Использование изотопной масс-спектрометрии в гастроэнтерологической практике

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Использование изотопной масс-спектрометрии в гастроэнтерологической практике

Г.В. Цодиков, А.М. Зякун, Б.В. Афонин,

В.А. Исаков, Н.А. Морозова, Ж.Ю.

Ганская, Д.Ю. Матевосов, В.Н. Захарченко,

В.П. Пешенко, В.Е. Судовцов

В механизме развития хронических эрозивно-язвенных изменений гастродуоденальной зоны существенная роль принадлежит бактерии Helicobacter pylori. По данным различных авторов, Нр-инфицированность среди взрослого населения России составляет 70-90%, среди детей школьного возраста - около 30-60%. В связи с этим представляется необходимой диагностика этой инфекции при обследовании практически всех лиц, которые обращаются за медицинской помощью с жалобами на заболевания верхних отделов желудочно-кишечного тракта и в профилактических целях.

В стремлении предупредить ятрогенный путь передачи инфекции всё большее значение приобретают неинвазивные методики, к которым относится и уреазный дыхательный тест (¹³С-УДТ). В его основе лежит масс-спектрометрическая регистрация ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе после приема тестовой мочевины, содержащей повышенное количество стабильного ¹³С изотопа по сравнению с его природной распространенностью (рис. 1).

Рис. 1. Схема уреазного дыхательного теста с ¹³С-мочевиной

Этот тест был впервые применен Грахамом с соавторами в 1987 г. для диагностики хеликобактериоза у человека [12]. При наличии в желудочно-кишечном тракте бактерий Н. pylori, обладающих уникально высокой уреазной активностью, происходит гидролиз мочевины с образованием углекислоты (СО₂) и аммиака (аммония). Образовавшиеся газы всасываются в кровь, затем попадают в легкие и далее с выдыхаемым воздухом выводятся из организма.

Чтобы отличить СО₂, продуцируемый организмом человека как естественный метаболит, от углекислоты, образовавшейся при разрушении мочевины под влиянием бактериальной уреазы, в качестве тест-препарата в организм вводят ¹³С-мочевину, содержащую повышенное количество ¹³С-изотопа по сравнению с его природным содержанием. Если количество ¹³СО₂ превышает его природное содержание в выдыхаемом воздухе, это свидетельствует о наличии уреазной активности в желудочно-кишечном тракте тестируемого пациента. Поскольку в организме здорового человека уреазная активность отсутствует, то это рассматривается как неопровержимое доказательство наличия бактериальной инфекции. В верхних отделах желудочно-кишечного тракта человека, куда в первую очередь поступает водный раствор ¹³С-тест-препарата, представителем микрофлоры, способным расщеплять ¹³С-мочевину, может быть только Н. pylori.

¹³С является нерадиоактивным стабильным изотопом, его природная концентрация в организме человека составляет около 1% от общего количества углерода. Поэтому ¹³С-УДТ, основанный на использовании ¹³С-мочевины как тест-препарата, может применяться широко, в том числе детьми и беременными [5, 7]. В настоящее время во многих медицинских учреждениях мира накоплен большой опыт применения ¹³С-УДТ для выявления Нр-инфекции у человека. Учитывая абсолютную безопасность использования ¹³С-мочевины для человека, в ряде публикаций приведены рекомендации об отсутствии необходимости получения специальных лицензий, разрешающих использование ¹³С-УДТ в медицинской диагностической практике [6].

Существующие методики по реализации ¹³С-УДТ имеют различия в основном по двум направлениям: по способу приема ¹³С тест-препарата и по технологии измерения ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе пациента.

Целью настоящего сообщения является выявление факторов, влияющих на чувствительность и точность регистрации ¹³СО₂ с помощью специализированных физических приборов - масс-спектрометров, а также поиск путей, повышающих эти параметры.

Достоверность и информативность проводимой Нр-диагностики с использованием физических приборов во многом зависит от методики приема ¹³С тест-препарата, схемы отбора проб и анализа содержания ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе.

