Определение этиологических факторов, детерминирующих клинический полиморфизм врождённых расщелин губы и/или нёба у детей Краснодарского края

Размещено на http://www.allbest.ru//

Определение этиологических факторов, детерминирующих клинический полиморфизм врождённых расщелин губы и/или нёба у детей Краснодарского края

Нехорошкина М.О.

В нозологическом спектре врождённых пороков развития (ВПР) человека врождённые расщелины губы и/или нёба (ВРГ и/или Н) являются наиболее частыми. При этом выявлены существенные различия частоты этой патологии в отдельных популяциях [3,6]. По данным Всемирной организации здравоохранения частота рождаемости детей с ВРГ и/или Н составляет около 1:1000 [5].

Около 20% пороков развития обусловлены генными мутациями, 10% хромосомными, а 70% - мультифакториальное происхождение [4]. Изолированные ВРГ и/или Н имеют преимущественно многофакторный характер, где генетические факторы являются предрасполагающими к их формированию [11]. Установлено, что формирование этой патологии происходит в раннем эмбриогенезе при наличии в родительских половых клетках мутантных генов либо геномной или хромосомной мутации (генетический фактор), а также в результате воздействия внешнесредовых факторов тератогенеза, что нарушает гистоорганогенез челюстно-лицевого аппарата эмбриона. Следовательно, врожденную расщелину верхней губы и нёба можно рассматривать, как индикатор присутствия и воздействия мутагенных и/или тератогенных факторов в среде обитания человека [1].

Независимо от этиологического фактора ВРГ и/или Н проявляется с первых часов жизни новорожденного не только морфологическими, но и функциональными нарушениями актов приёма пищи и дыхания, а в последующем часто задержкой психосоматического развития. Практически всем больным с этой патологией проводится хирургическая (косметическая) коррекция, а также послеоперационная реабилитация в специализированных ЛПУ. Однако, вопрос о возможности повторного рождения больного ребёнка в семье, отягощенной этой патологией, остаётся до выяснения этиологического фактора, обусловившего порок в каждом конкретном случае.

Однако, актуальным для решения вопроса о возможности повторного рождения больного ребёнка в семье, отягощенной этой патологией, является поиск этиологического фактора, обусловившего порок в каждом конкретном случае.

Цель исследования: оценить роль генетических факторов, детерминирующих клинический полиморфизм ВРГ и /или Н у детей, родившихся в Краснодарском крае (Юг России) за последние 17 лет.

Материал и методы исследования. Объектом исследования являлись 1024 больных детей с ВРГ и/или Н, родившихся в Краснодарском крае за период 1996-2012 г.

Проанализированы регистрационные карты и истории болезни всех больных с ВРГ и/или Н, из которых получена первичная генеалогическая информация и другие сведения о больных. При выявлении данных об аналогичной патологии у родителей или родственников больного, а так же наличии у больных с ВРГ и/или Н другой врождённой патологии они осматривались нами лично. При этом определялся клинический вариант патологии, собирался углубленный генеалогический анамнез, уточнялся клинический диагноз и намечался план необходимого обследования больных. Таким образом нами осмотрено и дополнительно обследовано 810 больных.

Цитогенетическое исследование (кариотипирование) проведено у 247 больных. В группу обследованных вошли больные, имеющие родственников с аналогичными признаками у членов семьи, а так же пробанды с множественными ВПР. Использована стандартная методика 72-х часовой культуры лимфоцитов периферической крови (около 1 мл) в среде RPMI. Дифференцированное окрашивание хромосом проводили методом С и G. Просмотр метафаз выполнен под микроскопом AXIO Scope a1 при увеличении х1000. Анализировали 30- 50 метафаз от каждого больного.

Молекулярно - генетическое исследование проведено у 102 больных, у которых присутствовали только ВРГ и/или Н (изолированный порок развития). В качестве группы контроля были взяты родители исследуемых больных - 153 человека (родительский контроль).

Выделение ДНК производили из крови больных (5 мл.) стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции [9]. Анализ полиморфизма гена ABCB1 выполняли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с соответствующей верификацией в режиме реального времени в амплификаторе CFX96, Bio-rad, с использованием ДНК-полимеразы (производства фирмы «Сибэнзим») и локусспецифических олигонуклеотидных праймеров и зондов («Синтол», Россия):

F: 5'- ctgtttgactgcagcattgct -3'

R: 5'- atgtatgttggcctcctttgct -3'

5'-FAM-ccctcac(a)atctctt-RTQ1-3'

5'-ROX-ccctcac(g)atctctt-BHQ2-3'

При проведении ПЦР выполнялось 40 циклов. Каждый цикл амплификации включал 3 этапа, протекающие при различных температурных режимах: 1) денатурация - нагревание двухцепочечной ДНК-матрицы до 95°C, время стадии 1,5 мин.; 2) отжиг - температура подбиралась равной температуре плавления праймеров, что составило 51,3єС, время стадии отжига -- 1 мин.; 3) элонгация при температуре 950 С в течение 15 сек. Анализ полученных результатов оценивали по графическому распределению соответствующих аллелей.

