Роль рекомбинантного циклофилина А человека в развитии противоопухолевого иммунного ответа

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Роль рекомбинантного циклофилина А человека в развитии противоопухолевого иммунного ответа

А. А. Калинина¹, Ю. Ю. Силаева², Д. Б. Казанский¹, Л. М. Хромых¹*

'«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина»

Министерства здравоохранения России

²Институт биологии гена РАН

РЕФЕРАТ

Циклофилин А (ЦфА) - многофункциональный белок, обладающий изомеразной активностью и существующий во внутриклеточной и секретируемой формах. Секретируемый ЦфА способствует регенерации кроветворной и иммунной систем организма, усиливая миграцию стволовых клеток из костного мозга. В настоящее время разрабатываются стратегии применения ЦфА при ишемии конечностей, для устранения побочных эффектов циклоспорина А (ЦсА) и др. Однако роль ЦфА в развитии противоопухолевого иммунного ответа не изучена. Используя модельную систему отторжения лимфомы EL-4 мышами B10.D2(R101), нами показано, что рекомбинантный ЦфА человека стимулирует противоопухолевый иммунный ответ за счет раннего привлечения гранулоцитов в сайт локализации клеток-мишеней и ускоренного системного накопления эффекторных Т-киллерных клеток.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА провоспалительный фактор, противоопухолевый иммунный ответ, трансгенные мыши, Т-клеточный рецептор, циклофилин А.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЦфА - циклофилин А; ЦсА - циклоспорин А; рчЦфА - рекомбинантный циклофилин А человека; ТКР - Т-клеточный рецептор; МНС - главный комплекс гистосовместимости; PBS - фосфатно-солевой буфер; i.p. - внутрибрюшинное введение; АПК - антигенпредставляющие клетки; CD - кластер дифференцировки.

ВВЕДЕНИЕ

Циклофилин А (ЦфА) - белок семейства пептидил- пролилизомераз, существующий во внутриклеточной и секретируемой формах. Цитозольный ЦфА присутствует во всех тканях и выполняет множество функций [1]. ЦфА участвует в проведении сигнала через Т-клеточный рецептор [1] и служит лигандом для циклоспорина А, за счет чего и реализуется иммуносупрессорное действие последнего.

Секретируемый ЦфА является провоспалитель- ным фактором, он привлекает клетки врожденного иммунитета (гранулоциты, макрофаги, дендритные клетки) в очаг воспаления и участвует в патогенезе различных заболеваний [1]. Будучи хемоаттрактантом стволовых клеток, а также незрелых гра- нулоцитов, предшественников дендритных клеток, Т- и В-лимфоцитов, и индуцируя их миграцию из костного мозга на периферию, секретируемый

ЦфА осуществляет регенеративные функции [2]. ЦфА способен регулировать действие других хемо- кинов и продукцию провоспалительных цитокинов [3]. ЦфА индуцирует дифференцировку и созревание дендритных клеток, а также захват и представление антигена этими клетками [4]. Таким образом, ЦфА может быть фактором модуляции как врожденного, так и адаптивного иммунитета. Накапливающиеся экспериментальные данные указывают на потенциальную возможность применения данного белка при таких заболеваниях, как ишемия конечностей, устранение побочных эффектов, вызванных действием циклоспорина А, вирусных заболеваний и др.

Однако роль ЦфА в индукции и развитии противоопухолевого иммунного ответа остается малоизученной. Цель нашей работы состояла в оценке вклада ЦфА как фактора иммунитета, участвующего в начальных этапах развития противоопухолевого иммунного ответа. Определено влияние рекомбинантного ЦфА человека (рчЦфА) на отторжение лимфомы EL-4 мышами B10.D2(R101). Выявлено иммуномодулирующее действие рчЦфА, направленное на стимуляцию врожденного и адаптивного звеньев иммунитета и, как следствие, на ускоренную элиминацию опухолевых клеток. Кроме того, в модели формирования противоопухолевого иммунного ответа у мышей трансгенной линии 1D1b [5] на клетки лимфомы EL-4 показана роль рчЦфА в стимуляции накопления опухольспецифичных цитотоксических Т-лимфоцитов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Мыши

Мышей линий C57BL/6 (K^bI-A^bD^b) и B10.D2(R101) (K^dI-A^dI-E^dD^b) получали из экспериментальнобиологической лаборатории НИИ ЭДИТО НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России. Трансгенные мыши линии 1D1b, в Т-лимфоцитах которых экспрессируются Я-цепи Т-клеточного рецептора (ТКР) клеток памяти, специфичного к молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I H-2K^b, выведены на генетической основе линии B10.D2(R101) в лаборатории механизмов регуляции иммунитета НИИ канцерогенеза НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина [5]. В исследованиях использовали самцов и самок массой 16-18 г. Экспериментальные группы включали 6-8 животных. Работу с животными проводили в соответствии с протоколом этической комиссии НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России.

