Будова губчастої речовини стегнової кістки щурів, за експериментального фумонізинотоксикозу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Будова губчастої речовини стегнової кістки щурів, за експериментального фумонізинотоксикозу

У статті наведені дані і проаналізовані результати, які вказують на те, що інтоксикація фумонізинами щурів, незважаючи на покращення даних трабекулярної гістоморфометрії, призводить до порушень кісткового гомеостазу і нами доведено, що фумонізини можуть впливати на проліферацію клітин у ростовій пластині та синтез протеогліканів у суглобовому хрящі. Внаслідок інтоксикації фумонізинами спостерігалися негативні структурні зміни в рості пластинок суглобових хрящів, в той час як у контрольних тварин покращилися майже всі гістоморфометричні параметри трабекулярної кістки.

Встановлено, що дози фумонізинів, які використовували в цьому дослідженні, спричиняли негативний ефект, який був достатнім для того, щоб викликати порушення кісткового гомеостазу, що призвело до змін метаболізму кісток і зниження їх міцності. Інформація, отримана в представленому дослідженні, може розширити знання про вплив фумонізинів на структуру та гомеостаз кісток.

Фумонізини є високотоксичними метаболітами грибів роду Fusarium proliferatum та Fusarium verticillioides, які зазвичай містяться в кукурудзі та кормах на основі кукурудзи. Існує безліч публікацій про вплив фумонізинів на організм людей та тварин, проте все ще є мало відомостей про можливий ефект порушення гомеостазу кісток, за впливу фумонізинів.

Відомо, що однією з головних функцій кісток в організмі людини та тварин є забезпечення міцності як цілого, так і окремих органів при дії навантажень. Висока функціональна довершеність кісткової тканини трубчастих кісток призначена виконувати опорну функцію, забезпечується унікальністю її структурної організації. Поверхневі ділянки трубчастої кістки утворені компактною кісткою, а внутрішні - губчастою. При цьому доля губчастої речовини у формуванні міцності трубчастої кістки сягає 85 %. Механічні властивості кістки залежать від багатьох чинників, одним з яких є мікроархітектурна організація та ступінь з'єднаності трабекул у тривимірній трабекулярній сітці губчастої речовини. Через різноманітність діючих у прижиттєвих умовах навантажень, будова губчастої кісткової тканини неоднорідна та анізотропна. Характер цієї неоднорідності та анізотропії є результатом функціональної адаптації кісткової тканини до умов життєдіяльності організму [1]. В науковій літературі достатньо даних про зміни і особливості будови губчастої речовини за впливу різних чинників, проте жодних публікацій щодо впливу мікотоксинів, зокрема фумонізинів, за тривалого їх застосування.

У зв'язку з цим метою нашого дослідження стало встановлення закономірностей будови губчастої речовини стегнової кістки щурів-самців лінії Вістар за впливу фумонізинів (FB).

Матеріали і методи. Всі експериментальні процедури були затверджені Комітетом місцевої етики в Державному науково-дослідному контрольному інституті ветеринарних препаратів та кормових добавок та виконані відповідно до Директиви 2010/63/ЄС Європейського Парламенту та Ради по захисту тварин [4, 5], які використовуються для наукових цілей. Дослідження проводили в умовах віварію Державного науково-дослідного контрольного інституту ветеринарних препаратів та кормових добавок.

Для дослідження було відібрано 40 щурів-самців (5-тижневого віку) лінії Вістар. Після індивідуального зважування тварин поміщали окремо в поліпропіленові клітки (розміри 380 х 200 х 590 мм) і залишали для акліматизації до нових лабораторних умов на тиждень. Щурів утримували в приміщенні за температури 21 ± 3 °С та вологості 55 ± 5 %. Тварини мали вільний доступ до води протягом 12 год/12 год циклу день/ніч. Після періоду акліматизації тварини були випадковим шляхом розподілені у дві групи: не інтоксиковану фумонізинами контрольну групу (група К; n=20) та інтоксиковану фумонізинами групу (група FB; n=20). Щурі обох груп споживали збалансований корм для гризунів, для забезпечення всіх харчових потреб тварин, зазначених у директиві AIN-93M (Reeves et al., 1993). Цей корм також було попередньо досліджено, на вміст FB.

