Оцінка потенційної противірусної активності похідних на моделі "фаг-бактерія"

Размещено на http://www.allbest.ru/

Оцінка потенційної противірусної активності похідних N-бензімідазол-сульфонаміду на моделі «фаг-бактерія»

О.Ю. Зінченко, Т.О. Філіпова, Л.Г. Клочко Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова,

Анотація

Мета. Визначення потенційної противірусної активності похідних N-бензімідазол-сульфонаміду на моделі «фаг-бактерія». Методи. У роботі використано 5 похідних N-бензімідазол-сульфонаміду. Методом серійних розведень визначено їх антибактеріальні властивості щодо Staphylococcus aureus АТСС 25923 та Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853. Модифікованим методом Граціа визначено вплив похідних на літичну активність комерційних фагів, специфічних щодо бактерій тест-штамів. Результати. У досліджених сполук виявлено здатність до пригнічення росту Staphylococcus aureus АТСС 25923 на 41-45% та Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 - до 35% у середовищі Luria-Bertani. N-(1H-бензімідазол-2-іл)-бензенсульфонамід та М(1Н-бензімідазол-2-іл)-4-бромо-бензенсульфонамід знижували літичну активність як стафілококового, так і псевдомонадного фагів. N-(1H-бен- зімідазол-2-іл)-4-нітро-бензенсульфонамід викликав збільшення кількості негативних колоній стафілококового та псевдомонадного фагів на 28,4 та 35,5% відповідно. Висновок. N-(1H-бензімідазол-2-іл)-бензенсульфонамід та М(1Н-бензімідазол-2-іл)-4-бромо-бензенсульфонамід володіють потенційною противірусною активністю щодо ДНК-вірусів. М(1Н-бензіміда- зол-2-іл)-4-нітро-бензенсульфонамід посилює продукцію фагових часток.

Ключові слова: противірусна активність, похідні N-бензімідазол-сульфонаміду, фаг, літична активність.

Реферат

Цель. Определение потенциальной противовирусной активности производных N-бензимидазол-сульфонамида на модели «фаг-бактерия». Методы. В работе использованы 5 производных N-бензимидазол-сульфонамида. Методом серийных разведений определены их антибактериальные свойства в отношении Staphylococcus aureus АТСС 25923 и Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853. Модифицированным методом Грациа определено влияние производных на литическую активность коммерческих фагов, специфических по отношению к тест-штаммам. Результаты. У исследованных соединений выявлена способность к подавлению роста Staphylococcus aureus АТСС 25923 на 41-45% и Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 - до 35% в среде Luria-Bertani. N-(1Н-бензимидазол-2-ил)-бензенсульфонамид и N-(1H-бенз- имидазол-2-ил)-4-бромо-бензенсульфонамид снижали литическую активность как стафилококкового, так и псевдомонадного фагов. N-(1H^m- имидазол-2-ил)-4-нитро-бензенсульфонамид вызывал увеличение количества негативных колоний стафилококкового и псевдомонадного фагов на 28,4 и 35,5% соответственно. Вывод. N-(1Н-бензимидазол-2-ил)-бензенсульфонамид и N-(1Н-бензимидазол-2-ил)-4-бромо-бензенсульфонамид обладают потенциальной противовирусной активностью в отношении ДНК-вирусов. N-(1H-бензимидазол-2-ил)-4-нитро-бензенсульфонамид усиливает продукцию фаговых частиц.

Ключевые слова: противовирусная активность, производные N-бензимидазол-сульфонамида, фаг, литическая активность.

