Бактериофаг MS2 - средство доставки для таргетной химиотерапии солидных опухолей

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича

Научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации

Бактериофаг MS2 - средство доставки для таргетной химиотерапии солидных опухолей

Е.Ф. Колесанова, М.В. Мельникова, Т.Н. Большакова,

Е.Ю. Рыбалкина, И. Г. Сивов

РЕФЕРАТ

Бактериофаг MS2 был использован для таргетной доставки индуктора апоптоза, T1+, в ткань опухоли. Таргетная доставка обеспечивалась iRGD-пептидом, лигандом интегринов, локализуемых преимущественно на поверхности эндотелиоцитов новообразованной сосудистой сети в опухолевой ткани и некоторых опухолевых клетках. Синтезированный пептид конъюгировали с капсидными белками MS2. Ионы Tl+ из TlNO₃ проникали внутрь частиц фага и прочно связывались с его РНК. Препараты MS2, модифицированного пептидом и наполненного T1+, вызывали гибель культивируемых клеток двух типов рака молочной железы человека и некроз ксенографтов этих опухолей. Ни конъюгат бактериофага MS2 с пептидом без T1+, ни заполненный Tl+ фаг без пептида, ни он же с неконъюгированным пептидом в растворе не вызывали таких эффектов. Препарат не проявлял острой токсичности в терапевтической дозе. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА бактериофаг MS2, iRGD-пептид, ионы таллия (I), рак молочной железы, таргетная терапия.

бактериофаг таргетный химиотерапия опухоль

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

D₅₀ - эффективная доза (effective dose), при которой эффект составляет 50% от максимально возможного; LD₅₀ - доза вещества, введение которой вызывает гибель 50% животных; SDS - sodium dodecyl sulphate (додецилсульфат натрия); БОЕ - бляшкообразующие единицы; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ДМАИ - диметиладипимидат; РМЖ - рак молочной железы.

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы усилия разработчиков противоопухолевых лекарств сконцентрированы на препаратах направленного действия на основе как новых, так и уже известных цитостатиков [1]. Наиболее эффективным способом доставки считается использование наноконтейнеров, модифицированных специфичными лигандами (липосом, мицелл, полимерных наночастиц, вирусоподобных частиц, вирусов), заполняемых лекарственными соединениями. Однако применение инновационных средств доставки не решает проблему множественной лекарственной устойчивости опухолей, способную свести на нет все усилия по повышению эффективности лекарственных соединений [3].

Показано, что ионы Tl+ обладают мощным цитотоксическим действием и подавляют функционирование белковых насосов лекарственной устойчивости опухолевых клеток [4]. Включение Tl+ в «не протекающий» наноразмерный контейнер, снабженный системой направленной доставки, позволит создать эффективное средство для разрушения опухолей при значительном снижении токсического воздействия Tl+ на организм в целом. В 1980-х гг. удалось наполнить Tl+ частицы вируса осповакцины [5]. Механизм наполнения заключался в образовании прочного соединения между Tl+ и вирусной РНК [6]. В качестве наноконтейнера нами был выбран бактериофаг MS2, способный размножаться только в клетках Escherichia coli, несущих F-пили и не являющихся симбионтами либо патогенами человека

Направленность доставки обеспечивали конъюгацией капсидных белков фага с пептидом (Gly)₃-iRGD, содержащим фрагмент cycloSS-(CRGDKGPDC) (iRGD), ответственный за связывание с интегрина- ми, локализованными преимущественно на внешних мембранах эндотелиоцитов вновь формируемой патологической сосудистой сети солидных опухолей и на ряде опухолевых клеток [8]. В нашей работе проведена экспериментальная проверка эффективности наполненного Tl+ фага MS2 с адресным пептидом в качестве потенциального противоопухолевого препарата.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение бактериофага MS2 описано в работе [9]. Количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл препарата фага определяли методом титрования в агаровых слоях.

Пептид (Gly)₃-iRGD получали методом автоматического твердофазного синтеза исходя из 9-флуоренил(метоксикарбонил)-аминокислот (ChemPep, США) (синтезатор 433А, Applied Biosystems, метод FastMoc). Формирование S--S- мостика проводили путем окисления I₂ [10]. Пептид очищали ВЭЖХ на обращенной фазе (колонка C18 Triart, 21 X 250 мм, 10.0 мкм, YMC, Швейцария, рабочая станция Agilent 1100, Agilent, США) в градиенте концентрации CH₃CN (BioSolve, Израиль) в воде в присутствии 0.1% уксусной кислоты. По данным аналитической ВЭЖХ на обращенной фазе (колонка C18 Triart, 2.1 X 50 мм, 2.0 мкм (YMC), рабочая станция Agilent 1200) с УФ- и масс-спектрометрической детекцией чистота препарата пептида не ниже 95%.

Конъюгацию пептида (Gly)₃-iRGD с капсидными белками фага MS2 проводили с использованием го- мобифункционального реагента диметиладипими- дата (ДМАИ, Sigma, США) в молярном соотношении белок фага: пептид: ДМАИ 1: 20: 80 по методике Бактериофаг отделяли от избытка реагентов осаждением 25% раствором полиэтиленгликоля 6000 («Диа-М», Россия) с 1 М NaCl. Осажденный бактериофаг суспендировали в деионизованной воде.