Во всех сообщениях по технологии тестирования Нр-инфекции с помощью ¹³С-УДТ рекомендуется проводить прием ¹³С-тест-препарата натощак. В ряде методик перед введением через рот водного раствора ¹³С-мочевины за 10-30 мин. предлагается принимать, первичный (пробный) завтрак, состоящий из полужидкой или жидкой пищи: пудинги, соки, свежее молоко или раствор лимонной кислоты [8, 14]. Обнаружено, что максимум выхода ¹³СО₂ с выдыхаемым воздухом у пациента после приема ¹³С-мочевины может зависеть от состава принимаемого предварительного завтрака. Например, использование полужидкой пищи увеличивает время выхода максимума ¹³СО₂ по сравнению с приемом свежего молока или раствора лимонной кислоты. В некоторых сообщениях рекомендуют, чтобы пациент после приема раствора несколько минут находился в лежачем положении и переворачивался с бока на бок. Однако необходимость в выполнении этого требования была подвергнута сомнению, поскольку при специальном обследовании пациентов в лежачем и сидячем положениях существенных различий в выходе ¹³СО₂ с выдыхаемым воздухом по истечении 20 мин. после приема ¹³С-мочевины не обнаружено [12]. Эти примеры свидетельствуют как о недостаточно выясненной роли предварительного питания в диагностике Нр-инфекции, так и о неопределенности в выборе оптимальных условий его приема.

Важным моментом в реализации ¹³С-УДТ является количество тест-препарата (¹³С-мочевины), который используется в диагностике Нр-инфекции, поскольку основную часть стоимости диагностической процедуры составляет стоимость ¹³С-мочевины. В традиционно применяемых методиках количество однократно принимаемой ¹³С-мочевины составляет 75-125 мг. Недавно появилось сообщение о возможности его снижения до 25 мг, благодаря комбинации эндоскопического распыления тестового раствора в желудке [11]. Очевидно, что при этой процедуре теряется главное достоинство ¹³С-УДТ- неинвазивность метода.

Расходы на диагностику Нр-инфекции зависят не только от количества используемого тест-препарата, но и от технологии измерения ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе после приема водного раствора ¹³С-мочевины. Время полного выноса ¹³СО₂ с выдыхаемым воздухом зависит от количества внесенного тест-препарата и уреазной активности, определяемой степенью инфицирования желудочно-кишечного тракта пациента. Оно может составлять от 1,0 до 1,5 часов после приема тестового раствора. Для снижения расходов, связанных с использованием приборного времени, в практике проводят два измерения содержания ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе: до приема тест-препарата и через 30 мин. после его приема. Вопрос о том, насколько такие измерения отражают истинный уровень Нр-инфекции, до последнего времени оставался открытым. Чувствительность и специфичность ¹³С-УДТ в значительной степени зависит от условно выбранного «нулевого» значения количества ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе неинфицированного пациента. В большинстве методических сообщений принимаемая величина «нулевого» значения d¹³C находилась в пределах 2,5-5‰. При ошибке в измерении количества ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе пациента не более 0,2‰ относительно базального уровня величина указанного выше «нулевого» значения является завышенной. Очевидно, что в основе выбора величины «нулевого» значения лежат другие, пока не установленные причины. Таким образом, предельная чувствительность, специфичность ¹³С-УДТ на наличие Нр-инфекции и стоимость анализов зависят от целого ряда недостаточно выясненных факторов.

Задача проведенного исследования заключалась в изучении основных причин, влияющих на чувствительность ¹³С-УДТ и достоверность данных, получаемых с его помощью, а также в выяснении возможных путей снижения затрат, необходимых для использования этого метода.

