Механизмы защиты сердца синтетическим агонистом рецепторов галанина при повреждении хроническим введением доксорубицина
Ключевые причины кардиотоксичности. Синтезирование лекарственных препаратов для борьбы с кардиомиопатией и сердечной недостаточностью. Исследование действия галанина на кардиомиоциты при ишемическом и реперфузионном (И/Р) повреждении клеток сердца.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | статья |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 28.08.2020 |
| Размер файла | 846,6 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://allbest.ru
1Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии Минздрава России
2Научно-клинический центр оториноларингологии ФМБА России
Механизмы защиты сердца синтетическим агонистом рецепторов галанина при повреждении хроническим введением доксорубицина
И.М. Студнева1, О.М. Веселова1,
A.A. Бахтин2, Г.Г. Коновалова1,
В.З. Ланкин1, О.И. Писаренко1
Москва, Россия
Введение
Снижение выработки энергии кардиомиоцитами, вызванное нарушением функций митохондрий или токсическим воздействием лекарственных препаратов, может приводить к хроническому повреждению миокарда. Доксорубицин (Докс) - противоопухолевое средство антрациклинового ряда - способен вызывать развитие кардиомиопатии (КМП) и сердечной недостаточности, что ограничивает его использование в онкологической практике [1].
Кардиотоксичность, инициируемая Докс, является многофакторным процессом, который приводит к гибели кардиомиоцитов и эндотелиальных клеток [2]. Ключевые причины кардиотоксичности Докс - нарушения окислительного фосфорилирования и генерация активных форм кислорода (АФК), вызывающих перекисное окисление липидов (ПОЛ) [3].
Оптимизация режимов введения Докс и применение его липосомальных форм не устраняют высокую кардиотоксичность этого препарата [4]. В связи с этим актуальной остается разработка лекарственных средств, предотвращающих или ослабляющих повреждения сердца, вызванные Докс.
Ранее нами было показано, что экзогенные N-концевые фрагменты галанина (2-11) и (2-15), связываясь с рецептором GalR2, оказывают защитное действие на кардиомиоциты при ишемическом и реперфузионном (И/Р) повреждении. Оно обусловлено снижением образования супероксидных радикалов в митохондриях и запуском сигнальных каскадов, приводящих к уменьшению гибели клеток от апоптоза и некроза [5, 6].
Впоследствии мы синтезировали ряд пептидных аналогов фрагментов галанина (2-11) и (2-15) с сохранением фармакофорных аминокислотных остатков, ответственных за связывание с рецептором GalR2. Тестирование этих пептидов на моделях И/Р повреждения сердца выявило их кардиотропные свойства [7].
Наиболее эффективной оказалась химерная молекула, представляющая последовательность галанина (2-13), дополненную природным дипептидом карнозином, H-Trp-Thr- Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-ЯAla- His-OH (G) [8]. Пептид G улучшал функцию сердца крыс, интегрированность мембран и энергетическое состояние кардиомиоцитов при хроническом повреждении миокарда Докс [9], что указывало на его влияние на метаболизм миокарда. кардиотоксичность галанин ишемический сердечный
Однако механизмы действия этого соединения остаются малоизученными. В связи с этим цель настоящей работы заключалась в исследовании действия пептида G на менее изученные мишени Докс - активность антиоксидантных ферментов и показатели азотистого и углеводного обмена в сердце крыс при кардиомиопатии, моделированной введением Докс. Кардиотоксическое действие Докс характеризовали изменениями активности креатинкиназы-МВ (КК-МВ) в крови, уровнем окислительного стресса в сердце и плазме крови животных и морфологическим состоянием миокарда.
Экспериментальная часть
Дизайн эксперимента. Опыты выполнены на крысах-самцах линии Вистар весом 280-300 г, полученных из филиала «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России.
Для моделирования кардиомиопатии использовали хроническое введение Докс, описанное в работе [9]. Животные были разделены на четыре группы.
