Молекулярные механизмы регуляции секреции соляной кислоты слизистой оболочки желудка

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Молекулярные механизмы регуляции секреции соляной кислоты слизистой оболочки желудка

О.Д. Лопина, А.А. Котлобай, А.М. Рубцов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Секреция соляной кислоты слизистой оболочкой желудка обеспечивается париетальными (обкладочными) клетками, находящимися в эпителиальном слое желудочных желез фундального отдела. Характерной особенностью этих клеток является присутствие специальных структур, так называемых внутриклеточных канальцев, образованных выпячиваниями апикальной мембраны. Поверхность канальцев, как и поверхность апикальной мембраны, покрыта многочисленными микроворсинками. Благодаря наличию внутриклеточных канальцев и микроворсинок значительно увеличивается поверхность, через которую осуществляется секреция соляной кислоты.

Активация секреции соляной кислоты происходит под действием секретогенов: гистамина, гастрина и ацетилхолина. Она сопровождается существенными морфологическими изменениями париетальных клеток: наблюдается значительное увеличение размеров внутриклеточных канальцев и длины микроворсинок, что приводит к увеличению поверхности мембраны, обеспечивающей секрецию. Кроме того, в активированных париетальных клетках внутриклеточные канальцы открываются в люминальное пространство, что обеспечивает доступ выделяющейся соляной кислоты в просвет желудка.

соляный кислота слизистый желудок

Рис. 1. Транспортные системы париетальной клетки, обеспечивающие секрецию соляной кислоты (схема).

В проникновении соляной кислоты через апикальную мембрану участвует многокомпонентная транспортная система (рис. 1). Основным элементом этой системы является протонный насос, обеспечивающий АТФ-зависимый обмен внутриклеточных Н+ на внеклеточные К+ [7]. Оба иона переносятся против электрохимического градиента. Из клетки К+ выходят по градиенту, по-видимому, через специальный канал, причем выход этого катиона сопровождается выходом из клетки Cl-. Таким образом, суммарным результатом работы этой транспортной системы являются секреция соляной кислоты в люминальное пространство и циклическое перемещение ионов калия из клетки наружу и в обратном направлении. Cl- входят в клетку через базолатеральную мембрану. В транспорте этого аниона принимает участие НСО3-, /Cl- -анионный обменник. Необходимые для такого обмена НСО3-- образуются в клетке в результате работы специального фермента карбоангидразы, обеспечивающего синтез Н2СО3 из углекислого газа, который появляется в клетке в результате метаболических процессов, и воды. Н+, образующийся при диссоциации Н2СО3, секретируется протонным насосом в люминальное пространство. Карбоангидраза локализована в клетке в непосредственной близости от системы внутриклеточных канальцев. При интенсивной работе насоса, когда начинает ощущаться нехватка Н+ внутри клетки, в процесс включаются также встроенные в базолатеральную мембрану катионобменники (К+/Н+ или Na+/Н+), обменивающие внеклеточные Н+ на внутриклеточные К+ или Na+. Таким образом, присутствие дополнительных переносчиков, находящихся на базолатеральной мембране, обеспечивает трансэпителиальный транспорт Cl- и частично Н+.

Роль протонного насоса в системе, обеспечивающей секрецию соляной кислоты, выполняет Н+, К+-АТФаза - фермент, относящийся к семейству АТФаз Р-типа [7]. Ближайшим "родственником" этого фермента является Na+, К+-АТФаза, которая вместе с Н+, К+-АТФазой образует отдельное подсемейство. Кроме эпителиальных клеток желудка, Н+, К+-АТФаза (по-видимому, ее изозим) встречается также в эпителиальных клетках почечных канальцев и в эпителии некоторых отделов кишечника.

Н+, К+-АТФаза локализована в апикальной мембране, тогда как Na+, К+-АТФаза сосредоточена исключительно в базолатеральной мембране. Как и Na+, К+-АТФаза, Н+, К+-АТФаза состоит из субъединиц двух типов: a-субъединицы - полипептида с молекулярной массой около 100 кДа (1033 аминокислотных остатка), выполняющего каталитическую функцию, и b-субъединицы - гликопротеида с невыясненной до конца функцией, молекулярная масса которого составляет 50 - 60 кДа (291 аминокислотный остаток; остальная часть молекулы, примерно 1/3 часть по массе, представлена углеводными фрагментами). В настоящее время определена аминокислотная последовательность как a- [9], так b-субъединиц [10], а также установлено расположение полипептидных цепей этих белков в мембране (рис. 2, А). Полипептидная цепь a-субъединицы несколько раз пересекает мембрану, образуя 5 трансмембранных петель. N- и С-концы a-субъединицы находятся в цитоплазме. Большая часть полипептидной цепи (около 800 аминокислот) образует большой цитоплазматический домен, в котором расположен активный центр фермента, где и происходит гидролиз АТФ. Катионы перемещаются через мембрану по каналу, который формируется трансмембранными петлями. N-конец b-субъединицы находится внутри цитоплазмы, ее полипептидная цепь пересекает мембрану только один раз. Большая часть р-субъединицы располагается с внеклеточной стороны мембраны. На ней расположены участки, подвергающиеся гликозилированию.