Обследовано 215 человек, из которых 54 мужчины (в возрасте от 20 до 70 лет) и 43 женщины (в возрасте от 23 до 61 года) жаловались на боли в эпигастрии или изжогу. Для обследуемых пациентов были получены предварительные гастроскопические и микроскопические данные, свидетельствующие о нарушениях состояния слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки (антихеликобактерные препараты не принимались). В число обследуемых входили также 58 человек, прошедших курс антихеликобактерной терапии, и 60 здоровых субъектов. Все участники исследования были проинформированы о целях проводимой работы и дали свое согласие на участие в ней.

Нр-инфекция подтверждена эндоскопическим исследованием с прицельной биопсией слизистой оболочки желудка. Определение наличия бактерий в биопсийном материале проводили общепринятым методом - окраской гистологических препаратов гематоксилином и эозином. С целью верификации Нр-инфекции всем больным до лечения провели дополнительные исследования: микробиологический анализ и полимеразную цепную реакцию на ДНК Н. pylori в биопсийном материале и кале.

Определение уреазной активности проводили с помощью ¹³С-УДТ путем многократной в течение 60 мин. регистрации изотопного состава после приема ¹³С-препарата, что позволило проследить кинетику выделения ¹³СО₂ у обследуемых лиц. Согласно методике настоящего исследования, пациент натощак принимал 20 мг ¹³С-мочевины и 2 г лимонной кислоты, растворенных в 150 мл кипяченой воды. До приема указанного раствора и через 10, 15, 20, 25, 30, 40 и 60 минут пациент в сидячем положении делал спокойный выдох в стеклянную емкость объемом 10 мл, которую затем герметично закрывал резиновой пробкой. Проверка сохранности газа в такой емкости свидетельствовала о возможности ее хранения до нескольких недель без потери информативности.

В качестве тест-препарата использовали ¹³С-мочевину (99% ¹³С, EUROISOTOP Groupe СЕА) и отечественный ¹³С-карбамид-тест (ООО "TSD-ISOTOPES" г. Троицк) фармацевтической квалификации для клинических исследований. В качестве дополнительного питания пациенты принимали два вида пищевой лимонной кислоты: лимонную кислоту (ГОСТ 908-79), поступающую в продажу от продовольственной компании «Второй Дом», Москва (ЛК₁), и лимонную кислоту, поставляемую предприятием РАСПАК, Москва (ЛК₂).

Масс-спектрометрическое измерения изотопного состава углерода выдыхаемой углекислоты проводили на специализированном масс-спектрометре BreathMAT (Finnigan, Германия). Масс-спектрометр соединен с хроматографом, с помощью которого определяется выделение СО₂ в выдыхаемом воздухе. Изменения содержания ¹³С-изотопа в СМ₂ (dC,‰) выявляли согласно выражению

д¹³C=(R_t/R₀-1)Ч1000‰,

где R₀ и R_t - отношения содержания ¹³С- и ¹²С-изотопов в СО₂ до и после приема ¹³С-мочевины.

Величина ошибки измерения разности в содержании ¹³С в анализируемой углекислоте относительно лабораторного стандарта не превышало ±0,2‰.

Согласно традиционной технологии диагностики Нр-инфекции с помощью ¹³С-УДТ, перед приемом per os ¹³С-мочевины пациенту давали первичный завтрак, который включал жиры и углеводы [10] или раствор лимонной кислоты [13]. Известно, что изотопный состав углерода пищи и ее компонентов (жиры, белки, углеводы) может варьировать в широких пределах: от -10 до -30‰ [9]. Следовательно, после приема этого завтрака изотопный состав углерода метаболического СО₂ у испытуемого также может варьировать относительно исходного содержания в ней ¹³С в сторону как повышения, так и снижения, в зависимости от того, какой компонент пищи будет метаболизироваться в данный момент. Это может приводить к неконтролируемому изменению изотопного состава углерода выдыхаемой углекислоты в процессе наблюдения и, соответственно, служить источником ложноположительных или ложноотрицательных выводов относительно тестируемой уреазной активности у пациента. Поэтому для получения достоверной информации о возможности гидролиза ¹³С-мочевины в организме обследуемого необходимо было выяснить, в какой степени у пациента может отличаться изотопный состав углерода метаболической углекислоты, которая образуется при использовании компонентов первичного завтрака по сравнению с базальным изотопным составом выдыхаемой углекислоты, определяемым метаболизмом обычно потребляемой пищи.

