностика и лечение: руководство для врачей / Под ред. А.В. Калинина, А.Ф. Логинова, А.И. Хазанова. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: МЕДпресс-информ, 2011. - 864 с.: ил.

5. Гастроэнтерология: Клинические рекомендации / Под ред. В.Т. Ивашкина. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 208 с.

6. Ивашкин В.Т. Процессы апоптоза и пролиферации при патологии желудочно-кишечного тракта и печени / В.Т. Ивашкин, Т.Л. Лапина, О.Ю. Бондаренко и др. // РЖГГК. - 2002. - № 6. - С. 38-43.

7. Казарина А.В. Роль пробиотической терапии в лечении рецидива и поддержании ремиссии язвенного колита / А.В. Казарина, Р.С. Назарбекова, Н.И. Овчинникова и др. // Кремлевская медицина. - 2009. - №2. - С. 50-54.

8. Неспецифический язвенный колит / Ф.И. Комаров, А.М. Осадчук, М.А. Осадчук, И.М. Кветной. - М.: ООО Медицинское информационное агентство, 2008. - 256 с.: илл.; таб.

9. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей. Издание 3-е, дополненное и переработанное / под редакцией С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. РИЦ «Титул», Казань, 2004. - 456 с.

10. Bennett M. Cell surface trafficking of Fas: A rapid mechanism of p53-mediated apoptosis / M. Bennett, K. McDonald, S.W. Chan et al. // Science. - 1998. -Vol. 282. - P. 290-293.

11. Binder V. Epidemiology and environmental factors. In: Andus T., Goebell H., Layer P., Scholmerich J., eds. Inflammatory bowel disease: from bench to bedside. Boston: Kluwer Academic Publishers. - 1997. - P. 39-43.

12. Bromley M. A comparison of proliferation markers (BrdUrd, Ki-67, PCNA) determined at each cell position in the crypts of normal human colonic mucosa / M. Bromley, D. Rew, A. Becciolini et al. // Eur. J. Histochem. - 1996. - Vol. 40. - P. 89-100.

13. Brown D. Monoclonal antibody Ki-67: its use in histopathology / D. Brown, K. Gatter // Histopathology. - 1990. - № 17. - Р. 489-501.

14. Bruno S. Cell cycle dependent expression and stability of the nuclear protein detected by Ki-67 antibody in HL-60 cells. / S. Bruno, Z. Darynkiewich // Cell.Prolif. - 1992. - Vol. 25. - P. 31-40.

15. Ekbom A. Epidemiologic aspects of inflammatory bowel disease. In: Innovative concepts in inflammatory bowel disease: Congress short report Falk symposium. Rostock, 1998. - P. 8-9.

16. Fiocchi C. The multifactorial pathogenesis of IBD. In: Inflammatory bowel disease - diagnostic and therapeutic strategies: Falk Symposium 154: Abstracts. M.; 2006. - P. 21-22.

17. Holt P.R. Is Ki-67 a better proliferative marker in the colon then proliferating cell nuclear antigen? / P.R. Holt, S.F. Moss, A.M. Kapetanakis // Cancer. epidimiol. Biomarkers. Prev. - 1997. - № 6. - P. 131-135.

18. Johanson S.F. Geographic distribution of constipation in the United States // Gastroenterol. - 1997. - Vol.112. - №4. - P.20.

19. Kuwano K. Apoptosis signaling pathways in lung diseases / K. Kuwano, M.Yoshimi, T. Maeyama et. al. // Med. Chem. - 2005. - Vol. 1 - № 1. - P. 49-56.

20. McCormick D. The complexities of proliferating cell nuclear antigen / D. McCormick, P.A. Hall // Histopathology. - 1992. - Vol. 21. - P. 591-594.

21. Reed J. C. Bcl-2 and regulation of programmed cell death // J. Cell. Biol. - 1994. - Vol. 124. - P. 1-6.

22. Russel M. Hugh incidence of inflammatory bowel disease / M. Russel, E. Dorant, A.Volovics et al. // Diseases Colon Rectum. - 1998. - Vol. 41. - №3. - P. 33-40.

23. Sabbatini P. Essential role for p53 mediated transcription in E1A-induced apoptosis / P. Sabbatini, J. Lin, A.J. Levine et al. // Genes Dev. - 1995. -Vol. 9. - P. 2184-2194.

Размещено на Allbest.ru