Контрольная группа (К) - внутрибрюшинное введение физиологического раствора (1 мл/кг веса еженедельно в течение 8 недель); Докс (Д) - внутрибрюшинное введение Докс (1 мг/кг веса еженедельно в течение 8 недель); Докс + пептид G (Д + G) - внутрибрюшинное введение Докс (1 мг/кг веса еженедельно в течение 8 недель) и подкожное введение пептида G (50 нмоль/кг веса ежедневно в течение 8 недель); пептид G (G) - подкожное введение G (50 нмоль/кг веса ежедневно в течение 8 недель).
Перед проведением исследования (исходное состояние) и после 8-недельного эксперимента животных взвешивали, в плазме крови определяли активность креатинкиназы-МВ (КК-МВ) и содержание тиобарбитуратных кислотно-активных продуктов (ТБКАП).
Показатели функции сердца оценивали методом эхокардиографии (ЭхоКГ). По окончании 8-недельного эксперимента у наркотизированных животных каждой группы (уретан, 120 мг/кг) извлекали сердца для определения содержания метаболитов и ТБКАП, активности антиоксидантных ферментов и морфологического исследования.
Модифицированный N-концевой фрагмент галанина G. Пептид G (H-Trp- Thr -Leu -Asn -Ser -Ala -Gly-Tyr- Leu- Leu- Gly- Pro- ЯAla- His-OH, молекулярная масса 1499.7) получен путем ступенчатого твердофазного синтеза с использованием Fmoc-методологии [7].
Пептид G очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе, его структура охарактеризована с помощью :Н-ЯМР- спектроскопии и MALDI-масс-спектрометрии [8].
Трансторакальная ЭхоКГ. Применена высокочастотная ультразвуковая система Vevo 1100 Visual Sonic (FUJILM, Нидерланды) с линейным датчиком 13-24 МГц и максимальной глубиной лоцирования 30 мм. Исследование проводили у крыс под наркозом (Золетил 100, Virbac Sante Animale, Франция, 5 мг/кг) с использованием парастернального доступа по короткой и длинной осям.
В B-режиме измеряли диастолические и систолические размеры левого желудочка (ЛЖ), на их основе рассчитывали параметры ЛЖ в диастоле и систоле, а также фракции выброса (ФВ) и укорочения (ФУ).
Определение содержания метаболитов в ткани сердца. Часть ткани сердец, замороженных в жидком азоте, гомогенизировали в холодной 6% HClO4 (10 мл/г ткани) в гомогенизаторе Ultra-Turrax T-25 (IKA-Labortechnik, Германия).
Белки осаждали центрифугированием (центрифуга Sorvall RT1, Thermo Fisher Scientific, США) при 2800g в течение 10 мин при 40С. Супернатанты нейтрализовали 5 М К2СО3 до рН 7.4. Осадок KOlO4 отделяли центрифугированием в тех же условиях. Безбелковые экстракты хранили при -20°С до определения метаболитов.
Сухой вес гомогенизированной ткани определяли после высушивания образцов в течение суток при 1100С. Содержание адениннуклеотидов (АТР, ADP и АМР), фосфокреатина (ФКр), креатина (Кр), глюкозы, лактата, глутаминовой и аспарагиновой кислот, аланина и аммиака в экстрактах определяли энзиматическими методами [10] с помощью спектрофотометра Shimadzu UV-1800 (Япония).
Определение активности антиоксидантных ферментов и ТБКАП в сердце. Оставшуюся часть замороженной ткани сердец крыс гомогенизировали в 50 мМ Na-фосфатном буфере рН 7.4 (10 мл/г ткани) при помощи гомогенизатора Ultra-Turrax T-25 (IKA-Labortechnik, Германия) и центрифугировали на центрифуге Sigma 3-16 KL (США) при 1000g и 4 °С в течение 10 мин.
Содержания ТБКАП определяли в гомогенатах, активность Сип-супероксиддисмутазы (Cu,Zn-SOD), каталазы (CAT) и глутатионпероксидазы (GSH-Px) - в супернатантах. Белок в супернатанте определяли по методу Лоури.
Все измерения проводили на спектрофотометре Shimadzu 2600 (Япония). Содержание ТБКАП определяли в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (2ТБК) при X = 532 нм [11].
