Сравнительный анализ кристаллогенных свойств некоторых микроорганизмов

Размещено на http://www.allbest.ru/

7

Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр, г. Нижний Новгород

Кировская государственная медицинская академия, г. Киров

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КРИСТАЛЛОГЕННЫХ СВОЙСТВ НЕКОТОРЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Мартусевич А.К.,

Шубина О.И.

Введение

В литературе широко обсуждается метаболическая активность различных микроорганизмов. При этом различные свойства бактерий изучаются и применяются в прикладных отраслях, преимущественно инженерного профиля [1-4]. В этих работах приводятся многочисленные факты связи процессов кристаллообразования с деятельностью микробов. Наиболее изучены в этом направлении представители рода Pseudumonas, которые способны инициировать кристаллогенез различных органических и минеральных соединений из растворов [5, 6]. Выявлены аналогичные свойства и у других микроорганизмов (Listeria innocua [7], Escherichia coli [6, 8], Helicobacter pylori [8], Desulfovibrio desulfuricans [4], Agrobacterium tumefaciens [8] и др.). Так, установлено несколько специфических белков, синтезируемых бактериями исключительно в целях протективной кристаллизации. К ним, в частности, относятся RecA и Dps протеины, обеспечивающие адаптацию микробов к неблагоприятным условиям внешней среды, например, ионизирующим излучениям [1, 5-9]. Кроме того, значительный практический интерес представляет способность микроорганизмов кумулировать многие металлы, в том числе и благородные (золото, серебро, платина) в форме микрокристаллов в перимембранном пространстве или внутриклеточно [4, 5]. В целом, к настоящему времени сформировался определенный массив сведений о влиянии микроорганизмов на кристаллообразование [5, 9, 10]. Однако эти данные практически не систематизированы и не объединены в единую теорию. В связи с этим, целью исследования явилось уточнение характера инициаторной активности патогенных и непатогенных микроорганизмов в отношении растворов солей.

Материал и методы исследования

В качестве микроагентов нами были выбраны колонии двух микроорганизмов: бактерии Escherichia сoli (E. сoli) и Staphylococcus aureus (St. aureus) (штаммы получены в Кировском научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови под руководством зав. лабораторией консервации крови и тканей д.м.н. А.А. Костяева). Подобный выбор биообъектов неслучаен: E. сoli является типичным представителем аутохтонной микрофлоры организма человека и животных, тогда как St. aureus представляет собой классический патогенный бактериальный агент. В целях уточнения роли концентрации бактерии были использованы единые для обоих микроорганизмов тестовые количества биомикрообъектов: 10⁶, 10⁸, 10¹⁰, 10¹², 10¹⁴, 10¹⁶, 10¹⁸ и 10²⁰ КОЕ/мл раствора. В качестве инициируемого (базисного) вещества применялся 10% раствор хлорида натрия, что позволило выполнить тезиграфический тест в варианте сравнительной тезиграфии [10, 11]. Это дало возможность количественно оценить «инициаторный потенциал» бактерии - способность оказывать влияние на картину кристаллизации раствора соли.

Статистическая обработка результатов производилась алгоритмами вариационной статистики с применением пакета SPSS 11.0.

Результаты и обсуждение

Исследования особенностей инициаторного процесса 10% раствора хлорида натрия рассматриваемыми бактериями в зависимости от концентрации анализируемой культуры позволили установить, что имеет место закономерная динамика нарастания выраженности сдвигов кристаллообразования гипертонического раствора при увеличении содержания модулирующего его микроагента. Важно, что данная тенденция касается обоих микроорганизмов. При более подробном изучении распределения тезиграмм по градации возрастающей инициирующей дозы микроагента с учетом всех контролируемых концентраций был обнаружен двухступенчатый характер реагирования хлорида натрия на метаболическую активность микроорганизма.

Он включает первоначальное отсутствие значимых вариаций по сравнению с контрольным образцом базисного вещества. При нарастании количества микробных тел для каждого микроорганизма отчетливо регистрируется концентрация, начиная с которой появляется динамика трансформации кристаллогенеза в краевой зоне. Она выражается в формировании островков одиночных кристаллов, окружающих относительно крупные пирамидальные структуры, образованные хлоридом натрия.

