Морфологические и иммуногистохимические особенности хрящевой ткани, используемой в восстановительной хирургии перфорацийбарабанной перепонки

Размещено на http://www.allbest.ru/

Морфологические и иммуногистохимические особенности хрящевой ткани, используемой в восстановительной хирургии перфорацийбарабанной перепонки

Хронический гнойный средний отит является одной из причин тугоухости, глухоты и внутричерепных осложнений, которые представляют собой важную социальноэкономическую медицинскую проблему. Частота заболеваемости хроническими гнойными формами средних отитов, по данным ряда авторов, составляет от 8,4 до 39,2 случаев на 1000 человек [8, 15, 19]. В большинстве случаев заключительным этапом хирургического лечения пациентов с хроническим средним отитом является мирингопластика. От эффективности восстановления целостности барабанной перепонки зависит функциональный и анатомический результат [9, 14, 22]. По данным многих авторов, рецидивы перфорации достигают от 10 до 30% случаев [1, 11, 25, 33, 36, 39]. Проблема выбора трансплантата для закрытия дефекта барабанной перепонки при хронических гнойных средних отитах остается актуальной по настоящее время [3, 5, 6, 17].

Выбор трансплантата зависит от множества факторов, одним из которых является размер перфорации. Как известно, на сегодняшний день в мире наиболее широко применяемыми трансплантатами для ми рингопластики являются фасция височной мышцы и хрящ из ушной раковины [12]. У каждого из этих трансплантатов есть свои положительные и отрицательные качества в функциональном и морфологическом аспектах. В публикациях последних лет большинство отечественных и зарубежных оториноларингологов приходят к выводу, что существенной разницы между фасцией и хрящевыми трансплантатами в функциональном плане не отмечается [2, 18, 26, 30, 32 35, 37]. Первостепенную важность играет приживаемость трансплантата. В литературе встречается мало научных исследований, в которых рассматриваются механизмы питания трансплантата. Считается, что питательные вещества, вода поступают к нему диффузно из тканей, на которых он расположен и которыми прикрыт. При тотальных и субтотальных перфорациях не всегда удается прикрыть трансплантат меатотимпа нальным лоскутом большой площади и оставшийся трансплантат находится между двумя воздушными пространствами наружного слухового прохода и барабанной полостью, что значительно затрудняет его питание [7,10,13].

Известно, что эластический хрящ ушной раковины состоит из округлых клеток (хондроцитов), не имеющих отростков, клетки располагаются в капсулах поодиночке или образуют изогенные группы из нескольких ядер, окруженных одной капсулой. Хондроциты можно подразделить по степени зрелости на молодые и зрелые. Молодые сохраняют черты строения хондробластов, они имеют продолговатую форму, развитую гранулярную эндоплазматическую сеть, крупный аппарат Гольджи, способны образовывать белки для коллагеновых и эластических волокон и сульфатиро ванные гликозаминогликаны, гликопротеины. Зрелые хондроциты имеют овальную или округлую форму, синтетический аппарат развит в меньшей степени по сравнению с молодыми хондроцитами. В цитоплазме происходит накопление гликогена и липидов. Хондроциты погружены в межклеточное вещество матрикс. Межклеточное вещество представлено эластическими волокнами (до

95%), пронизывающими его во всех направлениях, коллагеновыми волокнами, протеогликанами и интерстициальной водой. Эластические волокна построены из белка эластина, коллагеновые волокна (до 5%) состоят из коллагена II типа, расположены неупорядоченно. Протеогликаны, составляющие 510% от массы хряща, представлены сульфатированными гликозоами ногликанами, гликопротеинами, которые связывают воду и волокна. Протеогликаны хряща препятствуют его минерализации. Интерстициальная вода (6585%) обеспечивает несжимаемость хряща, является амортизатором. Вода способствует эффективному обмену веществ в хряще, переносит соли, питательные вещества, метаболиты.