Фумонізинотоксикоз був викликаний щоденним введенням сумарного фумонізину (FB B1+ FB B2) внутрішньошлунково в дозі 90 мг/кг маси тіла, на кожну тварину в групі ФБ протягом 21 доби. Оскільки немає даних літератури і летальна доза DL50 FB для щурів не відома (McKean et al., 2006), нами в попередніх дослідженнях були встановлені дози DL50 (900 мг/кг маси тіла). Виходячи з наших попередніх результатів, введена доза FB B1+ FB B2 (75 % і 25 % відповідно, підтверджена методом HPLC-MC, рівна 1/10 встановленого значення DL50, була достатньою для отримання клінічних ознак у всіх інтоксикованих тварин у цьому дослідженні. На 21-у добу експерименту усіх щурів зважували, по 6 голів з кожної групи за допомогою інгаляції СО2 піддавалися евтаназії.

Для досліджень вирізали, відбирали та зважували обидві стегнові кістки, які були розсічені, відпрепаровані і після індивідуальних вимірювань ваги і довжини, кістки були загорнуті в марлю, яка була попередньо замочена в ізотонічному розчині натрію хлориду, та заморожені при мінус 25 °С для подальших досліджень.

Стегнові кістки, відібрані з лівого боку щурів, використовували для остеометричних вимірювань і гістоморфометричного аналізу, в той час як з правого боку стегнові кістки піддавали денситометрії, силовим випробуванням, і спалювали для подальшого аналізу: визначення вмісту золи, дифрактометрії, мінерального складу.

Кісткові зрізи для гістоморфометрії отримували шляхом фіксації в 10 % розчині нейтрального формаліну, проводили декальцинацію, зневоднення в спиртах та заливали в парафінові блоки. З кожного парафінового блоку мікротомом робили сагітальні зрізи завтовшки 4-мкм, що містили хрящ і кістку. Було зроблено три серійні зрізи з чотирьох секцій для кожного зразка. Фарбування зрізів проводили трихромом Масона у модифікації Голднера для оцінки базальної морфології суглобів і ростових пластин хрящів. Для оцінки вмісту протеогліканів у суглобовому хрящі (Suvara et al., 2013) фарбували Сафраніном-O. Фарбування Picrosirius red (PSR) використовували для оцінки морфології трабекулярної та губчастої кістки шляхом оцінки розподілу тонких (незрілих) і товстих (зрілих) колагенових волокон (Rich and Wihittaker, 2005). Тобто для виявлення ізоформ колагену використовували реакцію Picrosirius Red (PSR), забарвлення тканини PSR при цьому дає неспецифічне червоне забарвлення в неполяризованому світлі. У поляризованому світлі (посилене подвійне променезаломлення) колаген I типу визначається кольором в спектрі від оранжевого до світло- червоного, а колаген III типу - зеленим. Обсяг загального колагену на поперечному зрізі визначався як відношення частки площі ізоформи колагену I типу + частка площі ізоформи колагену III типу до площі поперечного перерізу зрізу.

Зрілість колагену оцінювали, обчислюючи, як кількість пікселів, відсоток зелених, незрілих колагенових волокон в секціях PSR, як показано в поляризованому світлі (Blicharski et al., 2017). Оцінювали загальну товщину ростової пластини, а також товщину резервної зони (I), проліферативну зону (II), гіпертрофічну зону (III) і окостеніння (IV) хряща (Tomaszewska et al., 2017c). Аналогічно, в суглобовому хрящі вимірювали товщини горизонтальних (I), перехідних (II) і радіальних (III) зон (Tomaszewska et al., 2013). Всі аналізи мікроскопічних зображень виконували за допомогою програмного забезпечення CellSens (Olympus, Tokyo, Japan). Для трабекулярної ділянки в метафізі і епіфізі кістки були розраховані загальні мікроархітектурні дескриптори з використанням програмного забезпечення ImageJ (Schneider et al., 2012). Спочатку визначали об'єм губчастої кістки (BV/TV), під яким розуміли відсотковий вміст кісткової тканини, розташованої між двома кортикальними шарами. Наступним етапом було визначення параметрів, що характеризують власне мікроархітектоніку трабекулярної кістки: товщина трабекул (Tb.Th., мкм), сепарація трабекул (Tb.Sp., мкм), кількість трабекул (Tb.N., із розрахунку на 1 мм2). Ці показники відображають відповідно ширину трабекул, відстань між ними та щільність їх розташування. В роботі використано абревіатури, запропоновані номенклатурним комітетом з гістоморфометрії American Society of Bone and Mineral Research Histomorphometry Nomenclature Committee [4,

5] . Детальний опис використовуваних параметрів можна знайти в публікаціях (Tomaszewska et al., 2018a).