Учитывая особую значимость этого показателя, на примере обследования 215 жителей Москвы и Московской области был определен базальный диапазон вариаций д¹³С выдыхаемого СО₂ после 12-часового голодания. Изотопный состав углерода выдыхаемой углекислоты варьировал в пределах д ¹³С= -(18-26)‰ относительно международного стандарта PDB, а средневзвешенное его значение составляло -22,4‰. Полученный показатель изотопного состава выдыхаемого СО₂ может служить одним из критериев при выборе продуктов для первичного завтрака.

Известно, что цикл мочевины в организме человека сопряжен с циклом трикарбоновых кислот (ЦТК). По имеющимся биохимическим данным в организме взрослого человека за сутки выделяется до 20 г мочевины [3]. Пути вывода мочевины из организма связывают с функцией почек, проводимостью кожного покрова (потовыделение). Основным источником мочевины в желудке является ее выделение из кровотока в просвет желудка. Согласно биохимическим представлениям, прием пищи вызывает активацию ЦТК и, соответственно, цикла мочевины. Очевидно, что реакцией на выделение эндогенной мочевины может быть увеличение активности бактериальной уреазы в случае присутствия Нр-инфекции. В соответствии с этим нами была выбрана в качестве пищевой добавки лимонная кислота как монопродукт, являющийся одним из ключевых звеньев ЦТК.

Изотопный анализ двух образцов пищевой лимонной кислоты, имеющихся в продаже, показал, что в лимонной кислоте от РАСПАК (ЛК₂) содержится больше изотопа ¹³С по сравнению с базальным значением СО₂ для жителей обследованного региона и составляет д¹³С = -13,4‰. Изотопный состав лимонной кислоты от Второго Дома (ЛК₁), наоборот, имел пониженное содержание изотопа ¹³С по сравнению с базальным значением СО₂ для жителей обследованного региона и составил д¹³С = -26,4‰.

Изотопный состав углерода в выдыхаемом СО₂ претерпевает изменения после приема натощак 2 г одного из указанных выше образцов лимонной кислоты - ЛК₁ и ЛК₂. Так, после приема водного раствора ЛК₁ изотопный состав углерода выдыхаемой субъектом углекислоты достигал минимума в значении d¹³C примерно через 25 мин. При этом величина разности в изотопном составе углерода в выдыхаемом СО₂ составляла -0,8‰ относительно базального значения. При приеме водного раствора ЛК₂, наоборот, отмечается повышенное содержание ¹³С-изотопа в выдыхаемой углекислоте на 1,3‰, что при определении уреазной активности с использованием ¹³С-УДТ может интерпретироваться как свидетельство наличия Нр-инфекции. Таким образом, результаты проведенного анализа продемонстрировали особую значимость первоначального определения изотопного состава углерода метаболической углекислоты, регистрируемого после приема одного пробного завтрака.

В технологии определения уреазной активности в организме пациента в качестве пищевой добавки в настоящем исследовании использовали лимонную кислоту ЛК₁ с изотопным составом углерода заметно обедненной ¹³С относительно базальной углекислоты. Этот прием позволил регистрировать начало и продолжительность метаболизма экзогенной лимонной кислоты в организме обследуемого субъекта. Изотопный состав тестовой ¹³С-мочевины содержал значительно больше ¹³С по сравнению с ЛК₁. Поэтому на фоне изменения изотопного состава углерода выдыхаемой углекислоты, образующейся при использовании лимонной кислоты, гидролиз ¹³С-мочевины при наличии уреазной активности детектируется с большой степенью достоверности. Значимой величиной, отражающей дополнительное включение изотопа ¹³С в выдыхаемую углекислоту в результате гидролиза тестовой ¹³С-мочевины и указывающей на наличие уреазной активности в организме, является 0,5‰, т.е. увеличение чувствительности метода почти на порядок по сравнению с традиционным анализом. Надежность обнаружения уреазной активности в организме пациентов значительно возрастает в случае регистрации кинетики изменения изотопного состава углерода выдыхаемой углекислоты после одновременного приема водного раствора лимонной кислоты и ¹³С-мочевины.