Известно что, внешняя оболочка клетки является полупроницаемой мембраной. Поэтому мембраны клеток пропускают через себя определенные вещества растворители, а частицы растворенного вещества оставляют снаружи. Такой процесс называется осмотической реакцией через полупроницаемую мембрану. В 19 веке было замечено, что воду, как универсальный растворитель, клеточные мембраны пропускают через себя с большей скоростью, чем другие растворители. Еще в середине 20 века ученые понимали, что клетки не просто пропускают воду через свою мембрану из межклеточной среды. Вода в клетку поступает со стремительной скоростью. Механизм происходящего оставался неясен. В 2003 г. молекулярный биолог Питер Эгр (Peter Agre) и биохимик Родерик Мак Ки нон (Roderick Mac Kinnon) получили Нобелевскую премию в области химии за открытие системы особых протеинов аквапоринов (AQP) белков, регулирующих межклеточный транспорт воды в тканях. Эти специальные белковые каналы водопроводящие поры (от лат. aqua и греч. poros проход, отверстие) отвечают за «вход» и «выход» воды в клетках [16, 21].

Аквапорины обнаружены во всех клетках внутренних органов, крови и мозга. У млекопитающих они по своему строению и функциям разделяются на 13 групп, обозначаемых как AQP0, AQP1, AQP12 [16, 21, 28, 29, 4043]. Каждая клетка имеет свой набор аквапоринов, который определяется эволюцией органа и его функцией, но главная функция аквапоринов трансмембранный транспорт воды по осмотическому градиенту [16, 23, 28, 29, 38, 43]. Проницаемость клеточной мембраны для воды определяется числом аквапоринов в мембране [43]. Аквапорины могут, кроме воды, транспортировать аммиак и другие мелкие молекулы [16, 20]. В зависимости от водной селективности, субстратной специфичности и аминокислотного состава аквапорины делятся на 2 группы. В каждой из групп имеется максимальная схожесть аминокислотной последовательности [16, 21, 28, 29, 40, 41]. Аквапорины первой группы (собственно аквапорины) пропускают только воду. К этой группе относятся AQP0, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5, AQP6 и AQP8. Аквапорины AQP6 и AQP8 имеют очень схожий аминокислотный состав и поэтому отнесены в эту группу. AQP6 проницаем как для воды, так и для некоторых анионов, а при низких значениях pH (менее 5,5) может осуществлять транспорт хлоридов. Аквапорин AQP8 проницаем как для воды, так и для мочевины. Вторую группу аквапоринов составляют AQP3, AQP7, AQP9 и AQP10. Они называются акваглице ропоринами, так как проницаемы не только для воды, но и для глицерина и мочевины.

Важно отметить, что аквапорины играют важную роль в поддержании нормальной осмолярности цитоплазмы и принимают участие в увеличении размера и росте клеток растяжением, регулируя трансмембранный поток воды в клетку [31].

В научной литературе сведений о роли аквапоринов в питании трансплантатов при мирингопластике не найдено. Имеются данные об открытии AQP1 и AQP3 в хряще коленного сустава и хрящей позвоночника, хрящей верхних дыхательных путей [24, 27, 34]. Какихлибо других аквапоринов в хрящевой ткани достоверно не выявлено.

Мы изучили особенности питания трансплантата, используемого нами при мирингопластике. Для этой цели мы применили фрагментированный хрящевой трансплантат [4].

Материалы и методы

Хрящ козелка тупо выделялся из окружающей соединительной ткани. После забора хрящевая пластинка истончалась при помощи хрящетома до 0,5 мм. Затем между браншами зажимов Бильрот или Кохера в дистальном их отделе помещалась пластинка из набора хрящетома толщиной 0,2 мм, в проксимальном отделе находилась хрящевая пластинка. Таким образом, пластинка толщиной 0,2 мм являлась своеобразным ограничителем толщины раздавливания хряща. Хрящ раздавливался в поперечном и продольном направлениях с сохранением общей фрагментарной целостности до 0,20,3 мм. Полученный таким способом хрящевой трансплантат, состоящий из мелких фрагментов хряща, связанных между собой «тонкими нитями» получил название фрагментированного хрящевого трансплантата [4]. Правильно отмоделированный хрящ тонкий подвижный и легко сгибается в любых направлениях.

Для определения возможности втягивания жидкости в хрящевой трансплантат был проведен эксперимент.

