Актуальность определения производных барбитуровой кислоты при химико-токсикологическом анализе на примере циклобарбитала

Размещено на http://www.allbest.ru/

Актуальность определения производных барбитуровой кислоты при химико-токсикологическом анализе на примере циклобарбитала

Петрова О.С. Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого; Матвеева Л.В., Сухова Н.А. Новгородское бюро судебно-медицинской экспертизы

Аннотация

Сохраняется актуальность химико-токсикологического анализа на производные барбитуровой кислоты, так как отравления ими встречаются нередко, и в смеси с другими токсикологически важными препаратами [4], [5], [6]. Основу экспертной оценки отравления производными барбитуровой кислоты составляет качественное определение препарата в организме человека с учетом обстоятельств дела и клинической картины отравления, однако имеется возможность количественной оценки обнаруженных препаратов и их метаболитов. С целью улучшения диагностики отравления производными барбитуровой кислоты составлена и оптимизирована четкая схема химико-токсикологического анализа при судебно-химических экспертных исследованиях биообъектов.

Ключевые слова: производные барбитуровой кислоты, химико-токсикологический анализ.

Abstract

The relevance of the chemical and toxicological analysis for derivatives of barbituric acid are due to common poisoning with these substances and in a mixture with other toxicologically important drugs [4], [5], [6]. The basis of the expert assessment of poisoning with derivatives of barbituric acid is a qualitative determination of the drug in the human body, considering the circumstances of the case and the clinical picture of poisoning; however, it is possible to quantify the detected drugs and their metabolites. A transparent scheme of chemical-toxicological analysis was compiled and optimized in forensic chemical expert studies of biological objects to improve the diagnosis of poisoning with derivatives of barbituric acid.

Keywords: derivatives of barbituric acid, chemical, and toxicological analysis.

С каждым годом расширяется ассортимент веществ, используемых молодыми людьми с целью воздействия на центральную нервную систему. Среди наркотических веществ, употребляемых наркоманами, наиболее часто используются синтетические аналоги опиатов и курительные смеси на основе синтетических каннабиноидов, часто в комбинации с этанолом. Первый способ лечения наркомании, который приходит в голову самому наркоману - облегчение абстиненции с помощью различных лекарственных средств [3]. Самым подходящими с их точки зрения являются снотворные средства, которые они готовы употреблять в количествах, превышающих высшую суточную дозу. Примером комбинированного снотворного препарата является реладорм - таблетки, содержащие циклобарбитал и диазепам - способен сформировать настоящую зависимость [4]. Кроме того, он при массивном использовании, а именно так его применяют наркоманы, вызывает поражение головного мозга - энцефалопатию.

В настоящее время остается актуальным определение производных барбитуровой кислоты в смеси с наркотическими веществами при химико-токсикологическом анализе. Указанное обстоятельство требует подобрать оптимальную схему исследования, позволяющую, не ухудшая качество, значительно снизить сроки проведения химико-токсикологического анализа.

В практике ГОБУЗ «Новгородское Бюро судебно-медицинской экспертизы» встретился случай злоупотребления таблетками «Реладорм», содержащими диазепам и циклобарбитал. Из реанимационного отделения больницы был доставлен больной, со слов родственников стало известно, что он принял таблетки анальгина и димедрола, после чего отметил ухудшение самочувствия и был госпитализирован. Для проведения химико-токсикологического анализа были направлены кровь, моча и промывные воды желудка, а также таблетки (14 штук), обнаруженные в кармане больного, которые исследовались в первую очередь, так как предварительная реакция мочи и промывных вод на производные пиразолона (с раствором хлорида окисного железа) была отрицательной.

В ходе эксперимента было решено разработать схему химико-токсикологического анализа: изолирование, очистку, скрининг, качественный и количественный анализ для исследуемых биожидкостей и неизвестных таблеток. Для анализа было предоставлено: 100 мл мочи, 10 мл крови, 100 мл промывных вод из желудка, неизвестные таблетки 14 штук (таблетки белого цвета, плоской округлой формы, диаметром 7 мм, весом 110 мг, толщиной 1,5 мм).