Активность Cu,Zn-SOD определяли по подавлению скорости восстановления нитросинего тетразолия при генерации супероксидного анион-радикала в процессе окисления ксантина ксантиноксидазой при X = 560 нм [12].
Активность САT измеряли по скорости расходования пероксида водорода (Н2О2) при 200С в течение 1 мин, принимая коэффициент молярной экстинкции Н2О2 равным 43.6 М-1см-1 [13].
Активность GSH-Px определяли по скорости окисления NADPH в сопряженной глутатионредуктазной системе при X = 340 нм. В качестве субстрата использовали Н2О2. Реакцию проводили в присутствии 3 мМ азида натрия для ингибирования CAT [14].
Оценка повреждения клеточных мембран и концентрации ТБКАП в плазме. Активность КК-МВ определяли на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Япония) при X = 340 нм, используя наборы фирмы BioSystems. Концентрацию ТБКАП в плазме определяли по образованию окрашенного комплекса в реакции с 2ТБК, который экстрагировали из реакционной смеси бутанолом [15].
Морфологическое исследование. Сердца крыс каждой группы фиксировали в 10% растворе забуференного формалина (рН 7.4) в течение 24 ч. Из верхней части ЛЖ вырезали слайс толщиной 2 мм, перпендикулярный длиннику органа, содержащий свободную стенку ЛЖ.
Затем образцы обрабатывали в спиртах возрастающей концентрации (70-100%), ксилоле и заливали в парафин.
Далее формировали парафиновые блоки с последующим изготовлением срезов толщиной 5-7 мкм. После высушивания срезов в горизонтальном положении проводили обзорную окраску гематоксилином и эозином (ГЭ), а также окрашивание гематоксилин-основной фуксин-пикриновой кислотой (ГОФП) для выявления фуксинофильных кардиомиоцитов [16]. Использовали оптический микроскоп Leica DM2500 (Германия).
Статистическая обработка результатов. Использовали пакет программ SigmaPlot 11.2 (SysStat, США). Результаты представляли как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (М ± m). Различия между группами подтверждены статистически с применением дисперсионного анализа (ANOVA). При сравнении нескольких групп с контролем использовали t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони. Статистически значимыми отличия считали при Р < 0.05.
Результаты
Влияние пептида G на кардиотоксичность и окислительный стресс. ЭхоКГ-исследование животных контрольной группы не выявило изменений в частоте сокращений сердца и показателях сократимости ЛЖ по сравнению с исходным состоянием спустя 8 недель наблюдения.
При введении Докс у животных развивалась КМП - конечно-систолический размер (КСР) ЛЖ был увеличен, а фракция укорочения (ФУ) и фракция выброса (ФВ) были снижены до 67 и 69% соответственно (рис. 1А-В). Совместное введение Докс и пептида G статистически значимо уменьшало КСР ЛЖ и увеличивало ФУ и ФВ по сравнению с этими показателями в группе Д.
Развитие КМП под действием Докс сопровождалось активацией ПОЛ и повреждением мембран кардиомиоцитов. После 8 недель исследования содержание ТБКАП в сердце и плазме крови крыс, получавших Докс, было выше, чем у животных контрольной группы (рис. 1Г, Д).
Совместное введение пептида G и Докс значимо снижало этот показатель.
Рис. 1. Показатели ЭхоКГ, окислительного стресса и повреждения мембран кардиомиоцитов в исследуемых группах. А - конечно-систолический размер (КСР) ЛЖ. Б - фракция укорочения (ФУ = (КДР - КСР)/КДРх 100%), где КСР и КДР - конечно-систолический и конечно-диастолический размеры ЛЖ. В - фракция выброса (ФВ = (КДО - КСО/КДОх 100%)), где КДО и КСО - конечно-диастолический и конечно-систолический объемы ЛЖ. Г - содержание тиобарбитуратных кислотно-активных продуктов (ТБКАП) в сердце. Д - концентрация ТБКАП в плазме крови. Е - активность креатинкиназы-МВ (КК-МВ) в плазме крови. ИС - исходное состояние, К - контроль, Д - доксорубицин, Д + G - доксорубицин + пептид G, G - пептид G. Данные представлены как M ± m (n = 12). P < 0.05 от: * ИС, # К, л Д, + Д + G
В конце исследования активность КК-МВ в группе Д была почти в 3 раза выше, чем в контроле (рис. 1Е). Введение пептида G одновременно с Докс снижало этот показатель практически до значения в контроле.