Summary

Aim. Evaluation of the potential antiviral activity of N-benzimidazole-sulfonamide derivatives in the phage-sensitive bacterium model. Methods. 5 derivatives of N-benzimidazole-sulfonamide were used in the study. Antibacterial properties of studied compounds were evaluated by serial dilution method towards Staphylococcus aureus АТСС 25923 and Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853. The influence of derivatives on the lytic activity of commercial phages specific towards test-strains was detected by modified Grazia method. Results. Studied compounds showed the ability to inhibit the growth of Staphylococcus aureus АТСС 25923 by 41-45% and Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 - up to 35% in Luria-Ber- tani broth. N-(1H-benzimidazole-2-yl)-benzensulfonamide andN-(1H-benzimida- zole-2-yl)-4-bromo-benzensulfonamide decreased the lytic activity of both staphylococcal and pseudomonal phages. N-(1H-benzimidazole-2-yl)-4-nitro-benzensul- fonamide caused the increase of negative colonies number of staphylococcal and pseudomonalphage by 28.4 и 35.5 %o respectively. Conclusion. N-(1H-benzimida- zole-2-yl)-benzensulfonamide and N-(1H-benzimidazole-2-yl)-4-bromo-benzen- sulfonamide have potential antiviral activity against DNA viruses. N-(1H-benzim- idazole-2-yl)-4-nitro-benzensulfonamide boosts the production of phage particles.

Key words: antiviral activity, N-benzimidazole-sulfonamide derivatives, phage, lytic activity.

Етіотропна терапія вірусних інфекцій на сьогодні залишається одним з викликів сучасній медицині. За останні десятиріччя досягнуто значних успіхів у лікуванні ВІЛ-інфекції та герпесвірусних інфекцій. Однак для широкого кола захворювань, викликаних вірусами, доступною залишається переважно симптоматична терапія, що наочно продемонструвала пандемія, викликана SARS-CoV-2. Поширеним підходом до розробки противірусних засобів є ретаргетинг існуючих лікарських препаратів, який не завжди забезпечує ефективність та безпечність лікування. Отже, пошук нових антивірусних агентів не втрачає своєї актуальності.

Скринінг сполук щодо їх здатності пригнічувати активність вірусів є досить складною задачею, вимагає задіяння значних ресурсів та несе потенційну небезпеку для дослідника. У такій ситуації раціональним є винайдення безпечних, швидких та недорогих моделей. Низкою авторів для первинного тестування нових речовин запропонована система «бактеріофаг-бактерія» [5, 6, 10, 12-15].

Сульфонаміди складають важливий клас лікарських засобів, які належать до кількох типів фармакологічних агентів, що володіють антибактеріальною, антикарбоангідразною, сечогінною, гіпоглікемічною, антитиреоїд- ною та протипухлинною активністю. У лікуванні інфекційних захворювань сульфонаміди традиційно застосовуються як антибактеріальні агенти. Тим не менш, було встановлено, що велика кількість структурно нових сульфаніламідних похідних демонструє суттєву противірусну активність in vitro та in vivo. Деякі клінічно застосовувані інгібітори ВІЛ-протеази (ампренавір) або сполуки, що знаходяться на стадії клінічних випробувань (тикранавір, TMC-126, TMC-114 та ін.) містять сульфаніламідні компоненти в своїх молекулах [8]. Також є дані про декілька ненуклеозидних інгібіторів зворотної транскриптази ВІЛ або інгібіторів інтегрази ВІЛ, що містять сульфаніламідні групи. Інший підхід до інгібування репродукції ретровірусів, включаючи ВІЛ, спрямований на викид йонів цинку з так званих вірусних цинкових пальців, що має наслідком гальмування реплікації вірусу без виникнення мутацій, які могли б призвести до фенотипової стійкості до лікарських засобів. Більшість сполук з антивірусною активністю, що мають цей механізм дії, містять у своїх молекулах первинні сульфаніламідні групи. Нарешті, деякі низькомолекулярні антагоністи хемокінів, що діють як інгібітори проникнення ВІЛ, також мають сульфаніламідні функціональні групи у своїй структурі [19]. Отже, розглядати сульфонаміди як сполуки з потенційною противірусною активністю є цілком обґрунтованим.

Метою даної роботи було визначення потенційної антивірусної активності похідних N-бензімідазол-сульфонаміду на моделі «фаг-бактерія».

Матеріали та методи дослідження

У роботі досліджували активність 5 сполук, похідних N-бензіміда- зол-сульфонаміду, будову яких наведено в табл. 1.

