Уникальный прототип радиотерапевтической установки: р53- независимый антипролиферативный эффект нейтронного облучения

Для колониеобразования 1000 облученных и необлученных (контроль) клеток рассевали на 100-мм чашку Петри в 20 мл модифицированной Дульбекко среды Игла с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка (HyClone, США), 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, инкубировали в течение 14 сут при 37°С, 5% СО₂. Колонии фиксировали метанолом и окрашивали метиловым фиолетовым. Для проточной цито- флуориметрии и иммуноблотинга облученные клетки инкубировали в указанной среде в течение 1-4 сут. Протоколы исследования клеточного цикла и белков опубликованы нами ранее [10-12]. Антитела приобретены в компании Cell Signaling (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

радиотерапевтический антипролиферативный нейтронный облучение

Однократное облучение линии НСТ116 в дозе 2 Гр значительно снижало способность клеток к пролиферации; после подведения дозы 3 Гр насчитывали лишь единичные мелкие (< 6 клеток) колонии (рисунок A). Через 2 сут после облучения клетки накапливались в фазе G2/M. Эта задержка сохранялась не менее 4 сут (рисунок Б; отметим увеличение доли полиплоидных клеток - признак нарушения митоза). Полученные результаты указывают на повреждение целостности ДНК как основной механизм ответа клеток на облучение нейтронами, генерируемыми НГ-24. Действительно, через 4 ч доля клеток с фосфорилированным гистоном Н2А - маркером разрывов ДНК - возрастала с 10% в интактных клетках до > 70% в клетках, получивших дозу 4 Гр. Этот эффект сохранялся не менее 24 ч после воздействия нейтронов.

Важно, что эффекты нейтронного облучения, выявленные на линии НСТ116, воспроизводятся на изогенной сублинии HCT116p53KO. Эта сублиния с инактивированным проапоптотическим белком р53 устойчива к ряду ДНК-повреждающих противоопухолевых препаратов [10]. Следовательно, p53 не обязателен для антипролиферативного действия нейтронов. Описанные эффекты наблюдали и для линии рака молочной железы MCF7 (делеция каспазы 3). Таким образом, противоопухолевые эффекты нейтронного облучения выявляются в клетках разного тканевого происхождения; отдельные нефункционирующие механизмы гибели, в других ситуациях ограничивающие терапевтическую эффективность, не препятствуют реализации противоопухолевого действия нейтронов.

Несмотря на схожесть ответа на облучение нейтронами, молекулярные события в клетках с интактным и нефункционирующим р53 не одинаковы. Так, накопление белка р21, тормозящего смену фаз клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК, а также активация циклина D1 - драйвера перехода G1-S - выявлены только в клетках HCT116, но не в сублинии HCT116p53KO (4 Гр; рисунок В). Поэтому увеличение p53, p21 и циклина D1 приводило к задержке клеток HCT116 в фазе G2/M, тогда как при нефункционирующем р53 такое же нарушение клеточного цикла обусловлено другими механизмами. Предстоит установить эти механизмы, а также выявить окончательный результат нейтронного облучения - апоптоз, митотическая катастрофа, старение и др.

Таким образом, генератор НГ-24 создает поток нейтронов, достаточный для индукции молекулярных и фенотипических нарушений в дозах и интервалах времени, соответствующих принятым в лучевой терапии, что позволяет предполагать пригодность установки для терапевтических задач. В то же время нейтронное излучение требует особых подходов к обеспечению безопасности пациента.

Молекулярные механизмы ответа клеток НСТ116 и НСТ116р53КО на облучение быстрыми нейтронами. A - колониеобразование; Б - распределение фаз клеточного цикла (проточная цитофлуориметрия, Р - полиплоидные ядра); В - иммуноблотинг. Показаны репрезентативные результаты (не менее трех повторностей)

Важнейшим является вопрос о повреждении нейтронами неопухолевых клеток. Учитывая зависимость противоопухолевой эффективности от параметров облучения, недостаточность информации о биологических закономерностях действия нейтронов, а также сложность точного определения поглощенной дозы нейтронного излучения, построение корреляций на основании сравнения ответа линий опухолевых и неопухолевых клеток представляется малопродуктивным. Экспериментальное исследование осложняется невозможностью образования колоний нетрансформированными клетками и трудностями длительного культивирования, что требует систематического исследования.