Получение рчЦфА

Белок выделяли из биомассы клеток Escherichia coli BL21(DE3)Gold, трансформированных рекомбинантной плазмидой pETCYPopti, содержащей полноразмерный ген ЦфА человека [6]. рчЦфА использовали в виде раствора в натрий-калий фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7.3) с чистотой более 95% по данным электрофореза. По результатам LAL-теста содержание эндотоксина в образцах рчЦфА не превышало 0.038 нг/мг белка.

Иммунизация животных

Мышей линии B10.D2(R101) и 1D1b иммунизировали внутрибрюшинно (i.p.) клетками лимфомы EL-4 (K^bD^b) в количестве 3.0 х 10⁵ и 1.0 х 10⁶ клеток/мышь соответственно в 500 мкл PBS.

Схемы введения рчЦфА

Мышам линии B10.D2(R101) вводили белок i.p. в дозе 5 мг/кг (100 мкг/мышь) в течение 3 дней после иммунизации лимфомой EL-4. Первую инъекцию белка проводили через 3 ч после имплантации клеток EL-4. Мышам линии 1D1b вводили 10 мг/кг рчЦфА подкожно в течение 10 дней после иммунизации. Контрольным животным вводили PBS в качестве плацебо.

Подготовка суспензий клеток

Через 6, 9 и 12 дней после иммунизации мышей линии B10.D2(R101) умерщвляли путем цервикальной дислокации. Для получения лаважа проводили смыв брюшной полости 2 мл PBS при помощи шприца. Для получения суспензии спленоцитов извлекали селезенку и гомогенизировали в 3 мл PBS в гомогенизаторе Поттера. Трансгенных мышей 1D1b умерщвляли на 12 день после иммунизации и подготавливали суспензию спленоцитов аналогичным образом. Лизис эритроцитов проводили в лизирующем буфере (BD, США), затем отмывали клетки в PBS и осаждали центрифугированием (200 g, 5 мин). Жизнеспособные клетки подсчитывали в камере Горяева в присутствии трипанового синего и эозина.

Антитела

В работе использовали моноклональные антитела: анти-CD3є - eFluor450 (клон 17А2) (eBioscience, США); анти-CD8 - Pacific blue (клон 53-6.7) (BD Pharmingen, США); анти-CD44 - АРС (клон IM7) (eBioscience, США); анти-CD62L-АРС - Cy7 (клон MEL-14) (eBioscience, США); анти^Ъ6 - PE (клон RR4-7) (eBioscience, США); анти-GM - АРС (клон RB6-8C5) (BD Pharmingen, США); анти-CDHb-PE - Cy7 (клон М1/70) (BD Pharmingen, США).

Цитофлуориметрический анализ

Пробы клеток лаважа и селезенки (1.0--5.0 х 10⁶) обрабатывали антителами Fc block (клон 2.4G2, BD Pharmingen, США) в течение 5 мин при 4°С и инкубировали с моноклональными антителами нужной специфичности в течение 40 мин при 4°С. Клетки отмывали PBS путем центрифугирования (200 g, 5 мин) и анализировали на проточном цитофлуориме- тре FACS CantoII (BD, США) с использованием программы FACSDiva 6.0. Мертвые клетки исключали из анализа по окрашиванию йодидом пропидия (BD, США). Для характеристики популяций анализировали 0.5 - 1.0 х 10⁶ событий. Обработку результатов проводили в программе FlowJo 7.6. (BD, США).

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента в программе Exel (Microsoft, США). Различия признавали значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследовании использовали аллогенную систему, в которой отторжение клеток лимфомы EL-4 (K^bD^b) в организме мышей линии B10.D2(R101) (K^dI-A^dI- E^dD^b) происходило в силу различий по одной молекуле MHC класса I - H-2K^b. Показано, что введение рчЦфА приводит к полной элиминации EL-4 на 9 день после трансплантации опухолевых клеток, тогда как в норме отторжение лимфомы наблюдается к 12 дню (рис. 1).