Сполуки синтезовані в Біотехнологічному науково-навчальному центрі Одеського національного університету імені І.І. Мечникова. Їх чистоту оцінювали з використанням хроматографічних методів, ПМР-спектроскопії та мас-спектрометрії. Досліджені похідні представляли собою кристалічні субстанції білого кольору без запаху, нерозчинні у воді.

Протифагову дію досліджуваних сполук перевіряли на модельних системах Staphylococcus aureus АТСС 25923 - полівалентний стафілококовий бактеріофаг та Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 - псевдомонадний бактеріофаг. Штами бактерій отримані з музею культур мікроорганізмів Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України.

В експериментах використовували комерційні препарати бактеріофагів - «Бактеріофаг стафілококовий» та «Бактеріофаг псевдомонас аеругіноза» (НПО «Мікроген», Росія).

Для того, щоб виключити пригнічення росту бактеріальних культур досліджуваними похідними попередньо оцінювали антибактеріальну активність останніх.

Таблиця 1 Будова досліджуваних похідних N-бензімідазол-сульфонаміду

З цією метою готували розчини сполук у диметилсульфоксиді концентрацією 4 мМ, розводили середовищем Luria-Bertani (LB) [17] до робочих концентрацій 0,4; 4; 40; та 80 мкМ. Аналіз літератури щодо скринінгу сульфонамідів показав, що у багатьох дослідженнях для визначення активності нових похідних використовуються десятикратні розведення [4, 9, 16], тому у наших дослідах використано саме такі концентрації. Розчини досліджуваних похідних стерилізували автоклавуванням при 1 атм. Добові культури бактерій на скошеному МПА змивали стерильним фізіологічним розчином, доводили щільність отриманої суспензії до 0,5 ОД за МакФарландом та використовували для інокуляції. У кожну лунку 24-лункового полістироло- вого планшету (Greiner bio-one Cellstar, Австрія) вносили 1 мл стерильного середовища LB, що містило досліджувані сполуки в робочих концентраціях і додавали 50 мкл інокуляту відповідної культури. Як контроль використовували середовище LB, інокульоване тест-культурою без досліджуваних сполук. Кожну концентрацію досліджували у трьох повторах. Планшети інку бували при 37 ° С протягом 24 год та вимірювали оптичну щільність на планшетному спектрофотометрі «Quant» BioTek (США) при А,=600 нм.

Протифагову активність визначали модифікованим методом титрування бактеріофага за Граціа (метод агарових шарів) [1]. Готували напіврідкий (0,7%) м'ясо-пептонний агар (МПА) та 1,5% МПА. Напіврідкий агар розливали у пробірки по 1 мл. Середовища стерилізували автоклавуванням при 1 атм.

У досліді використовували пластикові чашки Петрі діаметром 60 мм. У чашки заливали 1,5% МПА, підсушували. Готували розведення досліджуваних речовин у стерильному фізіологічному розчині (використовували концентрацію 40 мкМ в 1 мл, за якої не спостерігалося значного пригнічення росту тест-культури). До розчинів додавали 0,1 мл розведення препарату бактеріофага, що містило 1,6х10⁹ бляшкоутворювальних одиниць (БУО) в 1 мл. Така концентрація фага була визначена як оптимальна при попередньому титруванні. Суміш інкубували годину в термостаті при температурі 37 °С.

Напіврідкий 0,7% МПА для поверхневого шару розплавляли на водяній лазні, охолоджували до 46 °С, додавали 0,1 мл добової бульйонної культури S. aureus або P aeruginosa та 0,1 мл суспензії фагових часток, проін- кубованих з похідними N-бензімідазол-сульфонаміду. Середовище ретельно перемішували та виливали на поверхню МПА в чашках Петрі, рівномірно розподіляючи його по поверхні агару. Після застигання поверхневого шару агару чашки перевертали і залишали у термостаті при 37 °С на 24 год. Кожну сполуку тестували в трьох повторах. Дослід супроводжували двома контроля- ми: контроль активності бактеріофага - без додавання досліджуваних сполук, контроль росту бактеріальної культури - без додавання фага.

