Вплив антибіотикотерапії на загальну кількість оксалатдеградувальної мікробіоти у кишковому тракті щурів

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Останнім часом дослідники всього світу звертають увагу, що наслідки порушення мікробіоценозу шлунково-кишкового тракту не обмежуються кишечником. Одним з органів мішеней за такої патології є нирки [3]. Розглядається патогенетичний механізм розвитку кишкових патологій та хронічних захворювань нирок, наприклад, зміни кишкової мікробіоти, модуляції імунної та запальної відповіді вітаміном Д та інші механізми [11]. Особлива увага приділяється найбільш частому нирковому ускладненню при захворюваннях кишечника сечокам'яній хворобі. Показано, що за запальних захворювань кишечника ризик розвитку сечокам'яної хвороби зростає в 10-100 разів [7]. Відомо, що найчастіше за кишкової патології формуються оксалатні та уратні конкременти.

Щавелева кислота здатна зв'язуватись з різними катіонами (такими як натрій, магній, калій, кальцій) та утворювати оксалатні солі. Надлишок оксалатів виводиться переважно нирками і частково через травний тракт. Всмоктування оксалатів відбувається по всьому шлунково-кишковому тракту. В товстій кишці вони можуть як абсорбуватися, так і секретуватися. Проте, провідна роль відводиться тонкій кишці, де всмоктується 2-18% всього екзогенного оксалату [2].

Альтернативний шлях регуляції метаболізму оксалату полягає в його деградації за рахунок бактерій представників кишкової нормобіоти (Oxalobacterformigenes, Lactobacillus, Bifidobacteriumта ін.). Ці бактерії зменшують абсорбцію дієтичного оксалату і тим самим знижують ризик розвитку гіпероксалурії, і як наслідок утворення кальцій-оксалатних конкрементів [14]. Показано, що окрім безпосереднього використання оксалатів O. formigenesзбільшує кишкову секрецію та зменшує реадсорбцію оксалатів шляхом впливу на Cl-оксалатний обмінник (SLC26A6), який розташований на клітинах кишкового епітелію [8]. Встановлено, що колонізація товстої кишки O. formigenesбільш ніж втричі зменшує концентрацію оксалатів в плазмі крові та достовірно знижує ризик утворення оксалатних каменів. Проте, нез'ясованим залишається яким чином відбувається заселення кишечника O. formigenes, які фактори, крім дієтичного вживання оксалатів, впливають на його популяцію, як змінюється заселення кишечника за різних кишкових патологій [12].

На даний час недостатньо вивченим є вплив антибіотичних препаратів та інших факторів, що змінюють біоценоз кишечника на розвиток оксалатного уротіліазу. Висловлюється припущення, що менша заселеність O. formigenes дорослого населення України порівняно з дитячою віковою категорією пов'язана саме з частим та неконтрольованим використанням антибіотиків дорослими. Також дослідники наголошують на тому, що у людей, які приймали антибіотики реєструється менша частота виявлення O. formigenes і більша частота розвитку нефролітіазу.

Останні дослідження показують вплив антибіотиків на кількісні показники O. formigenesу шлунково-кишковому тракті дослідних тварин. Виявлена його чутливість до хінолонів, макролідів, тетрациклінів і метронідазолу [13]. Проте, інформації про вплив антибіотикотерапії на загальний рівень оксалатдеградувальних бактерій немає.

Тому, метою даного дослідження було вивчити зміни загальної кількості оксалатдеградувальних бактерій за модельованого дисбіозу у щурів.

Матеріали і методи

Об'єктом дослідження була оксалатдеградувальна мікробіота фекального та пристінкового біоптатів товстої та тонкої кишок щурів самців лінії Wistar (розведення віварію Національного медичного університету ім. А. А. Богомольця) (маса 170-200 г, n=7). Тварин утримували в стандартних умовах віварію ННЦ «Інститут біології та медицини», на стандартному раціоні харчування з вільним доступом до води. Тварини були поділені дві групи. В дослідній групі тварин (n=4) дисбіотичні зміни моделювали шляхом сумісного внутрішньом'язового (в/м) введення ампіциліну (ПАТ «Київмедпрепарат», Україна) у дозі 75 мг/кг та метронідазолу (ТОВ «Фармацевтична фірма «Здоров'я», Україна) у дозі 50 мг/кг, які вводили перорально у вигляді коктейлю 1 раз на добу впродовж 3 днів [10]. Контрольній группі тварин (n=3) вводили в/м 0,1 мл води для ін'єкцій. Початком експерименту вважався перший день введення антимікробних препаратів або води для ін'єкцій (для контрольної групи). Мікробіоту фекального біоптату досліджували наступного дня після відміни введення антибіотиків (4-й день експерименту), а також на 18-й, 29-й та 59-й день від початку експерименту. Пристінкову мікробіоту товстої та тонкої кишок досліджували на 59-й день при виведенні тварин з експерименту. Тварин виводили з експерименту шляхом цервікальної дислокації.