Заполнение бактериофага Tl+ проводили с использованием TlNO₃ (Sigma-Aldrich, США). Бактериофаг MS2, конъюгированный с пептидом (iRGD-MS2), в количестве 10¹¹ БОЕ инкубировали в 3 мл 0.5 мкМ раствора TlNO₃ (5 ч при 38^оС) с последующим осаждением, как указано выше, и диализом против фосфатно-солевого буфера (0.14 М NaCl, 0.01 M фосфат натрия, рН 7.4).

Количество включенных в вирионы и присутствующих в среде Tl+ определяли согласно [12]. Суспензию наполненных Tl⁺ частиц фага центрифугировали в течение 10 мин при 5000 об/мин для удаления осадка солей таллия, разводили 50 мМ буфером трис-HCl, рН 9.0 до концентрации (условно) 10⁸ БОЕ/мл, денатурировали нагреванием в течение 30 мин при +70^оС с РНКазой в 0.05% SDS, затем регистрировали тушение флуоресценции (длины волн возбуждения - 340 нм, эмиссии - 465 нм, спектро- флуориметр UV-1900, Shimadzu, Япония) натриевой соли 1,3,6,8-пирентетрасульфоновой кислоты (BOC Sciences APP, США) ионами Tl⁺. По калибровочной кривой зависимости степени тушения флуоресценции 1,3,6,8-пирентетрасульфоновой кислоты от [Tl+] рассчитывали количество Tl+ в препарате фага. Количество Tl⁺ в буферном растворе после диализа определяли без предварительной денатурации.

Цитотоксическое действие iRGD-MS2-Tl+ на клетках в культуре исследовали на линиях MCF-7 (гормонзависимый рак молочной железы (РМЖ)) и МDA-MB-231 (гормоннезависимый РМЖ). Клетки культивировали в бессывороточной среде (MSC1 Pan BioTech) и в той же среде с 5% фетальной сыворотки телят. Препарат iRGD-MS2-Tl⁺ вносили в 10-кратных разведениях, начиная с концентрации 10⁸ БОЕ/мл. В качестве контроля использовали препарат iRGD-MS2 (фаг, конъюгированный с пептидом, без Tl+). Погибшие клетки подсчитывали после окрашивания Эвансом синим.

Противоопухолевое действие препарата iRGD- MS2-Tl+ тестировали на мышах nude c MCF-7- или МDA-MB-231-ксенографтами. Мышам внутрикожно вводили 10⁵--10⁶ клеток MCF-7 или МDA-MB-231, а через 14 дней мышам опытных групп в течение 10 дней 1 раз в день вводили внутрибрюшинно по 200 мкл суспензии, содержавшей iRGD-MS2-Tl⁺ в количестве, соответствующем 10⁸ БОЕ/кг, контрольным -- iRGD-MS2, MS2-Tl+ или MS2-Tl+ + iRGD (в растворе, 2 мкг/кг) в таком же количестве и объеме раствора. В каждой опытной и контрольной группах было по 11 животных. Некротическую активность препарата определяли как отношение площади некротизированной ткани к общей площади опухоли через 12 дней после окончания введения препаратов фага по результатам анализа цифровых изображений гистологических срезов, сканированных на ScanScope CS2.

Предварительное исследование острой токсичности препарата iRGD-MS2-Tl+ проводили на 10 крысах (самках) WKY (Wistar-Kyoto) весом 200 -- 250 г. Крыс содержали в условиях 12-часового светового дня на стандартном лабораторном корме и воде ad libitum. Однократно внутрикожно вводили 10⁸ БОЕ/животное в объеме 500 мкл. Регистрировали состояние животных в течение 3 недель с момента введения препарата.

Рис. 1. Результаты токсического действия препарата iRGD-MS2-Tl+ на культуры опухолевых клеток (% гибели клеток)

Рис. 2. Ксенографт опухоли MDA-MB-231 у мышей nude до (А) и после (Б) лечения препаратом iRGD-MS2-Tl+

Эксперименты на животных проводили в соответствии с Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, и правилами надлежащей лабораторной практики (GLP) в РФ, утвержденных приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате инкубации бактериофага MS2 (как модифицированного, так и не модифицированного пептидом iRGD) в среде с TlNO₃ получены препараты MS2, содержавшие Tl+ в количестве 2.0 х 10^-9 г-экв таллия в расчете на 10⁸ БОЕ. Количество Tl+ на 1 БОЕ составило 2.0 х 10^-17 г-экв (~4 фг на 1 БОЕ, т.е. 400 нг в 10⁸ БОЕ). В буферном растворе, против которого диализовали наполненный таллием бактериофаг, Tl+ не обнаружен, что свидетельствует о его прочном связывании с РНК фага внутри частиц MS2.