Антифагову активність (А) виражали у відсотках інактивації, які підраховували за формулою:

А= (1 - No/Nk)x100%,

де No - кількість БУО у досліді, Nk - кількість БУО у контролі.

Статистичну значущість відмінностей визначали за непараметричним критерієм Мана-Уітні, оцінюючи вірогідність отриманих результатів на рівні значущості не менше 95% (р < 0,05).

Результати та їх обговорення

Проведені дослідження показали, що ріст S. aureus АТСС 25923 пригнічувався усіма сполуками, однак повного пригнічення не спостерігали. При цьому для більшості досліджених похідних виявлено зворотну залежність доза-ефект (рис. 1). Найбільш виражений антибактеріальний ефект спостерігали за присутності ^(Ш-бензімідазол-2-іл)-4-метилбензенсульфонаміду та ^(Ш-бензімідазол-2-іл)-4-бромо-бензенсульфонаміду, що складав 13,945,4% та 27,5-41,9%, відповідно. Тим не менш, у максимальній концентрації сполука V спричиняла посилення росту.

Щодо P. aeruginosa АТСС 27853 інгібувальний ефект похідних N-бензімідазол-сульфонаміду також не завжди був дозозалежним (рис. 2). Так, ^(Ш-бензімідазол-2-іл)-4-хлоробензенсульфонамід (сполука І) викликав пригнічення росту на 37,9% лише за концентрації 4 мкМ, при збільшенні концентрації спостерігалася стимуляція росту культури.

Рис. 1. Накопичення біомаси тест-штаму S. aureus АТСС 25923 за присутності похідних N-бензімідазол-сульфонаміду Примітка: I - ^(Ш-бензімідазол-2-іл)-4-хлоробензенсульфонамід, II-N-(1H- бензімідазол-2-іл)-4-нітро-бензенсульфонамід, III - ^(Ш-бензімідазол-2-іл)- бензенсульфонамід, ^-М-(Ш-бензімідазол-2-іл)-4-метилбензенсульфонамід, V - N-(1H- бензімідазол-2-іл)-4-бромо-бензенсульфонамід, * - різниця вірогідна у порівнянні з контролем (р < 0,05)

Подібний ефект відзначено також для (Ш-бензімідазол-2-іл)-4-метилбензенсульфонаміду (сполука IV) та №(Ш-бензімідазол-2-іл)-4-бромо-бензенсульфонаміду (сполука V). Стійке пригнічення росту культури, яке не перевищувало 35%, викликали (Ш-бензімідазол-2-іл)-4-нітро-бензенсульфонамід (сполука II) та (Ш-бензімідазол-2-іл)-бензенсульфонамід (сполука III) в усіх використаних концентраціях.

Для визначення впливу на літичну активність фагів досліджені сполуки використовували у концентрації 40 мкМ, за якої не спостерігали значного пригнічувального ефекту щодо бактерій тест-штамів. Пригнічувальну дію щодо стафілококового бактеріофага виявлено у №(Ш-бензімідазол-2-іл)-бензенсульфонаміду (сполука III) (рис. 3). ^(Ш-бензімідазол-2-іл)-4-метил- бензенсульфонаміду (сполука IV) та №(Ш-бензімідазол-2-іл)-4-бромо-бензенсульфонаміду (сполука V), які викликали інактивацію 29,5, 21,1 та 31,7% фагових часток (рис. 3). Натомість, присутність сполуки ІІ призводила до збільшення кількості негативних колоній на 28,4% у порівнянні з контролем.

Рис. 2. Накопичення біомаси тест-штаму P aeruginosa АТСС 27853 за присутності похідних N-бензімідазол-сульфонаміду

Активність псевдомонадного бактеріофага також пригнічувалася ^(Ш-бензімідазол-2-іл)-бензенсульфонамідом (сполука III) та N-(1H- бензімідазол-2-іл)-4-бромо-бензенсульфонамідом (сполука V) на 17,5 та 14,6% відповідно. Однак, на відміну від попереднього досліду присутність N-(1H- бензімідазол-2-іл)-4-метилбензенсульфонаміду (сполука IV) стимулювала утворення негативних колоній на 21,0%. ^(Ш-бензімідазол-2-іл)-4-нітро- бензенсульфонамід (сполука ІІ) також стимулював утворення негативних колоній (на 35,5%).