Под действием одного пептида G изменений в ЭхоКГ- показателях, содержании ТБКАП в сердце и плазме и активности КК-МВ в плазме крови не происходило. Таким образом, пептид G снижал повреждающее действие Докс, уменьшая окислительный стресс и повреждения мембран кардиомиоцитов.
Влияние пептида G на морфологические изменения в миокарде. В контроле при окрашивании ГЭ отмечали небольшое полнокровие и умеренный стаз эритроцитов в сосудах капиллярного типа (рис. 2A).
При окраске по ГОФП очаги фуксинофилии не обнаружены, что косвенно свидетельствует об отсутствии контрактуры и ишемии миокарда [17]. В группе Д в большинстве случаев наблюдался выраженный стаз эритроцитов в капиллярах, а также полнокровие.
При окрашивании по ГОФП в половине случаев наблюдали множественные очаги фуксинофилии кардиомиоцитов, носящие как диффузный, так и очаговый характер (рис. 2Б).
В группе Д + G лишь в одном случае на фоне выраженного стаза эритроцитов и полнокровия выявлены единичные кардиомиоциты с фуксинофилией (рис. 2В).
В большинстве сердец животных группы G очаги фуксинофилии не обнаружены. При введении одного пептида G наблюдали незначительный стаз эритроцитов, как и в контрольной группе. При окрашивании ГОФП единичные фуксинофильные кардиомиоциты обнаружены лишь в одном случае. У основной части животных группы G очаги фуксинофилии кардиомиоцитов не выявлены (рис. 2Г).
Рис. 2. Влияние пептида G на морфологические изменения сердца крыс, получавших Докс. А - контроль, ГЭ, Х200. Незначительное полнокровие и стаз эритроцитов. Б - группа Докс, ГОФП, Х200. Обширные очаги фуксинофилии кардиомиоцитов. В - группа Д + G, ГОФП, Х200. Группы единичных кардиомиоцитов, проявляющих цитоплазматическую фуксинофилию. Г - группа G, ГОФП, Х200. Незначительный стаз эритроцитов, отсутствие фуксинофильных кардиомиоцитов
Таким образом, введение пептида G снижало морфологические изменения в сердце крыс, вызванные воздействием Докс.
Влияние пептида G на активность антиоксидантных ферментов сердца. Отмечено, что действие Докс приводит к снижению активности GSH-Px, появлению тенденции к уменьшению активности Cu,Zn-SOD и увеличению активности CAT по сравнению с контролем (табл. 1).
Таблица 1. Влияние Докс и пептида G на активность антиоксидантных ферментов в сердце крыс после 8-недельного исследования
|
Группа крыс |
Cu,Zn-SOD |
CAT |
GSH-Px |
|
|
Контроль |
220.75 ± 17.92 |
16.73 ± 0.43 |
0.21 ± 0.01 |
|
|
Докс |
165.50 ± 22.77 |
21.50 ± 0.50* |
0.16 ± 0.01* |
|
|
Докс + G |
259.64 ± 13.78# |
23.67 ± 1.49* |
0.20 ± 0.01# |
|
|
G |
227.55 ± 19.31 |
19.13 ± 1.08 |
0.19 ± 0.01 |
Примечание. Данные представлены как М + m (n = 6) и выражены в ед. активности/мг белка. P < 0.05 от: * контроля; # Докс + G.
Совместное введение Докс и G статистически значимо увеличивало активность Cu,Zn-SOD и GSH-Px и незначимо CAT (P = 0.082) по сравнению с этими показателями в группе Д. Введение одного пептида G не влияло на активность ферментов.
Влияние пептида G на показатели энергетического обмена сердца. После 8 недель исследования общий пул аденинну- клеотидов (ХАН) в сердце и аденилатный энергетический заряд (АЭЗ) кардиомиоцитов у крыс группы Д были статистически значимо ниже, чем в контроле, за счет уменьшения содержания АТР (табл. 2).
