Сканирующая электронная микроскопия эритроцитов, модифицированных антибактериальными препаратами различных классов

Размещено на http://www.allbest.ru/

СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ЭРИТРОЦИТОВ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ

Е.С. Баева, В.Г. Артюхов

Воронежский государственный университет, г. Воронеж, Россия, galaxy1985@mail.ru

Антибактериальные препараты, применяемые в терапии воспалительных процессов, обладают рядом лечебных и побочных эффектов [2,3,4,6,7]. Проникая в ткани и среды макроорганизма, они нарушают фагоцитарную активность макрофагов, агрегационные свойства тромбоцитов, изменяют осмотическую резистентность и микрореологические свойства эритроцитов [1,5]. Это особенно важно учитывать в терапии заболеваний, вызванных внутриклеточными патогенами, такими, как Mycoplasma spp. [8,9]. В этой связи представляло интерес исследовать влияние антибиотиков на морфофункциональное состояние красных клеток крови.

Методика исследования. Поверхностную архитектонику эритроцитов крови доноров изучали методом сканирующей электронной микроскопии. В качестве модифицирующих агентов мы использовали коммерческие препараты антибиотиков, применяемых для лечения микоплазменной инфекции: 1) класс макролиды: азитромицин (Сумамед, Хорватия) - 1,34*10^-4 моль/л, 1,34*10^-5 моль/л, рокситромицин (Roxithromycin 90%, Sigma) - 7,2*10^-5 моль/л, 7,2*10^-6 моль/л, кларитромицин - 1,33*10^-4 моль/л, 1,33*10^-5 моль/л (Клацид, Abbott S.p.A), джозамицин - 1,21*10^-4 моль/л, 1,21*10^-5 моль/л (Josamycin, Sigma-Aldrich); 2) класс тетрациклины: доксициклин - 7,8*10^-5 моль/л, 7,8*10^-6 моль/л (Doxycycline hyclate 98% (TLC), Sigma-Aldrich); 3) класс линкозамиды: клиндамицин - 1,4*10^-4 моль/л, 1,4*10^-5 моль/л (Clindamycin, Sigma); 4) класс фторхинолоны: ципрофлоксацин - 1,21*10^-4 моль/л, 1,21*10^-5 моль/л (Ciprofloxacin, ?98.0% (HPLC) Sigma-Aldrich), офлоксацин - 1,1*10^-4 моль/л, 1,1*10^-5 моль/л (Ofloxacin, Sigma-Aldrich), спарфлоксацин - 1,02*10^-4 моль/л, 1,02*10^-5 моль/л (Sparfloxacin 98% (HPLC) Sigmа). Эритроциты предварительно инкубировали в течение 1 ч с антибактериальными препаратами. Затем контрольные и опытные образцы фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида при температуре 4⁰С в течение 1 ч. Производили обезвоживание клеток путем центрифугирования в серии водных растворов этанола восходящей концентрации 30%, 50%, 70%, 90% и далее ацетоном. Приготовленную суспензию наносили на алюминиевые подложки и высушивали в термостате при 37⁰С. Для обеспечения электропроводности объектов их напыляли тонкой плёнкой золота. Препараты просматривали на сканирующем электронном микроскопе JSM - 6380 LU (Япония) при ускоряющем напряжении 20-25 кВ.

Структурно-функциональную характеристику мембран эритроцитов оценивали по классификации, предложенной Козинец Г.И. (1977г.) и соавторами. Для детального анализа характера изменения поверхностной архитектоники эритроцитов рассчитывали ряд индексов: 1) ИТ - индекс трансформации - количественная оценка соотношения патологических и нормальных форм эритроцитов (В. Н. Кидалов, К. К. Зайцева 1986): ИТ=(ОД%+НД%)/Д%, где Д% - процент дискоцитов, ОД% - процент обратимо деформированных эритроцитов, НД% - процент необратимо деформированных эритроцитов; 2) ИОТ - индекс обратимой трансформации (Назаров С.Б., 1995): ИОТ=%ОД/%Д; 3) ИНОТ - индекс необратимой трансформации: ИНОТ=%НД/%Д.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием параметрических критериев и стандартных пакетов Microsoft Excel. Подсчет клеток производился в процентах на 300 клеток.