Підвищення літичної активності бактеріофагів, вірогідно, є прикладом так званого синергізму фаг-антибіотик, описаного у 2007 році Comeau зі співавт. та детально розглянутого Gordillo Altamirano зі співавт. [11], які показали, що сублетальні концентрації антибіотиків можуть підвищувати продукування літичних фагів бактеріальними клітинами.

Cock зі співавт. продемонстрували кореляцію між противірусною активністю екстрактів лікарських рослин щодо вірусу грипу на культурі клітин MDCK, герпесвірусів, папіломавірусів та на моделі фаг MS2-бактерія, довівши доцільність використання таких моделей для первинного скринінгу потенційних противірусних сполук [5].

Рис. 3. Вплив досліджуваних сполук на літичну активність стафілококового бактеріофага

Рис. 4. Вплив досліджуваних сполук на активність псевдомонадного бактеріофага

Фаг MS2 належить до РНК-вмісних вірусів, у той час як відомі фаги S. aureus та P aeruginosa належать до порядку Caudovirales, що є ДНК-вмісними фагами [2, 3, 7, 18]. Збудники вірусних інфекцій людини мають переважно РНК-геном, тим не менш, ряд етіологічних агентів небезпечних захворювань, такі як герпесвіруси, папілома- та поліомавіруси, поксвіруси, мають ДНК-геном. Отже, використання запропонованої моделі може бути доцільним при визначенні активності нових молекул щодо цих збудників.

Таким чином, у досліджених сполук виявлено антибактеріальну активність як щодо S. aureus АТСС 25923, так і P. aeruginosa АТСС 27853. При цьому повного пригнічення росту не відбувалося.

(Ш-бензімідазол-2-іл)-бензенсульфонамід та ^(Ш-бензімідазол- 2-іл)-4-бромо-бензенсульфонамід знижували літичну активність як стафілококового, так і псевдомонадного фагів і можуть розглядатися як потенційні противірусні агенти, активні щодо ДНК-вірусів.

(Ш-бензімідазол-2-іл)-4-нітро-бензенсульфонамід викликав збільшення кількості негативних колоній стафілококового та псевдомонадного фагів на 28,4 та 35,5%, відповідно, що може свідчити про синергізм цих сполук з бактеріофагами.

бактеріофаг staphylococcus літичний похідна

Список використаної літератури

1. Черкес Ф.К., Богоявленская Л.Б., Бельская Н.А. Микробиология / Ф.К. Черкес, Л.Б. Богоявленская, Н.А. Бельская - М.: «Медицина», 1986. - 512 с.

2. Abatвngelo V. Broad-range lytic bacteriophages that kill Staphylococcus aureus local field strains / V. Abatвngelo, N. Peressutti Bacci, C.A. Boncompain, A.F. Amadio et al. // PloS One. - 2017. - Vol. 12(7).-P e0181671.

3. Azam A.H. Peculiarities of Staphylococcus aureus phages and their possible application in phage therapy / A. H. Azam, Y. Tanji //Applied Microbiology and Biotechnology. - 2019. - Vol. 4. - P 11-22.

4. Becheker I. The Antibacterial and Cytotoxic Activities of Four New Sulfonamides Against Clinical Gram-Negative Bacteria / I. Becheker, H. Berredjerm, W. Boufas, B. Malika // Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res. - 2016. - Vol. 39. - P 125-133.

5. Cock I. A modified MS2 bacteriophage plaque reduction assay for the rapid screening of antiviral plant extracts / I. Cock, F. R. Kalt // Pharmacognosy Res. - 2010. - Vol. 2(4). - P 221-228.