Рис. 1. Относительное количество клеток лимфомы EL-4 (K^b+, %) в брюшной полости мышей линии B10.D2(R101) на 6 (А), 9 (Б) и 12 (В) день после иммунизации. Представлены результаты 3 репрезентативных экспериментов (M ± SD, n = 6 - 8). Относительное количество K^b+ клеток в лаваже интактных мышей отображает уровень неспецифического связывания моноклональных анти-К^ь-антител

Рис. 2. Динамика изменения относительного количества незрелых нейтрофилов (Gr1hi CD11blo), промиелоцитов и миелоцитов (Gr1int CD11bint), зрелых гранулоцитов (Gr1hi CD11bhi) в брюшной полости мышей линии B10.D2(R101) на 6 (А), 9 (Б) и 12 (В) день после иммунизации клетками лимфомы EL-4. Представлены данные 3 репрезентативных экспериментов (M ± SD, n = 6 - 8).*р < 0.05; **р < 0.01

Рис. 3. Динамика накопления эффекторных CD8+ Т-лимфоцитов (CD62L^-CD44+) в селезенке мышей линии B10.D2(R101) после иммунизации клетками EL-4. Представлены результаты 3 репрезентативных экспериментов (M ± SD, n = 6 - 8).**р < 0.01

Развитие иммунного ответа на лимфому EL-4 сопровождалось привлечением гранулоцитов в сайт локализации клеток-мишеней. К 6 дню после иммунизации рчЦфА индуцировал интенсивное накопление зрелых нейтрофилов в брюшной полости иммунизированных мышей, увеличивая относительное количество данных клеток в 3 раза по сравнению с контрольными иммунизированными животными (рис. 2А). К 9 дню после иммунизации под действием рчЦфА происходило увеличение незрелых грану- лоцитов, а также промиелоцитов и миелоцитов в 2.5 и 4.5 раза соответственно по сравнению с контрольными иммунизированными животными (рис. 2Б).

На следующем этапе проведена оценка влияния рчЦфА на количественные и субпопуляционные изменения CD8+ Т-лимфоцитов у мышей-опухоленоси- телей. Нам не удалось обнаружить влияния рчЦфА на динамику накопления CD8+ Т-лимфоцитов в локальном очаге опухоли (при оценке лаважа) или на системном уровне (при оценке спленоцитов, данные не приведены). Однако анализ субпопуляций наивных клеток (CD62L+CD44^-), центральных клеток памяти (CD62L+CD44+) и эффекторных клеток (CD62L^-CD44+) в пуле CD8+ Т-лимфоцитов селезенки показал, что под влиянием рчЦфА значительно увеличивается (на 65% относительно контрольных животных) количество эффекторных цитотоксических Т-клеток на 9 день поле введения опухоли (данные не представлены, рис. 3), что коррелирует с динамикой элиминации клеток лимфомы (рис. 1).

Таким образом, показано, что рчЦфА при вну- трибрюшинном введении стимулирует противоопухолевый иммунный ответ за счет раннего привлечения гранулоцитов в сайт локализации клеток-мишеней и ускоренного накопления эффектор- ных Т-киллерных клеток на системном уровне.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что у трансгенных мышей линии 1D1b в ходе иммунного ответа на клетки EL-4 формируется значительно меньший пул эффекторных CD8+ Т-лимфоцитов по сравнению с мышами дикого типа, вследствие чего они не способны отторгать данную опухоль [5, 7].

В настоящей работе у мышей 1D1b оценено влияние рчЦфА на относительное количество эффектор-ных Т-лимфоцитов, несущих на своей поверхности эндогенные или трансгенную Я-цепь ТКР, которую идентифицировали с помощью коммерческих антител к Vb6.

Показали, что рчЦфА не влиял на относительное количество эффекторных Т-лимфоцитов, экспрессирующих эндогенные Я-цепи ТКР, у мышей 1D1b, иммунизированных лимфомой EL-4 (рис. 4), но способствовал значительному (в 2 раза относительно контрольных животных) увеличению пула эффекторных Т-лимфоцитов, несущих трансгенную Я-цепь ТКР (рис. 4).

Рис. 4. Относительное количество (%) эффекторных CD8+ Т-лимфоцитов (CD62L^-CD44+) с эндогенными Я-цепями ТКР (Vb6^-) или трансгенной Я-цепью (Vb6+) ТКР в селезенке мышей трансгенной линии 1D1b на 12 день после иммунизации. Представлены результаты 3 репрезентативных экспериментов (M ± SD, n = 7).*р < 0.05

Полученные данные позволяют предполагать, что рчЦфА способен модулировать противоопухолевый иммунный ответ как у мышей с нормальным репертуаром Т-лимфоцитов (B10.D2(R101)), так и в условиях ограниченного репертуара ТКР Т-лимфоцитов у трансгенных мышей линии 1D1b путем увеличения пула эффекторных CD8+ Т-лимфоцитов.