Содержание ФКр в сердцах животных группы Д было в 2 раза ниже. Это стало причиной уменьшения содержания общего креатина (ХКр), поскольку содержание Кр под влиянием Докс не изменялось.
Введение животным пептида G совместно с Докс повышало содержание АТР и АDP, результатом чего было 1.5-кратное увеличение ХАН до значения в контроле.
У животных группы Д + G содержание ФКр и ХКр в миокарде было более высоким, чем в группе Д, и не отличалось значимо от значений в контроле.
Таблица 2. Влияние Докс и пептида G на энергетическое состояние миокарда крыс после 8-недельного исследования
|
Метаболит |
Контроль |
Докс |
Докс + G |
G |
|
|
АТР |
18.84 ± 1.17 |
11.83 ± 1.33* |
16.31 ± 1.32# |
18.91 ± 1.97# |
|
|
АDP |
5.47 ± 0.11 |
5.60 ± 0.35 |
7.28 ± 0.47*# |
6.30 ± 0.33* |
|
|
АМP |
0.92 ± 0.06 |
1.14 ± 0.16 |
1.58 ± 0.15* |
1.50 ± 0.10* |
|
|
ХАН |
25.24 ± 1.22 |
18.56 ± 1.66* |
25.18 ± 1.50# |
25.71 ± 1.13# |
|
|
АЭЗ |
0.86 ± 0.01 |
0.78 ± 0.02* |
0.79 ± 0.01* |
0.85 ± 0.02 |
|
|
ФКр |
22.57 ± 1.52 |
12.08 ± 1.25* |
17.74 ± 1.14*# |
20.66 ± 2.04# |
|
|
Кр |
34.94 ± 2.64 |
38.34 ± 3.80 |
38.24 ± 3.89 |
37.43 ± 2.67 |
|
|
ХКр |
57.51 ± 1.67 |
50.42 ± 2.26* |
55.98 ± 2.12 |
58.09 ± 2.81# |
Примечание. Данные представлены как М ± m (n = 6) и выражены для метаболитов в мкмоль/г сух. веса. ХАН = ATP+ADP+АМР; АЭЗ (аденилатный энергетический заряд) = (АТР+0.5 ADP)/XAH; ХКр = ФКр+Кр. P < 0.05 от: * контроля; # Докс.
Поскольку потери внутриклеточного ХКр связывают с повреждениями сарколеммы [18], более высокое содержание ХКр в группе Д + G указывало на менее существенное повреждение клеточных мембран под действием G.
Влияние пептида G на содержание метаболитов углеводного и азотистого обмена в сердце.
Снижение Я-окисления жирных кислот, увеличение захвата глюкозы миокардом и компенсаторное уси ление анаэробного гликолиза после 8-недельного введения Докс [19] значительно повышали содержание глюкозы и лактата в сердце крыс группы Д по сравнению с контролем (рис. 3А, Б).
Введение пептида G совместно с Докс снижало содержание глюкозы до значения, близкого к контролю, и одновременно уменьшало содержание лактата по сравнению с этим показателем в группе Д.
Рис. 3. Содержание глюкозы (А), лактата (Б), аммиака (NH4+) (Я), глутаминовой кислоты (Глу) (Г), аспарагиновой кислоты (Асп) (Д) и аланина (Ала) (Е) в миокарде крыс после 8 недель исследования. К - контроль, Д - доксору- бицин, Д + G - доксорубицин + пептид G, G - пептид G. Данные представлены как M ± m (n = 6). P < 0.05 от: # К, л Д
При введении только пептида G уровень глюкозы в сердце не отличался статистически значимо от уровня в контрольной группе, а содержание лактата было выше, чем в контроле.
Мы изучили действие Докс и пептида G на содержание в сердце ключевых аминокислот - глутаминовой (Глу), аспарагиновой (Асп), аланина (Ала) и аммиака. Нарушение аэробного энергетического обеспечения сердца под действием Докс увеличивало скорость катаболизма Глу и образования Ала. После 8 недель содержание Глу в группе Д было статистически значимо снижено, а Ала - увеличено вслед ствие трансаминирования гликолитического пиру- вата по сравнению с этими показателями в контроле.