6. De Clercq E. Highlights in the discovery of antiviral drugs: A personal retrospective / E. De Clercq // J Med Chem. - 2010. - Vol. 53. - P. 1438-1452.

7. DeghorainM. The Staphylococci phages family: an overview / M. Degho- rain, L. Van Melderen // Viruses. - 2012. - Vol. 4(12). - P 3316-35.

8. Fangcheng H. Synthesis, Antiviral Activity, and Mechanisms of Purine Nucleoside Derivatives Containing a Sulfonamide Moiety / H. Fangcheng, S. Jing, W. Yanju, W. Shaobo, C. Jixiang, G. Xiuhai, S. Baoan, H. Deyu // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2019. - Vol. 67 (31). - P 8459-8467.

9. Genз Y Antimicrobial activity of some sulfonamide derivatives on clinical isolates of Staphylococus aureus / Y. Genз, R. Ozkanca, Y Bekdemir // Ann Clin Microbiol Antimicrob. - 2008. - Vol. 20. - P 7-17.

10. Gerhardts A. Testing linen disinfection procedures in practice with phage-charged-bioindicators / A. Gerhardts, H. Mucha, D. Hцfer // International Journal of Health Care Quality Assurance. - 2012. - Vol. 25, Iss. 6. - P 519-531.

11. Gordillo Altamirano F.L. Phage Therapy in the Postantibiotic Era/ F.L. Gordillo Altamirano, J.J.B. Gordillo Altamirano, J.J. Barr // Clinical Microbiology Reviews. - 2019. - Vol. 32(2). - P 1-25.

12. Jassim S.A.A. In vitro Evaluation of the Antiviral Activity of an Extract of Date Palm (Phoenix dactylifera L.) Pits on a Pseudomonas Phage // S.A.A. Jassim,

M. A. Naji // Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. - 2010. - Vol. 7(1). - P 57-62.

13. Lenski R.E. Bacteriaandphage: A model system for the study of the ecology and co-evolution of hosts and parasites / R.E. Lenski, B.R. Levin. - L: The Linnean Society of London, 1985. - P 222-265.

14. LiT.-M. Application of phage-indicator model in evaluation of antiviral drugs in vitro / T.-M. Li, X.-C. Mou, L.Chen,X.-Y.Cao, Y Sun, Z.-Y Yang // Proc. of IEEE International Symposium on IT in Medicine and Education. - 2011. - P. 438-440.

15. Malalasekara L. A preliminary study on application of phage-indicator model in evaluation of antiviral drugs / L. Malalasekara, D. L. Jayaratne // Sri Lanka Association for the Advancement of Science. Proceedings of the 71^st Annual Sessions. - 2015. - Part I. - P 413/D.

16. Oliveira A. New Sulfonamides Derived from Carvacrol: Compounds with High Antibacterial Activity against Resistant Staphylococcus aureus Strains / A. Oliveira, L. Canzian Llanes, I.I. Brighente, R. Nunes et al. // Journal of Biosciences and Medicines. - 2016. - Vol. 04. - P. 105-114.

17. Sezonov G. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth / G. Se- zonov, D. Joseleau-Petit, R. D'Ari // J. Bacteriol. - 2007. - Vol. 189(23). - P. 87468749.

18. Shigehisa R. Characterization of Pseudomonas aeruginosa phage KPP21 belonging to family Podoviridae genus N4-like viruses isolated in Japan / R. Shigehisa, J. Uchiyama, S.-I. Kato, I. Takemura-Uchiyama, K. Yamaguchi, R. Miyata, T. Ujihara, Y. Sakaguchi, N. Okamoto, H. Shimakura, M. Daibata, M. Sakaguchi, S. Matsuzaki // Microbiol Immunol. - 2016. - Vol. 60. - P. 64-67.

19. Supuran C.T Antiviral sulfonamide derivatives / C. T. Supuran, A. In- nocenti, A. Mastrolorenzo, A. Scozzafava // Mini Rev Med Chem. - 2004. - Vol. 4(2). - Р 189-200.

Размещено на Allbest.ru