Принципиально подчеркнуть, что концентрация, с которой начинают обнаруживаться подобные изменения, у эшерихии и стафилококка варьирует, причем она значительно меньше у патогенного микроагента. Так, для E. coli данная пороговая концентрация составляет 10¹² КОЕ/мл, то относительно St. aureus даже при минимальном (из изученных) количестве бактерий (10⁶ КОЕ/мл) регистрируются значимые преобразования структуропостроения краевой зоны.

Третьим из выделенных нами вариантов инициации кристаллообразования хлорида натрия бактериями, ассоциированных с количеством микроагентов, является нарастающий неокристаллогенез (отсутствует в контрольном образце 10% раствора хлорида натрия) в центральной и промежуточной зонах высушенного препарата. На основании этого представляется возможным выделить вторую пороговую концентрацию, причем ее значение, как и для первой, видоспецифично (10¹⁴ КОЕ/мл - для E. coli и 10¹⁰ КОЕ/мл - для S. aureus).

Рис. 1. Динамика основного тезиграфического коэффициента (Q) образцов высушенных растворов, содержащих возрастающие концентрации микроорганизмов.

В соответствии с выбранной методикой описания высушенных микропрепаратов нами производилась не только качественная, но и количественная их оценка путем применения системы критериев. В качестве наиболее информативных и несущих максимальный объем биологически значимых сведений параметров рассчитаны основной тезиграфический коэффициент (Q) и степень деструкции фации (СДФ). Первый из показателей позволяет охарактеризовать направленность (по градации «активация - ингибирование») и выраженность «инициаторного потенциала» микроорганизмов. Коэффициент Q является основной количественной мерой последнего. Степень деструкции фации указывает на выраженность разрушения либо дефекты формирования кристаллов и других видимых при оптической микроскопии элементов образца.

Проведенный с подобных позиций анализ показал, что качественные преобразования, связанные с метаболической активностью бактерий, находят полное подтверждение при оценке количественных критериев тезиграфического теста (рис. 1 и 2).

Рис. 2. Динамика степени деструкции (СДФ) образцов высушенных растворов, содержащих возрастающие концентрации микроорганизмов.

В частности, монотонное нарастание уровня основного тезиграфического коэффициента является следствием сначала краевого, а затем и тотального (распространяющегося на все зоны микропрепарата) неокристаллогенеза, отражающего «инициаторный потенциал» микроорганизма (рис. 1). В то же время увеличение количества кристаллических образований не сопровождается повышением структурированности фации в целом, о чем свидетельствует прогрессивный рост показателя СДФ, визуализирующего качественные преобразования тезиграфической картины (рис. 2). При этом важно отметить, что выбранные микроорганизмы в отношении количественных оценочных критериев существенно различимы. Так, по основному тезиграфическому коэффициенту, а, следовательно, и по инициаторной способности (при использовании в качестве базисного вещества 10% раствора хлорида натрия) St.aureus достоверно превосходит E. coli при всех исследованных концентрациях микроагентов (p<0,05), и если на небольших значениях «инициаторный потенциал» эшерихии незначителен, то у стафилококков он исходно высок (усиление кристаллообразования хлорида натрия в 3,5 раза). При высоких концентрациях четкая дифференциация между бактериями несколько сглаживается за счет выраженного повышения инициаторного потенциала E. coli.

Аналогичные тенденции были обнаружены при оценке «правильности» модулируемого микроорганизмами кристаллогенеза раствора хлорида натрия (по степени деструкции фации), однако на низких концентрациях бактериальных агентов достоверных различий по рассматриваемому параметру не выявлено (p<0,05). Кроме того, представляется интересным, на наш взгляд, подчеркнуть, что патогенная бактерия (в нашем случае - золотистый стафилококк) на средних и высоких концентрациях обладает достоверно более четким деструктурирующим действием на кристаллизацию растворов хлорида натрия, чем микроорганизм-представитель аутохтонной микрофлоры многих биотопов человека и животных (кишечная палочка). Эти изменения не связаны с нарастанием «инициаторного потенциала» изучаемых агентов микромира, что верифицировано с помощью корреляционного анализа (r=-0,103±0,062), т. к. сопоставимые темпы прироста инициирующей способности бактерий с увеличением их концентрации не подтверждаются превалирующим ростом деструктивности микропрепарата, связанной с повышением количества стафилококка, аналогичной динамикой у эшерихии.