Для иммунохроматографического определения использовали тест-полоски на фенциклидин серия №100804, трициклические антидепрессанты серия №240801, морфин серия №50810, бензодиазепины серия №60810, амфетамин серия №30810, метамфетамин серия №80804, марихуану серия №20810, метадон серия №70810, кокаин серия №40810, барбитураты №90810.

В чистую емкость вносили анализируемый образец мочи (1,5 мл). Погружали тест-полоски строго вертикально концом со стрелками в мочу на 30 секунд. Извлекали и через 5минут наблюдали одну розовую полосу на тест-полосках для барбитуратов и бензодиазепинов. На других тест-полосках наблюдали по две розовые полосы. Делали вывод, что в анализируемом образце предположительно присутствуют производные барбитуровой кислоты, 1,4-бензодиазепина.

Далее проводили пробоподготовку: 10 мл крови помещали в колбу, прибавляли 20 мл 96% этилового спирта, подкисленного насыщенным раствором щавелевой кислоты, до рН=2 и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником 50 минут. После охлаждения содержимое колбы фильтровали в фарфоровую чашку и выпаривали досуха на водяной бане. Сухой остаток обрабатывали 20 мл теплой воды и проводили экстракцию органическими растворителями: при рН=2 и рН=9 - хлороформом, при рН=13 - эфиром. При аналогичных значениях рН проводили прямую экстракцию для мочи и промывных вод. Щелочные извлечения для каждого объекта объединяли соответственно. Растворители испаряли при комнатной температуре. Сухие кислые остатки растворяли в 3 мл хлороформа каждый. Параллельно исследовали неизвестные таблетки, предварительно растворив их в 5 мл хлороформа и профильтровав.

Полученные хлороформные вытяжки экстрагировали 0,1 н раствором едкого натра и центрифугировали - водные фазы отбирали пипеткой, промывали хлороформный слой водой очищенной дважды по 5 мл. Промывные воды также отбирали пипеткой, присоединяя их к основной водной фазе, подкисляли щавелевой кислотой до рН=2 и дважды по 5 мин экстрагировали хлороформом порциями по 20 мл. Хлороформные вытяжки объединяли и доводили до объема 50 мл (V₁).

0,3 мл хлороформных извлечений и раствора неизвестной таблетки наносили с помощью капилляра в виде точки на стартовую линию трех хроматографических пластинок Sorbfil. На линию старта наносили в качестве свидетелей в одну точку последовательно по 0,2 мл (1мг в 1мл этанола) барбитал, фенобарбитал, этаминал-натрий, барбамил, и 0,2 мл (1мг в 1мл хлороформа) бензонал, циклобарбитал, диазепам. Полученные пятна диаметром не более 0,5 см подсушивали.

Хроматографирование проводили в следующих системах растворителей: хлороформ - н-бутанол - 25 % раствор аммиака (70:40:5), хлороформ - ацетон (9:1), изопропанол - хлороформ - 25% раствор аммиака (90:90:20). Камеры предварительно насыщали системой растворителей в течение 60 мин. Длина пробега фронта растворителя - 10 см. Время хроматографирования - 45 мин. После подсушивания при комнатной температуре до полного удаления растворителей пластинки равномерно опрыскивали 0,02% раствором дифенилкарбазона в хлороформе, а затем 2,5% раствором сульфата ртути [2].

На первой пластине в зоне нанесения свидетелей наблюдали пятна сиреневато-фиолетового цвета с R_f: барбитал - 0,22, фенобарбитал - 0,21, бензонал - 0,39, барбамил - 0,29, этаминал-натрия - 0,35, циклобарбитал - 0,31. В зоне нанесения исследуемых извлечений и неизвестной таблетки наблюдали пятна сиреневато-фиолетового цвета с R_f - 0,31.

На второй пластине в зоне нанесения свидетелей наблюдали пятна сиреневато-фиолетового цвета с R_f: барбитал - 0,70, фенобарбитал - 0,49, бензонал (2 пятна) - 0,49 и 0,61, барбамил - 0,85, этаминал-натрия - 0,94, циклобарбитал - 0,56. В зоне нанесения исследуемых извлечений и неизвестной таблетки наблюдали пятна сиреневато-фиолетового цвета с R_f -0,56.