Для мікробіологічного аналізу було відібрано 1 г фекалій та ділянки слизової оболонки 1 см2 товстої кишки на відстані 2 см від анального отвору та 1 см2 тонкої кишки на відстані 2 см від ілеоцекального клапану, які тричі промивали від хімусу у фізіологічному розчині після чого гомогенізували у гомогенізаторі Поттера. З отриманих зразків робили 10-кратні розведення у фізіологічному розчині і висівали на відповідні елективні середовища.

Для визначення кількості представників роду Lactobacillusта Bifidobacterium використовували комерційні елективні середовища Lactobacillus MRS Agarта Bifidobacterium Agar виробництва Hi Media Laboratories Pvt. Ltd., Індія. Кількість оксалатдеградувальних бактерій визначали на високо селективному середовищі Oxalate Medium(г/л): K2HPO40,25, KH2PO40,25, (NH4)2SO4 0,5, MgSO4 7H2O 0,025, CH3COONa 0,82, дріжджовий екстракт 1,0, резазурин 0,001, Na2CO3 4, L-цистеїн-НСІ 0,5 та Na2C2O4 5 г. Розчин мікроелементів (Traceelementsolution) 1 мл з наступним складом на л: HCl (25%; 7,7 M) 10,00 мл, FeCl2х 4Н20 1,50 г, ZnCl270,00 мг, MnCl2х 4H2O 100,00 мг, H3BO36.00 мг, CoCl2х 6H2O 190,00 мг, CuCl2х 2H2O 2,00 мг, NiCl2х 6H2O 24,00 мг, Na2MoO4х 2H2O 36,00 мг [6]. Посіви здійснювали глибинним шляхом. Культивування проводили за анаеробних умов в анаеростатах з використанням газогенеруючих пакетів (BioMerieux, Франція) при 37 °С, 5 діб. Враховували колонії, що виросли на дні/товщі чашки. Результати представлені у вигляді M±m lg КУО/г (см2).

Стійкість біфідо та лактобактерій, виділених від щурів до ампіциліну та метронідазолу визначали диско-дифузійним методом на Lactobacillus MRS Agarта Bifidobacterium Agar (Hi Media Laboratories Pvt. Ltd., Індія), використовуючи комерційні диски (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Індія). З добової культури бактерій готували бактеріальну суспензію у фізіологічному розчині за стандартом мутності МакФарланда 2 до концентрації 1,5х108 клітин/мл. Отриману суспензію (0,1 мл) засівали газоном на поверхню середовища й за допомогою стерильного пінцета розкладали диски з антибіотиками.

Статистичну обробку результатів дослідження проводили за допомогою програм «Statistica 6.0» з урахуванням перевірки показників на нормальний розподіл за тестом Колмогорова-Смірнова. Для порівняння вибірок підраховували середнє арифметичне та середнє статистичне відхилення. Достовірність різниці між порівнюваними групами оцінювали за допомогою t критерію Стьюдента. Статистично значущою для всіх показників вважали різницю Р<0,05.

Результати та обговорення

В попередніх дослідженнях нами було показано, що 100% висівання оксалатдеградувальних бактерій (ОДБ) відмічається лише у щурів лінії Wistar [1], тому саме ця лінія була відібрана для дослідження змін мікробіоти шлунково-кишкового тракту за модельованого дисбіозу.

Для дослідження загальної кількості ОДБ у фекальному біоптаті проводили забір фекалій в 4-х точках впродовж 59 діб. Важливо зауважити, що у шурів контрольної групи в 3-х перших точках кількість ОДБ була стабільною і дорівнювала: на 4-у добу експерименту 6,75±0,20 КУО/г; на 18-у 6,52±0,39 КУО/г; та на 29-у 6,61±0,10 КУО/г. Проте, на 59-й день експерименту спостерігалося підвищення на 1 порядок кількості ОДБ до 7,80±0,45 КУО/г) (рис.1), але це збільшення не досягало статистично вірогідної різниці і скоріше за все могло бути пов'язано зі зміною раціону харчування тварин. В попередніх дослідженнях нами було показано індивідуальний характер між кількістю оксалатдеградувальних бактерій та раціону харчування. Середні показники вмісту оксалатдеградувальних бактерій достовірно зростали при щоденному підвищеному вмісті №2С204 (2 мг/кг) у раціоні харчування тварин [1].

При дослідженні впливу антимікробної композиції метронідазолу з ампіциліном на загальну кількість ОДБ у фекальному біоптаті, було продемонстровано поступове їх зниження в порівнянні з показниками в контрольній групі.