Масса подготовленных для тимпанопластики фрагментированных хрящевых аутотрансплантатов, имеющую одинаковую площадь, с помощью электронных весов модели AS60|220|C|2NRADWG измерялась до и после погружения их в физиологический раствор. Было отмечено увеличение массы трансплантанта после смачивания его в физиологическом растворе. Данные эксперимента представлены в табл. 1 и на рис. 1.

отит хронический хрящевой

Таблица 1. Изменение массы фрагментированного хряща с одинаковой площадью и разной толщиной до и после смачивания в физиологическом растворе

Статистическая обработка проводилась с использованием пакета Statistica 8.0, лицензия №STA82D175437Q. Выявлена высокая теснота связи между толщиной трансплантата и массой трансплантата до (rs=0,87) и после (rs=0,87) смачивания. Анализ проводился непараметрическим методом Spearman rs при выбранном уровне статистической значимости p<0,05.

При касании фрагментированным хрящом поверхности крови или какойлибо другой контрастной жидкости отмечался подъем уровня этой жидкости по хрящу.

Данное явление в природе называется капиллярным эффектом. Нефрагментированные хрящевые пластинки таким свойством не обладали. Фрагментированный хрящ приобретает это свойство, так как после

раздавливания его структура становится пористой. Он способен не только втягивать в себя окружающую жидкость, но и удерживать ее. Площадь контакта хряща с жидкостью увеличивается за счет пор, возникающих после его фрагментации. Данное явление улучшения доставки и удержания питательной среды хрящом после его фрагментации обусловлено капиллярным эффектом.

Были проведены морфологические и иммуногистохимические исследования, целью которых являлся анализ поступления воды в свободно лежащий трансплантат.

Всего для проведения патогистологического исследования было отобрано 30 случаев, разделенных на 3 группы: нативный хрящ, раздавленный (фрагментированный) и гидратированный физиологическим раствором раздавленный хрящ. Гистологический материал составил 90 образцов ткани. Для оценки морфологических характеристик хрящей из всех кусочков были изготовлены гистологические препараты. Для этого исследуемый материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 часов. Гистологическую проводку материала осуществляли в автоматическом режиме с использованием гистопроцессора карусельного типа Leica TP 1020 по стандартной методике (спиртыксилол

парафиновая среда). Адекватность фиксации и проводки материала являлась важнейшим фактором получения достоверного результата дальнейшего иммуногистохимического исследования. Материал заливали в парафиновую среду для микротомирования. Из парафиновых блоков делали срезы толщиной 3 мкн, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Затем материал подвергали световой микроскопии.

Для выявления локализации эндогенных водных каналов в хряще ушной раковины и выявления роли и транспортной функции аквапоринов также было проведено иммуногистохимическое исследование с антителами к аквапоринам (AQP 1, AQP 3 и AQP 8). С помощью предварительной отработки методики окрашивания нами были выбраны следующие концентрации для каждого антигена (табл. 2).

Окрашено 288 образцов ткани с учетом отработки методики. Во всех случаях были получены качественные и достоверные результаты иммуногистохимического исследования. В качестве хромогена применялся

DAB 3диаминобензидин тетрахлорид (Thermo). В качестве внешнего контроля проведения иммуногистохимической реакции были использованы парафиновые блоки тканей, рекомендованных производителем для используемых первичных антител. Окрашенные препараты исследовались в проходящем свете с помощью микроскопа LeicaDM 2500, микрофотосъемка проводилась c увеличением х400 микрофотокамерой Leica DFC 425. Позитивное окрашивание оценивалось полуколичественно по его локализации в целлюлярных структурах, распространенности и интенсивности. Критерии бальной оценки степени интенсивности окрашивания: 0 баллов негативное окрашивание, 1 балл слабая интенсивность, 2 балла умеренная интенсивность, 3 балла сильная интенсивность.

Результаты

Проведен гистологический анализ материала. При световой микроскопии образцов группы нераздавленных хрящей (НХ) выявляли четкие границы хондроцитов и изогенных групп с узкими межклеточными пространствами с выраженной эозинофилией основного вещества. В ядрах хондроци тов визуализируются четкие довольно крупные ядрышки. В части полей зрения клетки имеют зубчатый «географический» контур (рис. 2).