ОБСУЖДЕНИЕ

В данной работе мы изучали роль рчЦфА в развитии противоопухолевого иммунного ответа на лимфому EL-4 у мышей линии B10.D2(R101) и показали, что этот белок стимулирует накопление гранулоци- тов в сайте локализации опухолевых клеток и системное увеличение пула эффекторных цитотоксических Т-лимфоцитов, приводящее к ускоренной элиминации клеток опухоли. Известно, что инфиль-трация тканей нейтрофилами является первой фазой иммунного ответа при инфицировании или воспалении. Эти клетки способны захватывать антиген и мигрировать в дренирующие лимфоузлы и селезенку, где они взаимодействуют с антигенпредставляющими клетками (АПК) и лимфоцитами [8] или сами выступают в роли АПК [9], участвуя в формировании адаптивного иммунного ответа. Ранее мы показали, что нейтрофилы участвуют в развитии иммунного ответа на клетки аллогенной опухоли [10]. Роль данных клеток может заключаться в обеспечении кости- муляторных сигналов (CD80 и CD86) и цитокинового окружения (интерлейкин 12), необходимых для диф- ференцировки цитотоксических Т-лимфоцитов [10, 11]. Показано, что процессы, происходящие в брюшной полости при внутрибрюшинном введении рчЦфА, коррелируют с иммунным ответом на уровне организма.

У мышей 1D1b экспрессия трансгенной Я-цепи ТКР приводит не только к сокращению репертуара ТКР, но и снижает количество активированных Т-лимфоцитов [5]. Иммунный ответ мышей 1D1b на лимфому EL-4 недостаточен для полного отторжения опухоли, он приводит к иммуноредактированию лимфомы посредством селекции наименее иммуногенных клонов, которые через 60 дней убивают животных [7]. В данной экспериментальной системе установлено, что под действием рчЦфА происходит статистически значимое увеличение пула специфических цитотоксических Т-лимфоцитов на начальных этапах иммунного ответа на лимфому EL-4. Полученные данные позволяют предполагать, что рчЦфА способен модулировать противоопухолевый иммунный ответ как у мышей с нормальным репертуаром Т-лимфоцитов, так и в условиях ограниченного репертуара Т-клеток путем увеличения пула эффекторных Т-киллеров.

Таким образом, нами показано, что рчЦфА обладает иммуностимулирующим действием, способствуя ускоренному развитию противоопухолевого иммунного ответа за счет стимуляции врожденного и адаптивного звеньев иммунитета

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

циклофилин противоопухолевый иммунный ответ

1. Nigro P, Pompilio G., Capogrossi M.C. // Cell Death Disease. 2013. V. 4. Р e888. doi: 10.1038/cddis.2013.410.

2. Khromykh L.M., Kulikova N.L., Anfalova T.V., Muranova T.A., Abramov V.M., Vasiliev A.M., Khlebnikov V.S., Kazansky D.B. // Cell Immunol. 2007. V. 249. № 1. Р 46-53.

3. Dawar F.U., Xiong Y., Khattak M.N.K., Li J., Lin L., Mei J. // J. Leukoc. Biol. 2017. V. 102. № 4. Р 989-992.

4. Bharadwaj U., Zhang R., Yang H., Doan D., Li M., Chen C., Yao Q. // J. Surgical Res. 2004. V. 121. № 2. Р 294.

5. Силаева Ю.Ю., Калинина А.А., Вагида М.С., Хромых Л.М., Дейкин А.В., Ермолкевич Т.Г, Садчикова Е.Р, Гольдман И.Л., Казанский Д.Б. // Биохимия. 2013. Т. 78. № 5. Р 614-626.

6. Хромых Л.М., Калинина А.А., Козырь А.В., Колесников А.В., Силаева Ю.Ю., Казанский Д.Б. Патент № 2603283. Российская Федерация. 2015.

7. Silaeva Yu.Yu., Grinenko T.S., Vagida M.S., Kalinina A.A., Khromykh L.M., Kazansky D.B. // J. Immunotoxicol. 2014. V. 1. № 4. Р 393-399.

8. Mantovani A., Cassatella M.A., Costantini C., Jaillon S. // Nat. Rev. Immunol. 2011. V. 11. № 8. Р 519-523.

9. Takashima A., Yao Y. // J. Leukoc. Biol. 2015. V. 98. № 4.Р 489-496.

10. Марюхнич Е.В., Звездова Е.С., Анфалова Т.В., Хромых Л.М., Казанский Д.Б. // Докл. Акад. наук. 2007. Т. 414. № 1.Р. 126-129.

11. Побезинский Л.А., Побезинская Е.Л., Звездова Е.С., Петрищев В.Н., Гриненко Т.С., Батурина И.А., Анфалова Т.В., Хромых Л.М., Васильева Т.В., Казанский Д.Б. // Докл. Акад. наук. 2005. Т. 402. № 3. Р 421-426.

Размещено на Allbest.ru