Так, на 4-й та 18-й дні від початку введення антимікробних препаратів відмічали лише тенденцію до зниження кількості ОДБ у фекальному біоптаті. На 29-ий день експерименту кількість ОДБ у дослідній групі знизилася на 2 порядки в порівнянні з показниками в контрольній групі і становила 4,37±0,80 КУО/г (Р<0,05). На 59-й день кількість ОДБ у дослідній групі становила 6,03±0,18 КУО/г, що на 1,8 порядку була нижчою за показники у відповідній контрольній групі (Р<0,05) (рис.1).

Рис. 1. Кількість оксалатдеградувальних бактерій у фекальному біоптаті щурів (n=7) в різні терміни після введення комбінації антибіотиків ампіциліну (75 мг/кг) та метронідазолу (50 мг/кг), lg (М±m) КУО/г, *Р<0,05 Fig. 1. Quantity of oxalate-degrading bacteria in the fecal biotope of rats (n=7) at different time points after administration of the combination of antibiotics ampicillin (75 mg/kg) and metrоnidazole (50 mg/kg), lg (М±m) CFU/g, *Р <0,05

Відомо, що у просвітному біоптаті найбільша кількість ОДБ виявляється у товстій кишці. Проте на даний момент відсутні відомості про кількісні значення ОДБ у пристінковому біоптаті товстої та тонкої кишок.

Достовірне зниження кількості ОДБ реєстрували у пристінковому біоптаті товстої кишки на 59-й день експерименту. У дослідній групі, кількість ОДБ становила 5,13±0,05 КУО/см2, тоді як в контрольній групі 7,05±0,35 КУО/см2. Проте у пристінковому біоптаті тонкої кишки кількість ОДБ була в межах контрольних значень, зокрема 7,34±0,04 КУО/см2 в контролі та 7,22±0,34 КУО/см2 в дослідній групі (рис. 2).

Рис. 2. Кількість оксалатдеградувальних бактерій у пристінковому біоптаті кишечника щурів (n=7) на 59-й день після відміни комбінації антибіотиків ампіциліну (75 мг/кг) та метронідазолу (50 мг/кг), lg (М±m) КУО/см2, *Р<0,05 Fig. 2. Quantity of oxalate-degrading bacteria in the mucosa-associated biotope of rats (n=7) on the 59-th day after administration of the combination of antibiotics ampicillin (75 mg/kg) and metrоnidazole (50 mg/kg), lg (M ± m) CFU/cm2, *Р <0,05

оксалатдеградувальний мікробіоценоз ампіцилін

З літературних джерел відомо, що навіть короткотривале застосування антибіотиків призводить до виражених змін мікробіоти шлунково-кишкового тракту і має довготривалі наслідки [9], нами вперше встановлено тривалі зміни у складі ОДБ після антибіотикотерапії.

Анаеробним цукролітичним бактеріям родів Bifidobacterium та Lactobacillusвідводиться одна з провідних ролей у здатності до деградації оксалату [14]. Нами показано, що кількість бактерій родів Bifidobacterium та Lactobacillusпісля сумісного введення ампіциліну та метронідозолу залишалася в межах контрольних значень у всіх досліджуваних біотопах та періодах (табл. 1, 2).

Таблиця 1. Кількісні показники ±mlg КУО/г) Bifidobacteriumта Lactobacillusу фекальному біотопі контрольних (n=3) та дослідних (n=4) щурів після сумісного введення ампіциліну з метранідазолом

Таблиця 2. Кількісні показники ±mlg КУО/см2) Bifidobacteriumта Lactobacillusу пристінковому біоптатах товстої та тонкої кишки щурів (n=7) після сумісного введення ампіциліну з метранідазолом

При дослідженні стійкості виділених лакто та біфідобактерій до ампіциліну та метронідазолу було виявлено, що дані бактерії стійкі до відповідних антибіотиків.

Можна припустити, що загальна кількість лактота біфідобактерій залишається в нормі впродовж всього часу експерименту саме за рахунок їх стійкості до використаних антибіотиків. В той час, як загальна кількість ОДБ (до яких відносяться не лише Lactobacillus, Bifidobacteriumта Oxalobacterformigenes, а також Enterococcus, Streptococcus, Providenciarettgeri, Eubacteriumlentum та ін. [5]) знижується впродовж експерименту. З іншого боку, ми визначали загальну кількість лактоі біфідобактерій без видової приналежності на середовищах MRSAgarта BifidobacteriumAgar, відповідно ми не можемо виключити зменшення кількості тих видів і штамів лактоі біфідобактерій, які здатні метаболізувати оксалат. Що підтверджується даними інших авторів [15], які показали різницю у рівні метаболічної активності по відношенню до оксалату серед різних штамів Lactobacillusта Bifidobacterium.