Результати й обговорення. За результатами проведених досліджень виявили, що у групі щурів-самців лінії Вістар інтоксикація FB зменшила загальну товщину суглобового хряща і всіх його зон (табл. 1).

Таблиця 1. Морфологія ростової пластини хряща і суглобового хряща стегнової кістки, отриманих від контрольних і FB-інтоксикованих щурів (M±m, n=6)

Фарбування Сафраніном-О показало відмінність у вмісті протеогліканів, а саме за інтенсивністю забарвлення у суглобовому хрящі контрольних та ББ-інтоксикованих щурів (рис. 1).

Рис. 1. Трабекулярні ділянки стегнової кістки щурів. A - контроль, B - FB-інтоксиковані щурі.

Фарбування Picrosirius red (PSR), на вміст протеогліканів. 21 доба FB-інтоксикації щурів; шкала - 100 мкм токсикованих щурів спостерігався більш низький вміст протеогліканів (дуже слабке рожеве забарвлення) в суглобовому хрящі, тоді як у контрольній групі рожеве забарвлення було інтенсивніше (рис. 1). В нормі, у позаклітинному матриксі суглобного хряща міститься велика кількість молекул протеоглікану, котрі нековалентно і міцно зв'язані з однією волокнистою молекулою гіалуронану, разом вони становлять великі мультимолекулярні утворення, які потім не можуть бути розсіяні із колагенової сітки (Hardingham, 1999). Саме наявність великих протеогліканових утворень, які міцно охоплені колагеновою сіткою, забезпечує високу щільність статичного заряду та надає суглобному хрящеві його здатності витримувати навантаження.

Протеогліканове утворення також значно підвищує реологічні властивості протеогліканових молекул і, тим самим, впливає на динамічні властивості хряща при стисканні (Hardingham et аі., 1987). Тому, будь-яке зниження концентрації протеогліканів і гіалуронану в хрящі, що виявилося при інтоксикації ФБ, ставить під загрозу функціональні властивості хряща. Крім того, у інтоксикованих ФБ щурів також зменшувалась загальна товщина росту пластини, як результат відбулося зменшення всіх зон, за винятком зони III, яка не зазнала змін (табл. 1).

Не зазнали впливу інтоксикації ББ ні BV/TV у епіфізі стегнової кістки, ні ТЬ.Бр тах у метафізі (табл. 2, рис. 2).

Таблиця 2. Морфологія губчастої кісткової тканини дистального відділу стегнової кістки,отриманих від контрольних і FB-інтоксикованих щурів (M±m, п=6)

Всі інші визначені гістоморфометричні параметри були збільшені у ЕБ-інтоксикованих щурів, за винятком кількості трабекул так званого трабекулярного кісткового індексу, який був значно зниженим як в епіфізі, так і в метафізі (табл. 3, рис. 3) щурів цієї групи.

Рис. 3. Фарбування Picrosirius red (PSR). Губчаста кісткова тканина. A - контроль, B - FB-інтоксиковані щурі. Стрілками позначено незрілий колаген, шкала - 20 мкм.

Губчаста кісткова тканина контрольних щурів містила більше незрілих (тонких) колагенових волокон (зелений колір), у порівнянні з ББ-інтоксикованими щурами. Як видно з рисунку 3, вміст незрілого колагену був нижчим в губчастій кістковій тканині ББ- інтоксикованих щурів.

Але, з іншого боку, не менш важливим і суперечливим, залишається той факт, що за інтоксикації ББ покращилися майже всі гістоморфометричні параметри трабекулярної кістки у наших інтоксикованих щурів (рис. 4). Встановлені у них зростання кількості стегнових трабекул, можна інтерпретувати як компенсаторний механізм втрати кортикальної кістки, намагаючись адаптувати структуру кістки до механічних навантажень (БеггеИі et аі., 2003). Однак, ці результати можуть свідчити про те, що інтоксикація ББ порушила кістковий метаболізм головним чином, впливаючи на мінеральний баланс. Вміст незрілого тонкого колагену в трабекулярній кістці, незалежно від місця визначення у ББ -інтоксикованих щурів, не змінювався протеогліканів.