В качестве демонстрации вышесказанного на рис. 2 приведены результаты измерения изотопного состава углерода выдыхаемой углекислоты после приема ¹³С-мочевины и лимонной кислоты у пациентов с высокой степенью уреазной активности (кривая 1) или с низкой уреазнои активностью (кривая 2), обусловленной Нр-инфекцией, и в норме - при ее отсутствии (кривая 3). В случае детекции Нр-инфекции у пациентов с высокой уреазной активностью достаточно провести измерение в двух временных точках, а именно: до приема тест-раствора и через некоторое время после его приема. Однако при малой уреазной активности для уверенной детекции Нр-инфекции у пациента необходимо провести измерение изотопного состава по нескольким временным точкам, т.е. представить кинетику изменения содержания ¹³СО₂ не менее, чем за 60 минут после приема тест-раствора.

Рис. 2. Кинетика изменения изотопного состава выдыхаемой углекислоты в зависимости от времени наблюдения после приема тестового раствора, содержащего ¹³С-мочевину:

1 - кривая, отражающая ¹³СО₂ при высокой степени инфекции; 2 - кривая, свидетельствующая о следовой активности бактериальной инфекции; 3 - кривая, свидетельствующая об отсутствии хеликобактерной инфекции.

гастродуоденальный спектрометрический изотопный

Время максимума выноса ¹³С-углекислоты после приема тест-препарата может зависеть от типа используемого предварительного завтрака. На рис. 3 приведены результаты наблюдения времени максимального выноса ¹³СО₂ у обследованных нами пациентов, в организме которых отмечено наличие уреазной активности. Так, при использовании водного раствора лимонной кислоты в качестве пищевой добавки одновременно с приемом ¹³С-мочевины более чем у 80% обследованных пациентов, инфицированных Нр, время максимума выноса ¹³СО₂ находилось в пределах 15-25 мин. после приема тест-препарата. Лишь у чуть больше 5% пациентов наблюдался максимум выноса ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе через 30 мин. после приема тест-препарата. Из полученных данных следует, что традиционно рекомендованная детекция уреазной активности по содержанию ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе через 30 мин. при наличии Нр-инфекции может неадекватно отражать истинную картину метаболизма ¹³С-мочевины. На основе полученных результатов для скринингового анализа, определяющего хеликобактерную инфекцию, рекомендуем проводить измерения изотопного состава углерода в выдыхаемой углекислоте, по крайней мере, в трех временных точках: а) исходная (до приема тестового раствора), б) через 20 минут после приема тестового раствора и в) через 30 минут (как общепринятое измерение).

Рис. 3. Число обследованных пациентов (%), инфицированных Н. pylori, у которых наблюдался максимум выноса ¹³СО₂ через соответствующий период времени (мин.) после приема тестового раствора, содержащего ¹³С-мочевину.

Для обоснования возможности использования в качестве тест-препарата 20 мг ¹³С-мочевины была проведена оценка максимального значения д¹³С в выдыхаемой углекислоте. Как следует из рис. 4, примерно у 70% пациентов с Нр-инфекцией после приема тест-препарата изотопный состав углерода выдыхаемой углекислоты в максимуме превышал на 10-30‰ ее базальное значение и лишь у 30% обследованных пациентов отмеченное превышение в изотопном составе находилось в пределах 5-10‰.

Рис. 4. Число пациентов (n в % от всех обследованных), инфицированных Н. pylori, и зарегистрированное максимальное значение д¹³С (дельта 13-С, ‰) в выдыхаемой ими углекислоте после приема ¹³С-мочевины.