В группе раздавленных хрящей (РХ) изменялся как размер и контур самих хонд роцитов и изогенных групп, так и объем и восприятие красителей основным веществом межклеточного матрикса. Клетки частично лишаются части цитоплазмы, сохранившиеся набухают, перинуклеарно появ

ляется кольцевидная конденсация цитоплазмы. Цитоплазма со склонностью к базофилии. Ядра в большинстве хондроци тов не прослеживаются. В этих же полях зрения отмечается визуальная интеграция межклеточного вещества и цитоплазматического содержимого (рис. 3).

В группе гидратированных раздавленных хрящей (ГРХ) четко прослеживается уменьшение размеров хондроцитов, анизоцитоз и анизонуклеоз в сравнении с НХ и РХ. Контур клеток размыт, в части полей зрения клетки совершенно не имеют границ и «анастомозируют» друг с другом. Пространства между единичными сохранными клетками заполнены обильным неравномерной плотности базофиль ным основным веществом с «обломками» менее базофильной цитоплазмы разрушенных хондроцитов (рис. 4).

Следует отметить, что после раздавливания хряща площадь межклеточного пространства увеличивается с одновременным уменьшением количества неповрежденных клеток, что способствует улучшению условий питания последних.

При оценке локализации и выраженности экспрессии AQP 1 в группе НХ, РХ и ГРХ отмечена экспрессия в хондроцитах, в перинуклеарной и перинуклеолярной зонах в виде тонких бледных колец (рис. 5 А). При раздавливании хряща диаминбензидин ярко и широко прокрашивает те же зоны, что и в нативном хряще (рис. 5 Б и В).

Иммуногистохимическое исследование позволило установить тканевую, клеточную и субклеточную локализацию аква поринов, а также уровень экспрессии водных каналов в нативном и поврежденном хряще до и после гидратации. Во всех исследованных группах локализация аквапо ринов характеризовалась стабильностью для клеточных структур: AQP1 и AQP8 экспрессировались в межклеточных пространствах и хондроцитах. Наличие антигенов аквапоринов определялось в виде мембранной, нуклеарной и цитоплазматической локализации в описанных целлюлярных структурах в виде глыбок, пластинок и мелкоточечных точечных композитов.

Выводы

отит хронический хрящевой

1. Фрагментированный хрящевой трансплантат имеет большие возможности получения питания за счет диффузии по сравнению с нативным хрящем по причине появления «капиллярного эффекта».

2. Установлено, что повреждение хряща активирует водные каналы, что проявляется увеличением экспрессии аквапо ринов во фрагментированном хряще.

3. Впервые определена локализация аквапорина AQP8 в хрящевой ткани ушной раковины.

Литература

1.Борисова КЗ. Причины неудач тимпанопластики и профилактика осложнений. Материалы Российской научнопрактич. конф. оториноларингологов «Проблемы и возможности микрохирургии уха». 2002; 446..

2.Бороноев ОА, Рябов МП, Бороноев БА. Сравнительная оценка результатов тимпанопластики с использованием различных трансплантатов при хроническом гнойном среднем отите. Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2009;(3):358.

3.Вишняков ВВ. Результаты тимпанопластики при хроническом гнойном среднем отите и его последствиях. Матер. 16 съезда оториноларингологов РФ. 2001; 5962.

4.Горностай ИИ, Петрова ЛГ, Михасев ГИ, Шилько СВ, Гавриленко СЛ. Результаты использования фрагментированного хрящевого трансплантата для восстановления целостности барабанной перепонки. Оторинолар. Вост. Евр. 2019; 9(1): 3342.

5.Дискаленко ВВ, Курмашова ЛМ. Повышение эффективности тимпанопластики при обширных дефектах. Вестн. оториноларингол. 2008; (4): 5456.

6.Кротов ЮА. Мирингопластика при обширных перфорациях барабанной перепонки. Вестн. оторинола рингол. 2001; (5): 5759.

7.Кротов ЮА. Способ мирингопластики при обшир

ных перфорациях барабанной перепонки. Матер. 17го съезда оториноларингологов РФ. Санкт-Петербург; 2006: 1112.

8.Миронов АА. Проблемы диагностики и лечения хронического гнойного среднего отита. Материалы Российской научнопрактической конференции оториноларингологов «Современные проблемы заболеваний верхних дыхательных путей и уха»; Москва; 2002; 979.

Размещено на Allbest.ru