хлорид натрия метаболизм микроорганизм

Вывод

На основании прямых модельных экспериментов с колониями отдельных патогенных и непатогенных микроорганизмов подтверждено новое явление - микробная инициация кристаллообразования (феномен микроорганизм-ассоциированного кристаллогенеза - МАК [10, 12]). Принципиально важен тот факт, что данное явление универсально для агентов микромира, однако он носит и специфичные черты, накладываемые видовой принадлежностью микроорганизма и его текущим функциональным состоянием [13]. Кроме того, на основании собственных результатов, данных отечественной и зарубежной литературы можно заключить, что лимитирующим моментом при реализации МАК является строго определенная функциональная значимость кристаллизации в каждом конкретном случае [1, 2, 5-9]. С наших позиций, она и выступает в качестве ключевого звена при выборе вида расположения кристаллических структур, связанных с деятельностью микроорганизмов.

Список использованных источников:

1.Гусев М.В., Лебедева А.Ф., Саванина Я.В. с соавт. Устойчивость культур цианобактерии Anacystis nidulans и микроводоросли Dunaliella maritima к токсическому действию ванадия: влияние фосфата, железа и цистеина // Вестн. МГУ. Сер. 16. 1997. №2. С. 17-21.

2.Дятлова К.Д. Микробные препараты в растениеводстве // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т.7. №5. С. 17-22.

3.Сорокин Д.Ю. Совмещенные микробиохимические процессы трансформации неорганических веществ: роль в природных системах и возможности использования в биотехнологии // Микробиология. 1997. Т. 66. №3. С. 293-301.

4.Yong P., Rowson Neil A., Farr G.P.J. et al. Bioreduction and biocrystallization of palladium by Desulfovibrio desulfuricans NCIMB 8307 // Biotechnology and Bioengineering. 2002. Vol. 80. №4. P. 369-379.

5.Minsky A., Shimoni E., Frenkiel-Krispin D. Biocrystallization: stress, order and survival // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002. №3. P. 50-60.

6.Namsaraev E., Baitin D., Bakhlanova I. et al. Biochemical basis of hyper-recombination activity of Pseudomonas aeruginosa RecA protein in Escherichia coli cells // Mol. Microbiol. 1998. Vol. 27. №4. P. 727-738.

7.Bozzi M., Mignogna G., Stefanini S. et al. A novel non-heme iron-binding ferritin related to the DNA-binding proteins of the Dps family in Listeria innocua // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 3259-3265.

8.Ceci P., Mangiarotti L., Rivetti C. et al. The neutrophil-activating Dps protein of Helicobacter pylori, HP-NAP, adopts a mechanism different from Escherichia coli Dps to bind and condense DNA // Molecular Biology. 2007. №3. P. 76-84.

9.Wolf S.G., Frenkiel D., Arad T. et al. DNA protection by stress-induced biocrystallization // Nature. 1999. Vol. 400. P. 83-85.

10.Мартусевич А.К., Зимин Ю.В. Роль физико-химических процессов в системе «микроорганизм - человек» // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. 2008. №3. С. 112-115.

11.Мартусевич А.К., Камакин Н.Ф. Унифицированный алгоритм исследования свободного и инициированного кристаллогенеза биологических жидкостей // Клиническая лабораторная диагностика. 2007. №6. С. 21-24.

12.Мартусевич А.К., Ашихмин С.П., Симонова Ж.Г., Жданова О.Б. Изучение феномена микроорганизм-паразит-ассоциированного кристаллогенеза в модельных условиях // Здоровье населения и среда обитания. 2013. №1. С. 42-44.

13.Юшкин Н.П., Гаврилюк М.В., Голубев Е.А. Сингенез, взаимодействие и коэволюция живого и минерального миров: абиогенные и углеводородные кристаллы как модели протобиологических систем. Концепция кристаллизации жизни // Информационный бюллетень РФФИ. 1996. №4. С. 393.

Размещено на Allbest.ru