В результате сопряженного трансаминирования Глу и оксалоацетата содержание Асп в группе Д увеличивалось вдвое по сравнению с контролем (рис. 3Г, Д, Е). Под действием пептида G в группе Д + G содержание Глу восстанавливалось, а Ала снижалось. Одновременно уровень Асп в группе Д + G снижался до значений в контроле.
Введение Докс крысам статистически значимо увеличивало содержание аммиака в миокарде по сравнению с контролем (рис. 3В). Под действием пептида G этот показатель снижался до значения в контрольной группе. Таким образом, улучшение энергетического состояния сердца, поврежденного Докс, обусловленное действием пептида G, предотвращало изменения в обмене Глу, Асп и Ала и снижало накопление аммиака в миокарде. Содержание этих азотистых соединений у животных, которым вводили только пептид G, было таким же, как в контрольной группе.
Обсуждение
В нашей работе на модели КМП у крыс, вызванной хроническим введением Докс, показано защитное действие пептида G. Снижение нарушений функции сердца, уменьшение ремоделирования ЛЖ и морфологических изменений при совместном введении Докс и пептида G сопровождались значительным улучшением энергетического обеспечения кардиомиоцитов.
На это указывает более высокое содержание АТР, ХАН и ФКр в сердце, которое сочеталось со снижением накопления глюкозы и лактата. Существенно, что при доксорубициновой КМП увеличивалась скорость катаболизма миокардиальной Глу, что сопровождалось образованием Ала и Асп и накоплением цитотоксичного аммиака. Как правило, такие изменения в обмене этих аминокислот обнаруживаются в тех случаях, когда окислительное фосфорилирование не может обеспечить необходимого образования АТР, происходит активация гликолиза и использование резервных макроэргических фосфатов.
Реакции сопряженного трансаминирования Глу и Асп и образования Ала сопряжены с усилением субстратного фосфорилирования в митохондриях на уровне сукцината, компенсирующего ингибирование окислительного фосфорилирования. При этом потеря внутриклеточного пула Глу, участвующей в поддержании уровня АТР, и продукция Ала тесно связаны с энергетическим состоянием сердца [20, 21].
Увеличение аэробного обмена под действием пептида G в сердце, поврежденном Докс, восстанавливало нормальное содержание Глу, Асп и Ала и снижало образование аммиака.
Такие сдвиги во внутриклеточном обмене миокарда отражают снижение отношения NADH/NAD+ в цитозоле, нормализацию функции малат-аспартатного челнока и цикла трикарбоновых кислот [22, 23]. Они хорошо согласуются с более высоким дыхательным контролем в митохондриях сердца на NAD+-зависимых субстратах (Глу и малате), обнаруженном нами ранее после совместного введения Докс и пептида G крысам [9].
Контроль содержания аммиака в сердечной мышце, характеризующейся интенсивным аэробным обменом, имеет особое значение.
Это связано с его способностью
1) ингибировать реакции декарбок- силирования а-кетокислот в цикле Кребса и синтез белка;
2) сдвигать направление глутаматдеги- дрогеназной реакции в сторону образования Глу и тем самым блокировать катаболизм аминокислот;
3) нарушать активный перенос одновалентных катионов и изменять внутриклеточный рН [24, 25].
Снижение внутриклеточного уровня аммиака, обладающего токсическим действием на окислительный обмен, обусловлено улучшением метаболизма миокарда под действием пептида G.
Этот эффект, скорее всего, вызван активацией связывания аммиака в АТР-зависимых реакциях образования глутамина, аспарагина, а также снижением деградации адениннуклеотидов [26, 27]. Таким образом, пептид G корректировал ключевые звенья метаболизма миокарда при КМП - энергетический, углеводный и азотистый обмены.
В настоящее время клонированы и охарактеризованы три подтипа рецепторов галанина - GalRl, GalR2 и GalR3, которые существуют и в сердце.
За связывание с рецепторами отвечает N-концевой фрагмент пептида, первые 15 аминокислотных остатков которого консервативно сохраняются у большинства видов животных и человека [28].