Как видно из рис. 1, в бессывороточной среде препарат iRGD-MS2-Tl+ проявлял цитотоксическое действие на клетки и гормонзависимого, и гормон- независимого РМЖ. В случае гормонзависимого РМЖ (клетки MCF-7) ED₅₀ препарата iRGD-MS2-Tl+ составляла чуть менее 10⁵ БОЕ/мл культуральной жидкости, а статистически значимое превышение цитотоксического эффекта препарата по сравнению с контролем наблюдалось вплоть до концентрации 10 БОЕ/мл. Клетки гормоннезависимого РМЖ МDA- MB-231 были более устойчивыми к действию препарата: ЕD₅₀ для этих клеток в бессывороточной среде составляла 10⁶--10⁷ БОЕ/мл, а статистически значимое превышение цитотоксического эффекта препарата над контролем наблюдалось до концентрации 10⁴ БОЕ/мл. В среде с сывороткой цитотоксическое действие iRGD-MS2-Tl+ проявлялось намного слабее, что может свидетельствовать о конкуренции между компонентами сыворотки и частицами iRGD-MS2-Tl+ за проникновение в клетки.

У мышей с ксенографтами MCF-7 и МDA-MB-231 через 12 дней после введения препарата iRGD- MS2-Tl+ наблюдалось уменьшение объема опухоли по сравнению с контрольными группами животных (рис. 2). Гистохимически показано некротизирующее действие iRGD-MS2-Tl+ на соответствующие опухоли. Из рис. 3 видно, что препарат iRGD-MS2-Tl+ вызывал некроз ткани опухоли (р < 0.05) более эффективно, чем препараты фага с пептидом, но без Tl+, фага с Tl+, но без пептида, фага с Tl+ и с неконъюги- рованным пептидом в растворе.

Исследование острой токсичности препарата iRGD-MS2-Tl+ на крысах WKY (Wistar-Kyoto) показало, что однократное введение препарата iRGD-MS2-Tl+ в дозе 10⁸ БОЕ/животное, т.е. 1.6--2.0 мкг Tl/кг, не привело к гибели ни одного животного за 3 недели наблюдения. Не выявлено заметных изменений в поведении животных. Суммарная доза Tl+, обеспечивающая достижение терапевтического эффекта (4 мкг/кг), была меньше его LD₅₀ (20 мг/кг) в 5000 раз.

Рис. 3. Площадь некротизированной ткани опухолей у мышей с ксенографтами РМЖ. Группа «1» - опытные животные, получавшие препарат iRGD-MS2-Tl+; группа «0» - контрольные животные, получавшие препараты iRGD-MS2, MS2-TI+ или MS2-TI+ с неконъюгиро- ванным (растворенным) iRGD-пептидом

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Направленная доставка токсичного иона металла с помощью фагового дисплея на основе частиц iRGD-MS2-Tl+ в сосудистую сеть опухолевой ткани вызывает эффективный распад всей массы опухоли при значительном снижении вероятности токсического воздействия на организм в целом. Это позволяет рекомендовать iRGD-MS2-Tl+ к доклиническим исследованиям с целью создания лечебного препарата для терапии рака молочной железы. Поскольку пептидный лиганд iRGD взаимодействует с интегри- нами a_vb₃ и a_vb₅ на поверхности эндотелиоцитов патологической сосудистой сети [8], этот препарат может быть эффективен и в отношении других солидных опухолей, в которых идет интенсивный патологический неоангиогенез.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Lee M.S., Dees E.C., Wang A.Z. // Oncology (Williston Park). 2017. V. 31. № 3. P. 198-208.

2. Fan Y., Moon J.J. // Vaccines. 2015. V. 3. № 3. P. 662-685.

3. Ставровская А.А., Стромская Т.П. // Биохимия. 2008. Т. 73. № 5. С. 735-750.

4. Korotkov S.M., Brailovskaya I.V., Kormilitsyn B.N., Furaev V.V. // J. Biochem. Mol. Toxicol. 2014. V. 28. № 4. P. 149-156.

5. Zasukhina G.D., Vasilyeva I.M., Sdirkova N.I., Krasovsky

G. N., Vasyukovich L.Ya., Kenesariev U.I., Butenko P.G. // Mu- tat. Res. 1983. V. 124. № 2. P. 163-173.

6. Ke A., Ding F., Batchelor J.D., Doudna J.A. // Structure. 2007. V. 15. № 1. P. 281-287.

7. Leclerc H., Edberg S., Pierzo V., Delattre J.M. // J. Appl. Microbiol. 2000. V. 88. № 1. P. 5-21.

8. Ruoslahti E. //Adv. Drug Deliv. Rev. 2017. V. 110-111. P. 3-12.

9. Княжев В.А., Сивов И.Г., Сергиенко В.И. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2002. Т. 20. № 2.

С. 23-26.

10. Andreu D., Albericio F., Sole N.A., Munson M.C., Ferrer M., Barany G. // Methods Mol. Biol. 1994. V. 35. P. 91-169.

11. Synthetic peptides as antigens. / Eds van Regenmortel M.H.V., Muller S. Elsevier, 1999.

12. Donnelly D., Mihovilovic M., Gonzalez-Ros J.M., Ferragut J.A., Richman D., Martinez-Carrion M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. № 24. P. 7999-8003.

Размещено на Allbest.ru