На третьей пластине в зоне нанесения свидетелей наблюдали пятна сиреневато-фиолетового цвета с R_f: барбитал - 0,65, фенобарбитал - 0,44, бензонал - 0,54, барбамил - 0,80, этаминал-натрия - 0,89, циклобарбитал -0,59. В зоне нанесения исследуемых извлечений и неизвестной таблетки наблюдали пятна сиреневато-фиолетового цвета с Rf - 0,59.

Затем эти пластины обесцвечивали в токе теплого воздуха и проявляли реактивом Драгендорфа. В зоне нанесения свидетелей наблюдали пятна оранжевого цвета с R_f: на первой пластине - 0,45; на второй пластине - 0,65; на третьей - 0,70 для диазепама. В зоне нанесения исследуемых извлечений и неизвестной таблетки наблюдали пятна оранжевого цвета с R_f: на первой пластине - 0,45; на второй пластине - 0,65; на третьей - 0,70.

По результатам экспериментальной части можно сделать вывод, что системы хлороформ-н-бутанол-25 % раствор аммиака (70:40:5), хлороформ-ацетон (9:1), используемые в тонкослойной хроматографии, являются оптимальными для определения производных барбитуровой кислоты, так как пятна для веществ-свидетелей проявляются более четко и разгоняются на разные уровни.

Для исследуемых биожидкостей проводили качественное и количественное определение неизвестного токсиканта методом - спектрофотометрия в УФ-области: по 1 мл (V₂) исследуемых кислых хлороформных извлечений помещали в фарфоровые чашки, растворитель испаряли, а сухие остатки растворяли в 4 мл (V₃) боратного буфера (pH=9). Снимали спектры поглощения в области длин волн 220-300 нм на спектрофотометре СФ-46 с толщиной слоя кюветы 10 мм, раствор сравнения - боратный буфер (pH=9) [1], [7]. Затем в кюветы добавляли по 2 капли насыщенного раствора едкого натра (рН=13) и после тщательного перемешивания вновь снимали спектр поглощения в том же интервале длин волн. Далее в кюветы вносили по одной капле концентрированной соляной кислоты для достижения значения рН=2, и вновь снимали спектр в области длин волн 220-300нм (см. таблицу 1).

Таблица 1 - Результаты спектрофотометрического определения биообъектов

Одновременно снимали спектр поглощения циклобарбитала при тех же условиях (см. рисунок 1).

Рис. 1 - УФ-спектр поглощения циклобарбитала при разных значениях рН

Наблюдались максимумы поглощения для циклобарбитала и исследуемых извлечений: при рН=9 - 240 нм, рН=13 - 256 нм. При рН=2 каких-либо максимумов не наблюдали.

Для количественного определения измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 с толщиной слоя кюветы 10 мм при длине волны 260 нм, раствор сравнения - боратный буфер. Были получены результаты:

рН=9 - D_кровь=0,263, D_моча=0,530, D_{промывные воды}=0,230;

рН=13 - D_кровь=0,265, D_моча=0,540, D_{промывные воды}=0,255.

Для расчета пользовались значениями удельного показателя поглощения (Е^1%_1см), который вычисляли по формуле (см. таблицу 2):

(1)

где С - концентрация исследуемого вещества в %,

l - толщина поглощающего слоя в см,

Д D = D_рН=13 - D_рН=9.

Из однородных результатов, используя статистическую обработку, определяли среднее арифметическое значение удельного показателя поглощения, которое составило Е^1%_1см = 410.

Расчет концентрации циклобарбитала (Х) в исследуемых объектах производили по формуле:

(2)

где ?D = D_рН=13 - D_рН=9,

V₁ - общий объем хлороформного извлечения, мл,

V₂ - аликвотная часть хлороформного извлечения, взятого на исследование, мл,

V₃ - разведение, мл,

Е^1%_1см - удельный показатель поглощения, равный 410,

V - объем биожидкости, мл.

Таблица 2 - Результаты количественного определения

Концентрация циклобарбитала по формуле (2) равна: в крови 0,9 мг%; в моче 0,4 мг%, в промывных водах 1,2 мг%.