Рис. 4. Фарбування Сафраном-О, Вміст незрілого колагену, на зрізах метафазу та епіфізу. А - контроль, В - РБ-інтоксиковані щурі; шкала - 50 мкм. Фарбування на виявлення протеогліканів, за інтенсивністю забарвлення, більш низький вміст протеогліканів (слабке фарбування) в хрящі в групі тварин РБ, і помірне фарбування у хрящі щурів контрольної групи, пов'язане з більш високим вмістом

Однак вміст незрілого колагену в губчастій кістковій тканині і суглобовому хрящі зменшувався (табл. 3, рис. 4).

Таблиця 3. Тонкий (незрілий) вміст колагену в стегновій кістці, отриманий від контрольних

Дане дослідження також показало значне зниження товщини суглобового хряща і вмісту протеогліканів у FB-інтоксикованих щурах (рис. 4). Цей факт може спровокувати деградацію суглобового хряща, змінюючи розподіл навантаження через суглоб з функціональними наслідками і труднощами в русі, особливо зі збільшенням віку. Крім того, зниження вмісту протеогліканів може відігравати ключову роль у дестабілізації колагенової сітки, оскільки вони дають стабільність суглобового хряща.

Протеоглікани, функція яких полягає в тому, щоб протистояти стискаючим силам у суглобі, забезпечують гідратацію і підтримують тиск в тканині, роблячи її більш пружною. Разом з колагеновим матриксом протеоглікани допомагають стабілізувати і підтримувати форму хряща (Camplejohn and Allard, 1988; Yanagishita, 1993). Зменшення вмісту протеогліканів і збільшення кількості зрілого колагену може призвести до деградації суглобового хряща.

Нами цей факт описаний вперше. Наскільки нам відомо, немає жодних даних щодо змін суглобового хряща при токсикозі FB. Більш того, товщина поверхневої зони (зона I), яка

відіграє важливу роль у змащуванні та фрикційних характеристиках суглобового хряща (Naka et al., 2005) також була значно нижчою у FB-інтоксикованих щурів, що свідчить про те, що гідратація хрящової поверхні зменшилася в цій групі.

Неорганічна фаза кісток є домінуючим фактором, що визначає витривалість до кісткового перелому, тоді як пружна поведінка кістки також залежить від органічної фази кістки, головним чином колагенової матриці (Hayes and Gerhart, 1985). Доведено, що міцність сполучної тканини залежить від щільності та довжини як колагенових фібрил, так і волокон (Jonas et al. 1993; Kjaer 2004). Крім того, вміст тонких колагенових волокон надав додаткову структурну інформацію про вплив інтоксикації ФБ на синтез колагену (табл. 3). Більша кількість товстих колагенових волокон (червоного кольору) в зразках кістки може вказувати на зрілість синтезованого колагену, що зустрічається у кістках FB-інтоксикованих щурів (рис.

3) . Поява незрілого (зеленого кольору) колагену в препаратах кісток, що виявляли у контрольній групі, може вказувати на те, що процес кісткового обміну є більш інтенсивним і ріст не закінчувався, про що свідчать більш довгі кістки.

Висновки

губчастий щур кістка

1. Це дослідження було розроблено для оцінки гомеостазу кістки при експериментальній інтоксикації FB щурів. Досліджувані особливості включали багато параметрів, в даній публікації розглянули вплив FB на гомеостаз кісток, мікроструктуру її суглобів, та ростових пластин хрящів. Інформація, отримана в представленому дослідженні, може розширити знання про вплив фумонізинів на структуру та гомеостаз кісток.

2. Підсумовуючи проведену роботу, аналіз якої показує, що інтоксикація FB щурів, незважаючи на покращення даних трабекулярної гістоморфометрії, призводить до порушень кісткового гомеостазу і нами доведено, що фумонізини можуть впливати на проліферацію клітин у ростовій пластині та синтез протеогліканів у суглобовому хрящі.

Перспективи досліджень. Провести кісткову денситометрію стегнової кістки та комплексний аналіз остеометричних параметрів, оцінити кристалічні властивості мінеральної фази, визначити вміст її мікроелементів. Визначити матеріальний склад стегнової кістки та структурні організації як неорганічних, так і органічних її компонентів.

Размещено на Allbest.ru