С учетом ошибки измерения изотопного состава углерода СО₂, составляющей 0,2‰, изотопное отклонение более 5‰ в выдыхаемом СО₂ после приема тест-препарата является вполне значимой величиной. С использованием 20 мг ¹³С-мочевины как тест-препарата проведена корреляция между величиной д¹³С выдыхаемой СО₂ после приема указанного количества пациентами, имеющими Нр-инфекцию, и количеством Нр-клеток, определенных гистологическим методом. Гистологический метод анализа Нр-бактерий проводили с помощью светового микроскопа после обработки материала биоптата красителями. Определяли степень бактериальной обсемененности по 5 баллам: 0 - в поле зрения (ґ400) клетки отсутствуют; 1 - выявляется 5-10 клеток; 2 - 10-50 клеток; 3 - 50-70 клеток; 4 -более 70 клеток (рис. 5).

Рис. 5. Сравнение данных гистологического (инвазивного) и ¹³С-УДТ (неинвазивного) методов определения хеликобактерной инфекции.

Как следует из приведенных данных, наибольшее расхождение между гистологической оценкой и масс-спектрометрическим анализом отмечено при диагностике малой Нр-обсемененности верхнего отдела слизистой желудочно-кишечного тракта. Очевидно, что это расхождение обусловлено разной информативностью анализируемых проб: гистологические определения ограничены немногими отдельно взятыми пробами (точечный анализ), а масс-спектрометрические данные отражают уреазную активность всей поверхности слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки (интегральный анализ).

Таким образом, в диагностике Нр-инфекции с помощью уреазного дыхательного теста использование 20 мг ¹³С-мочевины обеспечивает получение надежных данных об уреазной активности в желудочно-кишечном тракте обследуемого и должно применяться в медицинской практике.

Литература

1. Исаков В.А., Домарадский И.В. Хеликобактериоз. - М., 2003. - 412 с.

2. Лапина Т.Л. // Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии, под. ред. В.Т. Ивашкина, Ф. Мегро, Т.Л.Лапиной. - М., 1999. - С. 107-116.

3. Мецлер Д. Биохимия. Т. 1-3. - М., 1980. - С. 95-98.

4. Atherton J.C., Washington N., Bleckshaw P.E. et al. // Gut. - 1995. - V. 36. - P. 337-340.

5. Bazzoli F., Zagari M., Fossi S. et al. // Helicobacter. - 1997. - V. 2 (Suppl. 1). - P. 34-37.

6. Bode G., Rothenbacher D., Brenner H., Adter G. // Scand. J. Gastroenterol. - 1998 - V. 33, No. 5. - P. 468-472.

7. Cadranel S., Corvaglia I., Bontems P. // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. - 1998. - V. 27, No. 3. - P. 275-280.

8. De Niro G., Epstein D. // Science. - 1978. - V. 197. - P. 261-263.

9. Dominguez-Minoz J.E., Leodolter A., Sauerbrach Т., Malferseiner P.A // Gut. - 1997. - V. 40, No. 4. - P. 459-462.

10. Graham D.Y., Klein P.D., Evans D.J. et al. // Lancet. - 1987. - No. 1. - P. 1174-1177.

11. Isomoto H., Inoue K., Shikuwa S.et al. // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. - 2002. - V. 14, No.10. - P. 1093-1100.

12. Miwa H., Murai Т., Ohkura R. et al. // Helicobacter. - 1997. - V. 2, No. 2. - P. 82-85.

13. Reinauer S., Goerz G., Ruzicka T. et al. // Acta Derm. Venerol. (Stockh.) - 1994. - V. 74. - P. 361-363.

14. Wang W.M., Lee S.C., Ding H.J. et al. // J. Gastroenterol. - 1998. - V. 33, No. 3. - P. 330-335.

Размещено на Allbest.ru