По 1 мл кислых извлечений и 0,1 мл хлороформного раствора таблетки переносили в чистые флаконы и испаряли растворитель досуха. К сухим остаткам добавляли 100 мкл этилацетата и по 1 мкл этилацетатных растворов исследовали на хромато-масс-спектрометре Agilent7890/5975N EI/PCI с капиллярной колонкой НР-5 MS длиной 30 м и диаметром 0,25 мм. Начальная температура колонки 100°С, скорость подъема температуры 25°С в минуту до 300°С. Время эксперимента - 26 минут.

По результатам исследования были идентифицированы пики, соответствующие по времени удерживания и масс-спектрам циклобарбиталу и диазепаму в крови, моче, промывных водах желудка, неизвестной таблетке.

Стоит отметить, что газовая хроматография с масс-селективным детектированием (ГХ/МС) получила широкое распространение в судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе как высокоспецифичный, чувствительный и достаточно экспрессный метод.

С целью сокращения времени химико-токсикологического анализа биожидкостей при отравлении производными барбитуровой кислоты и смешанных отравлениях, в том числе производными барбитуровой кислоты, предложено использовать комбинацию принципиально разных методов, и получение по каждому из них положительных результатов. При этом выполняется основное правило - проведение химико-токсикологического анализа как минимум двумя методами, причем один из этих методов используется для предварительного исследования, а другой - для подтверждающего исследования. Также оптические и хроматографические, в совокупности с масс-селективным детектированием, методы позволяют открывать не только производные барбитуровой кислоты, но и другие токсикологически важные соединения одновременно.

барбитуровый кислота отравление токсикологический

Список литературы

1. Вергейчик Т.Х. Токсикологическая химия: учебник / Т.Х. Вергейчик. - М.: МЕДпресс-информ, 2009. - С. 142-157

2. Внуков В.И. Тонкослойная хроматография при исследовании наркотических средств / В.И, Внуков, Д.В. Кайргалиев, Д.В. Васильев и др. // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №1-2;

3. Ермаков М.Г. Психоактивные свойства сильнодействующих и ядовитых веществ: уголовно-правовой аспект / М.Г. Ермаков // Психопедагогика в правоохранительных органах. - 2012. - №4 (51). - С. 10-13

4. Захарченко М.Ю. Барбитураты, бензодиазепины, анаболические стероиды: история создания, действие, анализ: учебно-справочное пособие / М.Ю. Захарченко, И.Н. Мельников, Д.В. Кайргалиев; под ред. С. Я. Пичхидзе // Саратов: КУБиК, 2015. - 189 с.

5. Илларионова Е.А. Химико-токсикологический анализ снотворных лекарственных средств: учебное пособие / Е.А. Илларионова, И.П. Сыроватский; ФГБОУ ВО ИГМУ Минздрава России, кафедра фармацевтической и токсикологической химии. - Иркутск: ИГМУ, 2016 - 32 с.

6. Кайргалиев Д.В. Современные возможности экспертного исследования барбитуратов в сложных смесях / Д.В. Кайргалиев, И.Н. Мельников, Д.В. Васильев // Технико-криминалистическое обеспечение раскрытия и расследования преступлений: сборник тезисов и статей Международной научно-практической конференции, 19 октября 2018 г. / [составитель: Васильев Д. В.]. - Волгоград: Перископ-Волга, 2018. - С. 119-122

7. Калетина Т.И. Токсикологическая химия. Аналитическая токсикология: учебник / Т.И. Калетина; под ред. Р.У. Хабриева, Н.И. Калетиной. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - С. 472-484

8. Киричек А.В. Исследование производных барбитуровой кислоты в застарелых пятнах крови на тканях / А.В. Киричек, А.Э. Шабалина, Л.А. Рассинская // Судебно-медицинская экспертиза. - М., 2017 - №2. - С. 27-29.

9. Петрова О.С. Токсикологическая химия: учебно-методическое пособие / О.С. Петрова, Г.А. Антропова // НовГУ им. Ярослава Мудрого. - Великий Новгород, 2012. - С. 49-54

10. Clarke`s analysis of drugs and poisons / Ed.Moffat A.C., Osselton M.D., Widdop B.- London, Pharmaceutical Press, 2011. - Fourth Edition. - Р. 1177

Размещено на Allbest.ru