Для оценки соответствия распределений наблюдаемых генотипов и ожидаемым их значениям при равновесии уравнения Харди-Вайнберга и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в группах больных и здоровых использовали критерий ч2 Пирсона [2]. Для сравнения частот аллелей и генотипов между различными группами использовали критерий ч2 с поправкой Йетса на непрерывность [8,10] . Различия рассматривали как достоверные при уровнях значимости р<0,05. Об ассоциации генотипов с предрасположенностью к заболеванию судили по величине отношения шансов (odds ratio, OR) с 95% доверительным интервалом (CI). Статистическая обработка данных проводилась с использованием программных пакетов Statisticа 6.0 («StatSoft», США).

Результаты и их обсуждение. При клиническом осмотре 810 больных нами установлено, что у 465 (57,4%) детей расщелина губы и/или нёба являлись изолированным ВПР, а у 345 (42,6%) кроме ВРГ и/или Н присутствовали и другие врождённые патологические признаки, что соответствует множественным ВПР.

Клинико-генеалогический анализ, проведенный в семьях больных, позволил установить аналогичную патологию у 41(5,06%) родственников пробандов, в том числе: у 4-х больных - аналогичная патология была выявлена у одного из родителей, у 22 - врожденные пороки были диагностированы у сибсов пробанда, а у 11 - среди родственников II и III степени родства. У остальных 769 больных данный ВПР оценен как спорадический вариант патологии.

Таким образом, по результатам клинического обследования у 98 (12,1%) больных с МВПР были диагностированы наследственные синдромы. Нозологический спектр моногенных наследственных синдромов представлен в табл. 1.

Таблица 1. Нозологический спектр моногенных наследственных синдромов с признаком врождённой расщелины губы и нёба на территории Краснодарского края

Примечание: АД - аутосомно-доминантный; АР - аутосомно-рецессивный

Таблица 2. Структура и частота хромосомной патологии у больных с ВРГ и/или Н в Краснодарском крае

Цитогенетический анализ проведён у 247 больных, из которых у 50 (20,24 %) диагностирована хромосомная патология, обусловленная анеуплоидиями и аберрациями хромосом.

генетический полиморфизм расщелина губа

Из представленных в табл. 2 данных видно, что наибольший удельный вес в структуре хромосомной патологии приходится на синдромы Эдвардса (1,8%), Патау (1,3%), Лежена (1,0%).

Молекулярно-генетический анализ включал генотипирование полиморфного варианта 3435 C/T (26 экзон) гена ABCB1. Генотипирование проведено у 102 больных детей русской этнической группы у которых ВРГ и/или Н диагностирован как изолированный порок развития (56,1% -мужского и 43,9% - женского пола). Результаты молекулярно-генетического анализа представлены в табл. 3.

Tаблица 3. Распределение аллелей и генотипов полиморфизма 3435 C/T (26 экзон) гена ABCB1 у пациентов с врождённой расщелиной губы и/или нёба и здоровых лиц (контроль)

Примечания: 1абсолютное число и процент лиц с исследуемым генотипом; 2Хи-квадрат и p-значения (df=1); 3отношение шансов с 95% доверительными интервалами; *вариантные аллели (мутации) представлены в нижних ячейках соответствующих ДНК-маркеров

Распределение частот генотипов изучаемого полиморфного варианта гена АВСВ1 проводилось раздельно в контрольной группе и в группе больных и соответствовало нормальному распределению уравнения Харди-Вайнберга в обоих группах.

Сравнительный анализ частот аллелей в обобщённой группе больных с ВРН и ВРГН не выявил статистически достоверных различий. Мы также не обнаружили ассоциаций аллелей и генотипов исследуемого ДНК-маркера с риском развития ВРН. Однако, в группе больных с ВРГ отмечалась тенденция к накоплению мутантного аллеля Т в группе больных по сравнению с контрольной группой (р=0,06, OR=1,94, 95% Cl=0,98- 3,87). Частота гомозигот по дикому аллелю в группе больных ВРГ составила 10,5% и встречалась в три раза реже по сравнению с контролем (30,7%); при этом различия приближались к уровню статистически значимых (р=0,07, OR=3,77, 95% Cl=0,84-1,97).

При сопоставлении частот генотипов в группе больных с ВРГ и/или Н и в группе здоровых статистических достоверных различий нами обнаружено не было, как в обобщенной группе больных с ВРГ и/или Н, так и при анализе отдельных нозологических форм.

Выводы

В результате проведенного нами анализа можно сделать вывод о том, что в структуре ВРГ и /или Н у детей, родившихся в Краснодарском крае, преобладают пороки развития мультифакториального генеза (около 68%), что соответствует данным, описанным в литературе [4]. Однако, следует отметить достаточно высокую частоту хромосомной патологии (20,24%), обнаруженной среди больных с исследуемыми ВПР, в структуре которых преобладали по частоте синдром Эдвардса и Патау. Структура моногенной патологии, обнаруженной у пациентов с ВРГ и/или Н, характеризовалась широким спектром нозологических форм (синдромов), широко описанных в мировой биомедицинской литературе.