Рис. 2. Схема укладки a- и b-субъединиц Н+, К+-АТФазы в липидном бислое (А) и схема, иллюстрирующая каталитический цикл Н+, К+-АТФазы (Б)

АТФазы Р-типа осуществляют гидролиз АТФ до АДФ и неорганического фосфата. Высвобождающаяся в процессе гидролиза энергия используется для переноса катионов через мембрану против электро- химического градиента. Характерной особенностью АТФаз Р-типа является образование в процессе каталитического цикла фосфорилированного интермедиата (фосфорилированию подвергается остаток аспарагиновой кислоты, расположенный на a-субьединице; в Н+, Н+, К+-АТФазе это Asp-385). Вторая особенность этого семейства АТФаз заключается в том, что в процессе гидролиза АТФ фермент пребывает в двух основных конформациях - Е1 и Е2, которые различаются по сродству к переносимым катионам. Конформация Е1 имеет высокое сродство к Н+, а конформация Е2 - к катионам К+. Схема гидролиза АТФ Н+, К+-АТФазой представлена на рис. 2, Б. В конформации Е1 со специфическими центрами, расположенными на цитоплазматической поверхности мембраны, связывается H+, после чего происходит фосфорилирование Asp-385, расположенного в активном центре фермента (образование Е1-Р). После фосфорилирования закрываются створки канала, находящиеся на цитоплазматической стороне мембраны. Затем протоны перемещаются через мембрану, что приводит к изменению конформации фермента (переход Е1-Р в Е2-Р). В этом состоянии открываются створки канала с люминальной (внеклеточной) стороны. После этого протоны высвобождаются из катионсвязывающих участков фермента, а К+ связываются с катионсвязывающими центрами на люминальной поверхности мембраны. Связывание К+ с Е2-Р-формой фермента активирует гидролиз ацилфосфатной связи и высвобождение неорганического фосфата. Вслед за этим закрываются створки канала с внеклеточной стороны и ионы калия с внеклеточной поверхности мембраны перемещаются на цитоплазматическую. Связывание АТФ приводит к тому, что происходит изменение конформации фермента (из Е2 переходит в Е1) и К+ высвобождаются в цитоплазму, после чего цикл может повториться. Обмен Н+ на К+, осуществляемый Н+, К+-АТФазой, является электронейтральным. Возникающая в результате работы протонного насоса разница в концентрации Н+ по разные стороны апикальной мембраны составляет 106. Это самый большой градиент концентраций, создаваемый известными в настоящее время системами активного транспорта.

Активность Н+, К+-АТФазы специфически подавляется омепразолом и другими соединениями (лансопразол, пантопразол), являющимися замешенными производными бензимидазола. Эти соединения, накапливаясь в кислых компартментах, главным образом во внутриклеточных канальцах париетальных клеток, связывают Н+ и превращаются в собственно ингибитор, который ковалентно (необратимо) взаимодействует с SH-группами белка, расположенными на люминальной поверхности апикальной мембраны [8]. Восстановление активности Н+, К+-АТФазы после обработки омепразолом происходит главным образом по мере синтеза новых молекул фермента, поэтому длительность вызванного им ингибирования зависит от скорости обновления фермента (половина молекул Н+, К+-АТФазы человека обновляется за 30-48 ч). Кроме того, известны нековалентные (обратимые) ингибиторы Н+, К+-АТФазы [6]. Среди них наиболее изучен имидазопиридин SCH- 28080. Это соединение взаимодействует с К-связывающим участком фермента. Длительность действия этих соединений на Н+, К+-АТФазу зависит главным образом от продолжительности жизни самого соединения, а не фермента.

Кроме Н+, К+-АТФазы, в секреции соляной кислоты участвуют компоненты, обеспечивающие транспорт К+ по градиенту концентраций и сопряженный с ним выход Cl- против градиента концентраций. Транспорт Cl- осуществляется через специальный хлорный канал. В настоящее время этот канал идентифицирован [5]. Он представляет собой белок с молекулярной массой около 100 кДа (898 аминокислот) и по структуре похож на каналы семейства СlС-2, которые присутствуют в мозге и сердце (гомология между хлорным каналом из слизистой оболочки желудка кролика и СlС-2 хлорным каналом из мозга крысы составляет 93%). Проводимость канала равна 7pS при концентрации CsC1 150 мМ с обеих сторон мембраны. Через канал, кроме Cl-, могут проходить и другие анионы. Селективность канала для анионов уменьшается в ряду I-, Cl-, Br-, NO3. Канал является потенциал- и рН-зависимым. Изменение потенциала от 0 до - 80 мВ приводит к 10-кратному увеличению проводимости канала. При потенциале - 80 мВ и внутриклеточном рН 7,4 снижение рН вне клетки до 3,0 дополнительно увеличивает проводимость канала в 5-6 раз.