Результаты и их обсуждение. В норме большинство эритроцитов представлены дискоцитами (до 97%). Исследование рельефа поверхности эритроцитов, модифицированных антибактериальными препаратами, методом сканирующей электронной микроскопии показало дозозависимое снижение количества двояковогнутых дискоцитов (в среднем на 3-5%) и увеличение доли обратимо- и необратимо деформированных эритроцитов относительно контроля (табл.1, 2):

Таблица 1. Цитоархитектоника эритроцитов крови доноров, модифицированных антибиотиками в терапевтической концентрации (p<0,05)

Здесь, и в табл. 2: АМ - азитромицин, РМ - рокситромицин, КМ - кларитромицин, ДМ - джозамицин, ДЦ - доксициклин, КЦ - клиндамицин, ЦФ - ципрофлоксацин, ОФ - офлоксацин, СФ - спарфлоксацин.

Таблица 2. Цитоархитектоника эритроцитов крови доноров, модифицированных антибиотиками в концентрации, на порядок ниже терапевтической (p<0,05).

Антибиотики в исследуемых концентрациях приводили к повышению ИТ клеток, снижая ИОТ и повышая ИНОТ. Наиболее выраженные изменения показателей цитоархитектоники эритроцитов индуцировал доксициклин в терапевтической концентрации, что указывает на низкий уровень барьера стерических ограничений: снизилось количество дискоцитов на ?63% (p<0,05), уменьшилось количество обратимых форм на 5,5% (p<0,05), ИОТ на 85% (p<0,05), увеличилось количество необратимых форм на ?70% (p<0,05). Выявлено значительное повышение ИТ и ИНОТ, при этом с ростом концентрации доксициклина умеренный стомацитоз перерастал в выраженный; наблюдали появление клеток с двумя-тремя углублениями на поверхности, в то время как эхиноциты имели тенденцию к исчезновению (рис.1):

Рис. 1. Поверхностная цитоархитектоника эритроцитов, модифицированных доксициклином

Аналогичные морфологические изменения эритроцитов наблюдались при модификации клеток азитромицином и, в меньшей степени, кларитромицином, вызывающими снижение количества дискоцитов на 15 и 12% соответственно в терапевтической концентрации.

Таким образом, исследованные антибактериальные препараты вызывают гетерогенные изменения поверхностной архитектоники в популяции эритроцитов. Появление под действием антибиотиков большего количества необратимо деформированных форм клеток, снижение количества дискоцитов указывает на нарушение эластичности мембран, а, следовательно, и способности эритроцитов к упругой деформации в микроциркуляторном русле.

антибактериальный лечебный болезнь кровь

Литература

1. Баева Е.С. Исследование осмотической и кислотной резистентности эритроцитов, модифицированных антибактериальными препаратами различных классов / Е.С. Баева, В.Г. Артюхов // Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы. - Казань, 2012. - С. 12-13.

2. Белозёров Е.С. Медикаментозные осложнения: 1-е изд. / Е.С. Белозеров, Е.И. Змушко. - СПб: Изд-во Питер, 2001. - 448 с.

3. Васильев В. Ю. Выявление скрытых повреждений эритроцитарных мембран при фармакологических воздействиях / В.Ю. Васильев и др. // Общая реаниматология. - 2007. - №4. - С. 102-105.

4. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учебник. 6-е изд., перераб. и доп. / Н. С. Егоров. - М.: Изд-во МГУ; Наука, 2004. - 528 с.

5. Калашникова И. В. Механизмы взаимодействия антибиотиков пенициллинового ряда с эритроцитами человека / И. В. Калашникова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 146, № 10. - С. 419-423.

6. Киричук В.Ф. Оценка течения инфекционного процесса по проницаемости эритроцитарных мембран / В.Ф. Киричук, О.И. Кулапина, И.А. Утц // Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - №3. - С. 33-36.

7. Станковская И.М. Побочное действие противомикробных лекарственных средств. М., 1991.

8. Херувимова Е.С. Изучение уровня чувствительности урогенитальных микоплазм к действию антибактериальных препаратов различной природы / Е.С. Херувимова, В.Г. Артюхов, С. Г. Резван // Вестн. Воронеж. ун-та. Сер. Химия. Биология. Фармация. - 2010. - №2. - С. 115-119.

9. Яковлев С.В. Клиническая химиотерапия бактериальных инфекций. М., 1997.

Размещено на Allbest.ru