Проведенный нами анализ ассоциации полиморфизма 3435 C/T (26 экзон) гена ABCB1 с риском развития ВРГ и/или Н показал, что в краснодарской популяции исследуемый ген не связан с риском развития ВРН, но он может быть ассоциирован с повышенным риском развития ВРГ. Полученные нами различия приближались к достоверным, но не достигали уровня статистической значимости, что, вероятнее всего, связано с малой численностью выборки больных с ВРГ. Однако мы наблюдали существенное снижение частоты носителей нормального аллеля в группе больных ВРГ. Данный ген входит в суперсемейство генов цитохромов Р450 (CYP450), которые участвуют в метаболизме ксенобиотиков, в том числе соединений, которые могут оказывать токсическое воздействие на плод [7, 13, 14, 16]. Доказано, что он экспрессируется в органах и тканях, выполняющих экскреторную или барьерную функцию, в том числе в плаценте [12, 17]. Данные, полученные другими исследователями, также обнаруживают ассоциацию исследуемого гена с повышенным риском развития ВРГ [15] Возможно, носительство вариантного аллеля данного гена может влиять на механизмы детоксикации экзогенных соединений и приводить к накоплению токсичных промежуточных метаболитов, обладающих тератогенными свойствами.

Полученные результаты позволяют определить вклад различных генетических факторов в формирование риска развития ВРГ и/или Н у детей Краснодарского края, а также оценить актуальность исследований, направленных на поиск генетических механизмов, посредством которых реализуются тератогенные эффекты ксенобиотиков.

Список использованных источников

1. Боконбаева С.Дж., Алдашева Н.М., Лобзова А.В., Джанабилова Г.А. Врождённые пороки развития как индикатор качества состояния окружающей среды// Вестник КРСУ. 2008. Т. 8. № 4. С. 165-170.

2. Вейр Б., Анализ генетических данных. Дискретные генетические признаки. - М.: Мир, 1995.

3. Верзилина И.Н., Агарков Н.М., Чурносов М.И. Распространенность и структура врожденных аномалий развития у новорожденных детей г.Белгорода// Педиатрия. 2009 - №2. - С 151-154

4. Гуцан А.Э. Врожденные расщелины в/губы и неба. - Кишинев: Штиинца, 1980. - С. 9-12; 41-45.

5. Демикова Н.С. Мониторинг врожденных пороков развития и его значение в изучении их эпидемиологии// Рос. вестн. перинатологии и педиатрии. - 2003.- №4. - С. 13-17.

6. Крикунова, Н.И., Назаренко Л.П. Медико-генетический мониторинг ВПР у детей в Томской области// Рос. вестн. перинатологии и педиатрии. 1998; 43 (2): 56-58

7. Куценко С.А. Основы токсикологии. - СПб., 2002. - 395 с.

8. Лванга С.К., Чжо-Ек Тыэ. Обучение медицинской статистике: Двадцать конспектов лекций и семинаров. ВОЗ. - М.: Медицина, 1989. - 216 с.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д., Баев А. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. -М.: Мир, 1984. - 479 с.

10. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. - М.: МедиаСфера, 2002. - 312 с.

11. Фоменко И.В., Дмитриенко С.В., Касаткина А.Л. Эпидемиологическая характеристика врожденных расщелин лица на территории Волгограда и Волгоградской области// Стоматология детского возраста и профилактика.- 2009. № 1. С. 20-24.

12. Hitzl M., Schaeffeler E., Hocher B., Slowinski T., Halle H., Eichelbaum M., Kaufmann P., Fritz P., Fromm M., Schwab M. Variable expression of P-glycoprotein in the human placenta and its association with mutations of the multidrug resistance 1 gene (MDR1, ABCB1)// Pharmacogenetics: May 2004. - Vol. 14. - Iss. 5. - p. 309-318.

13. Iqbal M., Audette M.C., Petropoulos S., Gibb W., Matthews S.G. Placental drug transporters and their role in fetal protection// Placenta 2012, 33: 137-142.

14. Myllynen P., Immonen E., Kummu M., Vahakangas K. Developmental expression of drug metabolizing enzymes and transporter proteins in human placenta and fetal tissues// Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2009, 5: 1483-1499.

15. Omoumi A, Wang Z, Yeow V, Wu-Chou YH, Chen PK, Ruczinski I, Cheng J, Cheah FS, Lee CG, Beaty TH, Chong SS. Fetal polymorphisms at the ABCB1-transporter gene locus are associated with susceptibility to non-syndromic oral cleft malformations. Eur J Hum Genet. 2013 Feb 27.

16. Prouillac C, Lecoeur S (2010) The role of the placenta in fetal exposure to xenobiotics: importance of membrane transporters and human models for transfer studies. Drug Metab Dispos 38: 1623-1635.

17. Rao V.V, Dahlheimer J.L., Bardgett M.E., Snyder, A.Z., Finch R.A., Sartorelli A.C., Piwnica-Worms D. Choroid plexus epithelial expression of MDR1 P glycoprotein and multidrug resistance-associated protein contribute to the blood-cerebrospinal-fluid drug-permeability barrier // PNAS Vol. 96, Issue 7, 3900-3905, March 30, 1999.

Размещено на Allbest.ru