К+ покидают клетку, по-видимому, через специальный калиевый канал. Установлено, что секрецию соляной кислоты тормозит тетраэтиламмоний, который известен как ингибитор калиевых каналов. Однако в отличие от Cl-канала, структура которого хорошо изучена, калиевый канал идентифицирован только в электрофизиологических экспериментах.

Для выяснения молекулярных механизмов, обеспечивающих активацию секреции соляной кислоты, необходимо выяснить последовательность процессов, происходящих после связывания молекулы секретогена с рецептором, расположенным на поверхности париетальной клетки. В течение многих лет было известно, что париетальная клетка содержит как минимум рецепторы двух типов: гистаминовые H2-рецепторы и мускариновые M3,-рецепторы для ацетилхолина. До недавнего времени не было данных о рецепторе для гастрина. Считалось, что гастриновые рецепторы находятся на энтерохромаффинных клетках, которые после связывания гастрина высвобождают гистамин. Выделяющийся из энтерохромаффинных клеток гистамин связывается с H2-рецепторами париетальных клеток, обеспечивая стимуляцию секреции. Однако недавно было показано, что и париетальные клетки содержат гастриновые рецепторы [11]. Рецептор для гастрина относится к типу В-рецепторов для холецистокинина (ССК-В). Рецепторы этого типа, как и находящиеся на поверхности париетальных клеток М,-рецепторы, обеспечивают свое действие через О-белки, активирующие фосфолипазу С. Этот фермент гидролизует фосфоинозитиды, находящиеся в липидном слое мембраны. По-видимому, образующийся в результате гидролиза инозитолтрифосфат вызывает выход Са2+ из внутриклеточных депо (эндоплазматический ретикулум), в результате чего внутриклеточная концентрация Са2+ увеличивается. Второй продукт этой реакции диацилглицерол вместе с Са2+ активирует Са, фосфолипидозависимую протеинкиназу (протеинкиназа С), которая в свою очередь фосфорилирует белки мишени, влияя на их функциональную активность. Таким образом, в результате активации париетальных клеток под действием как гастрина, так и ацетилхолина могут происходить увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ и фосфорилирование белков-мишеней под действием протеинкиназы С. Однако вся цепь событий для париетальной клетки не прослежена. Известно лишь, что активация секреции соляной кислоты париетальными клетками под действием гастрина и ацетилхолина приводит к повышению концентрации вторичного мессенджера цГМФ.

Возможные начальные этапы процесса активации секреции париетальными клетками представлены на рис. 3.

Наиболее изучена активация секреции соляной кислоты под действием гистамина. Связываясь с H2- рецептором, этот секретоген через О-белки активирует аденилатциклазу, в результате чего повышается внутриклеточный уровень цАМФ [1]. Вслед за этим происходит повышение внутриклеточной концентрации Са2+: он входит в клетку через плазматическую мембрану. Париетальные клетки содержат цАМФ-зависимые протеинкиназы (протеинкиназы А) двух типов - I и II. Установлено, что мишенями для цАМФ-зависимых протеинкиназ является большое количество как цитоплазматических, так и мембранных белков. Одной из идентифицированных мишеней протеинкиназы А является Cl-канал. В системе in vitro установлено, что фосфолирование канала этой протеинкиназой приводит к увеличению его проводимости. В экспериментах с мембранными везикулами, полученными из стимулированных гистамином и несекретирующих (обработанных антагонистом H2-рецептора циметидином) париетальных клеток, было показано, что скорость секреции соляной кислоты в несекретирующих клетках лимитируется не активностью Н+, К+-АТФазы, а проницаемостью Cl-канала. Таким образом, фосфорилирование Cl-канала протеинкиназой А устраняет лимитирующую стадию в процессе секреции соляной кислоты.