Конформность нейтронного облучения обеспечивается техническими решениями. Современные аппараты для лучевой терапии позволяют существенно снизить или избежать повреждения окружающих тканей благодаря широким возможностям планирования облучения - расчетам дозовой нагрузки на опухоль и перифокальные ткани. Поскольку доза на поверхности выше, чем в опухоли (поглощенная доза уменьшается вдвое на глубине 5-6 см), в лучевой терапии используется многопольное облучение; накопление дозы в опухоли происходит при облучении под различными углами к телу пациента. Удается снизить удельную дозу на поверхности при сохранении терапевтически эффективной дозы в опухоли. Используются мультилепестковые коллиматоры, точно повторяющие форму опухоли. Во время вращения источника вокруг тела пациента лепестки коллиматора перемещаются и формируют поле для каждого угла облучения; таких позиций во время сеанса лучевой терапии может быть много. Кроме того, значения ОБЭ нейтронов увеличиваются по мере уменьшения их энергии. В толще тканей, где нейтроны замедляются, ОБЭ ожидается выше, чем на коже. Однако, учитывая сложность определения ОБЭ, этот вопрос представляется недостаточно определенным. Для его решения требуются испытания in vivo.

В настоящем сообщении показано, что физикотехнические параметры экспериментальной установки НГ-24 обеспечивают поток нейтронов с биологическими характеристиками, приемлемыми для противоопухолевой радиотерапии. Следующая приоритетная задача - создание терапевтического прототипа, сочетающего высокую противоопухоле-вую эффективность нейтронов, конформность облучения и выполнение требований безопасности пациентов и персонала.

ВЫВОДЫ

Безопасное компактное устройство НГ-24 генерирует поток быстрых нейтронов, что позволяет подвести дозу облучения, достаточную для индукции выраженного антипролиферативного ответа в культуре опухолевых клеток.

Повреждение целостности ДНК и задержка смены фаз клеточного цикла в ответ на нейтронное облучение выражены независимо от статуса проапоптотического белка р53. Этот результат предполагает эффективность быстрых нейтронов для элиминации опухолевых клеток, в которых не функционируют отдельные молекулярные механизмы контроля баланса выживания и гибели.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Specht H.M., Neff T., Reuschel W., Wagner F.M., Kampfer S., Wilkens J.J., Petry W., Combs S.E. // Front. Oncol. 2015. V. 5. Р. 262.

2. Valcovic V. 14 MeV neutrons: Physics and applications. Boca Raton: CRC Press, Taylor and Francis Group, 2015. 516 p.

3. Сыромуков С.В., Степнов В.В. Генератор нейтронов. - Полезная модель к патенту РФ № 166092 от 03.06.2016.

4. Syromukov S.V., Stepnov V.V., Dobrov R.V., Sysoev V.I., Mel'nik A.V., Bogatikov K.V., Starostin A.N., Letichevskii R.D. // Atomic Energy. 2015. V. 119. P. 68-71.

5. Sevast'yanov V.D., Kovalenko O.I., Orlov A.V., Shibaev R.M., Obudovskii S.Yu., Portnov B.D., Batyunin A.V., Kashchuk Yu.A. // Measur. Tech. 2016. V. 59. P. 994-1001.

6. Syromukov S.V. // Atomic Energy. 2018. V. 123. P. 267-274.

7. Литяев В.М., Ульяненко С.Е., Корякин С.Н., Бровин А.И., Сыромуков С.В., Боголюбов Е.П., Рыжков В.И., Горбушин Н.Г. Аппарат для дистанционной нейтронной терапии. Патент РФ № 2526244 от 28.08.2013.

8. Agostinelli S., Allison J., Amako K., Apostolakis J., Araujo H., Arce P., Asai M., Axen D., Banerjee S., Barrand G., et al. // Nucl. Instrum. Meth. Phys. Res. Section A. 2003. V. 506. P. 250-303.

9. Bunz F., Dutriaux A., Lengauer C., Waldman T., Zhou S., Brown J.P., Sedivy J.M., Kinzler K.W., Vogelstein B. // Science. 1998. V. 282. P. 1497-1501.

10. Tikhomirov A.S., Lin C.Y., Volodina Y.L., Dezhenkova L.G., Tatarskiy V.V., Schols D., Shtil A.A., Kaur P., Chueh P.J., Shchekotikhin A.E. // Eur. J. Med. Chem. 2018. V. 148. P. 128-139.

11. Nadysev G.Y., Tikhomirov A.S., Lin M.-H., Yang Y.-T., Dezhenkova L.G., Chen H.-Y., Kaluzhny D.N., Schols D., Shtil A.A., Shchekotikhin A.E., et al. // Eur. J. Med. Chem. 2018. V. 143. P. 1553-1562.

12. Volodina Y.L., Dezhenkova L.G., Tikhomirov A.S., Tatarskiy V.V., Kaluzhny D.N., Moisenovich A.M., Moisenovich M.M., Isagulieva A.K., Shtil A.A., Tsvetkov V.B., et al. // Eur. J. Med. Chem. 2019. V. 165. P. 31-45.

Размещено на Allbest.ru