При застосуванні комбінації антибіотичних препаратів ампіциліну та метронідазолу відбувається зменшення у кількісному складі ОДБ фекального біоптату, які набувають більш виразних змін у віддалені терміни зокрема на 29-й та 59-й дні експерименту і торкаються також пристінкового біоптату товстої кишки. При цьому загальна кількість лактоі біфідобактерій залишається в межах контрольних показників.

Отже, отримані нами експериментальні дані свідчать про довготривалі зсуви у кількості ОДБ після антибіотикотерапії, що може мати клінічно-релеванті наслідки, зокрема розвиток гіпероксалурії з наступним утворенням оксалатних конкрементів.

Література

1. Акуленко І. Залежність кількісного вмісту оксалатдеградувальних бактерій у фекальному біоптаті щурів від кількості оксалатів у раціоні харчування / І. Акуленко, В. Стецька, Т. Сергійчук, Г Толстанова, Н. Степанова // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Біологія. 2018. 1(75). С. 55-58.

2. Деркач И. А. Значение кишечника в развитии уролитиаза / И. А. Деркач // «Новости медицины и фармации» гастроэнтерология. 2015. 527. С. 33-37.

3. Дорофеев А. Э. Заболевание кишечника и почки / А. Э. Дорофеев, Н. Н. Руденко, И. А. Деркач, Ю. В. Чечула // Гастроэнтерология. 2015. 3(57). С. 101-105.

4. Сергійчук М. Г.Цитологія мікроорганізмів методичні рекомендації до спецпрактикуму / М. Г. Сергійчук, Т. М. Фурзікова, О. С. Радченко, Л. Г. Степура // К. Фітосоціоцентр. 2000.

5. Abratt V. R. Oxalate-Degrading Bacteria of the Human Gut as Probiotics in the Management of Kidney Stone Disease / Abratt VR, Reid S.J. // Advances in Applied Microbiology. 2010. 72. P. 63-87.

6. Atlas R. M. Handbook of microbiological media 4th edition / R.M. Atlas // editor: Taylor and Francis Group, LLC. 2010. P 1333-1334.

7. Cirillo M. Nephrolithiasis in patients with intestinal diseases / M. Cirillo, M. Iudici, F. Marcarelli, M. Laudato, F. Zincone // Italian Nefrology. 2008. 25(1). P. 42-8.

8. Hatch M. Oxalobacter sp. reduces urinary oxalate excretion by promoting enteric oxalate secretion / M. Hatch, J. Cornelius, M. Allison, H. Sidhu, A. Peck, R.W. Freel // Kidney International 2006. 69. Р 691-698.

9. Jakobsson H. E. Short-Term Antibiotic Treatment Has Differing LongTerm Impacts on the Human Throat and Gut Microbiome / H. E. Jakobsson, C. Jernberg, A. F. Andersson, M. Sjolund-Karlsson, J.K. Jansson, L. Engstrand // PLoS One. 2010. 5(3). e9836.

10. Ermolenko E, Ggromova L, Borscev Y, Voeikova A, Karaseva A, Ermolenko K, Gruzdkov A, Suvorov A. Influence of Different Probiotic Lactic Acid Bacteria on Microbiota and Metabolism of Rats with Dysbiosis. Bioscience ofMicrobiota, Food Health. 2013;32(2);41-49.

11. Kiryluk K. Discovery of new risk loci for IgA nephropathy implicates genes involved in immunity against intestinal pathogens / K. Kiryluk, Y. Li, Scolari et al. // Nature Genetics. 2014. 46(11). P 1187-96.

12. Knight J. The genetic composition of Oxalobacter formigenes and its relationship to colonization and calcium oxalate stone disease / J. Knight, R. Deora, G. Assimos, R.P. Holmes // Urolithiasis. 2013. 41(3). P 187-196.

13. Lange J. N. Sensitivity of human strains of Oxalobacter formigenes to commonly prescribed antibiotics / Lange J. N., K. D. Wood, H. Wong, R. Otto, P W. Mufarrij, J. Knight, H. Akpinar, R. P Holmes, D. G. Assimos // Urology. 2012. 79(6). P 1286-1289.

14. Miller A. W. The Gastrointestinal Tract of the White-Throated Woodrat (Neotoma albigula) Harbors Distinct Consortia of Oxalate-Degrading Bacteria / W. Miller, K.D. Kohl, M.D. Dearing // Applied and environmental microbiology. 2014. 80(5). P. 1595-1601.

15. Mogna L. Screening of Different Probiotic Strains for Their In Vitro Ability to Metabolise Oxalates Any Prospective Use in Humans? / L. Mogna, M. Pane, S. Nicola, E. Raiteri // Journal of Clinical Gastroenterology. 2014. 48(1). P 91-95.

Размещено на Allbest.ru