Рис. 3. Рецепторы, через которые осуществляется активация секреции в париетальной клетке (схема) и возможные механизмы активации

В несекретирующих париетальных клетках большая часть Н+, К+-АТФазы является неактивной и сосредоточена в везикулах, расположенных в цитоплазме неподалеку от апикальной поверхности мембраны (так называемые тубуловезикулы). Активация секреции сопряжена в первую очередь с перемещением этих везикул к поверхности апикальной мембраны или мембраны канальцев и с их слиянием с этими мембранами. Этот процесс сопровождается увеличением количества молекул Н+, К+-АТФазы на единицу поверхности мембраны. Активное участие в этом процессе принимает цитоскелет париетальной клетки: обработка клеток цитохалазинами А и Е, которые блокируют удлинение микрофиламентов, предотвращает активацию секреции. Известно, что около 4% белка париетальной клетки представлено актином и около 60% актина находится в полимеризованной F-форме [3]. Нити полимеризованного актина, сшитые друг с другом специальными белками цитоскелета, располагаются внутри микроворсинок апикальной поверхности мембраны, формируя своеобразный скелет. Другие белки цитоскелета сшивают нити актина с белками, встроенными в мембрану. Активация секреции сопряжена с перемещением актина к поверхности апикальной мембраны, а миозина - ближе к центру клетки. По-видимому, среди фосфорилируемых протеинкиназой А белков париетальных клеток немало белков цитоскелета. В частности, среди мишеней протеинкиназы А идентифицирован периферический белок мембраны эзрин с молекулярной массой 80 кДа, который участвует в связывании актиновых микрофиламентов с мембраной [4].

При стимуляции клетки гистамином наблюдается перераспределение белков между цитоплазмой и мембраной. Удалось обнаружить белки, которые при активации секреции перемещаются из цитозоля в мембрану и специфически взаимодействуют с Н+, К+-АТФазой. Известно, что Н+, К+-АТФаза, как и другие АТФазы P-типа, ингибируется мелитгиномпептидом из яда пчелы, состоящим из 26 аминокислот. Имеющиеся в настоящее время данные позволяют предполагать, что мелиттин имитирует определенную детерминанту, участвующую в белок-белковых взаимодействиях в клетке. При использовании антител на мелиттин в цитозоле несекретирующих париетальных клеток был обнаружен белок с молекулярной массой 67 кДа. Этот белок взаимодействует с антителами на мелиттин и, следовательно, содержит участки, по структуре похожие на мелиттин. При стимуляции париетальных клеток гистамином мелиттиноподобный белок перемещается из цитозоля в мембрану [2]. Белок был получен в чистом виде, и в экспериментах in vitro установлено, что он специфически взаимодействует с Н+, К+-АТФазой. Однако пока неизвестно, что является сигналом для перемещения мелиттиноподобных белков при стимуляции, а также какова их функция. Не исключено, что они также являются белками цитоскелета, осуществляющими взаимодействие Н+, К+-АТФазы с микрофиламентами. Полученная в последние годы информация позволяет считать, что белки, обеспечивающие связывание мембранных белков с цитоскелетом, зачастую не только являются структурным элементом, но и участвуют в передаче сигнала. Таким образом, мелиттиноподобный белок, перемещающийся в мембрану при стимуляции секреции, может оказаться и активатором Н+, К+-АТФазы.

Завершая обзор экспериментальных данных, можно сделать следующее заключение: несмотря на то что представление о молекулярных механизмах активации секреции соляной кислоты значительно расширилось, детальное изучение этого процесса лишь начинается и в ближайшее время можно ожидать появления новых интересных фактов.

Список литературы

1. Cuppoletti У., Malinowska D., Sachs G. Biochim. biophys. Acta. - 1988. - Vol. 972. - P.95 - 105.

2. Cuppoletti Х., Huang Н., Kaetzel M, Malinowska D. Amer.J.Physiol. - 1993. - Vol. 264.- P. 637 - 644.

3. Dabihe M, Munizaga А., Koenig С.S. Biol.Res. - 1994. - Vol. 27. - P.29 - 38.

4. Hanzel D., Reggio Н., Bretcher А. et al. ЕМВО Journ.- 1991. - Vol. 10. - P.2363-2373.

5. Malinowska D.Н, Kupert ТХ, Baninski А. et al. Amer. J. Physiol. - 1995. - Vol. 268. - P. 191 - 200.

6. Мope А., Sachs G. Biochem. Soc. Trans. - 1992. - Vol. 20.- P. 566-572.

7. Radon Е.С., Reuben М.А. Ann. Rev.Physiol. - 1990.-Vol. 52. - P. 321 - 344.

8. Sachs G., Shin J;М, Briving С. et al. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 1995. - Чо1. 35. - P. 277 - 305.

9. Shull G.Е., Етое! I.В. J. biol. Chem. - 1986. - Vol. 261. - P. 16788-16791.

10. Shull G.Е. J.biol. Chem. - 1990. - Vol. 265. - P.12123-12126.

11. Wolfe M.M, 7seny С.С. Gastroenterology. - 1993.-Vol. 104. - P. 1876 - 1878.

Размещено на Allbest.ru