Влияние пептида G на метаболическое состояние поврежденного сердца обусловлено, вероятно, его связыванием преимущественно с GalR2, сопряженного с различными типами G-белков, которое активирует механизмы клеточной защиты (рис. 4).
Активация всех подтипов рецепторов галанина через белки Gi/o ингибирует активность аденилатциклазы, что приводит к ингибированию транскрипционного фактора CREB - белка, связывающего цикло-АМР-зависимый элемент. Это повышает экспрессию транспортера глюкозы GLUT4 и его перемещение в сарколемму, стимулируя захват и окисление глюкозы кардиомиоцитами.
Запуск этого механизма имеет решающее значение в условиях снижения продукции АТР. Сопряжение рецептора GalR2 с белком Gq/11 активирует фосфолипазу C и через гидролиз фос- фатидилинозитолдифосфата регулирует гомеостаз Са2+, что улучшает инотропные свойства сердца [30].
Нижние звенья этого сигнального пути вызывают фосфорилирование протеинкиназы В (Akt), ингибирование проапоптотических белков BAD/BAX и активностей каспазы-3 и каспазы-9 [31].
Рис. 4. Пути внутриклеточной сигнализации, активируемые пептидом G - фармакологическим агонистом рецепторов галанина(Runes- son [31]). AC - аденилатциклаза; (p)BAD - (фосфорилированный) ВС12-регулятор апоптоза; CaCC - Са2+-зависимый хлоридный канал; (p)CREB - фосфорилированный сАМР-зависимый элемент; DAG - диацилглицерин; GIRK - G-белок- связанный входящий калиевый канал; IP3 - инозитолтрифосфат; MAPK - митогенактивируемая протеинкиназа; MEK - APK/ERK- киназа; PDK-1 - фосфоинозитол- зависимая протеинкиназа-1; PIP2 - фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат; PIP3 - фосфатидилинозитол- 3,4,5-трифосфат; PI3K - фосфатидилинозитол-3-киназа; PKB - протеинкиназа B (Akt); PLC - фосфолипаза C; RhoA - Ras-подобный белок
Как правило, в моделях in vivo уменьшение апоптоза кардиомиоцитов, в том числе и индуцированного Докс, сочетается с уменьшением размера необратимого повреждения миокарда и улучшением его сократительной функции [32].
Активация GalR1 и GalR2 стимулирует сигнальные пути, активируемые митогенактивируемыми протеинкиназами (MEK1/2 и ERK1/2), приводящие к ингибированию открытия митохондриальной поры временной проницаемости (mPTP).
Этот механизм отвечает за выживание и подвижность клеток [33]. Кроме того, активация фосфорилирования ERK способствует повышенной экспрессии рецепторов, активируемых пролифераторами перок- сисом (PPARs), контролирующих энергетический метаболизм, включая и экспрессию PPARy, стимулирующего поглощение и окисление глюкозы кардиомиоцитами [34].
Из этого следует, что пептид G способен запускать различные механизмы, которые способствуют защитным кардиометаболическим эффектам при повреждении сердца Докс.
Окислительный стресс - один из ведущих факторов кардиотоксичности, инициируемой Докс [2, 4].
В нашей работе это подтверждено высокими уровнями продуктов ПОЛ ТБКАП как на системном, так и на органном уровне, а также повышенной активностью специфичного маркера некроза сердца - КК-МВ - в плазме крови животных, получавших Докс.
Для понимания особенностей окислительного стресса в сердце под действием Докс мы изучили его воздействие на ключевые ферменты антиоксидантной защиты - Cu,Zn-SOD, САТ и GSH- Px.
Под влиянием Докс в сердце статистически значимо снизилась активность только GSH-Px, активность Cu,Zn-SOD снижалась незначительно, а CAT увеличилась по сравнению с контролем.
Столь разнонаправленный ответ антиоксидантных ферментов связан с использованием низкой кумулятивной дозы Докс (8 мг/кг) в наших опытах. Докс, генерируя небольшое количество АФК, может не влиять на активность антиоксидантных ферментов или активировать ряд сигнальных путей, приводящих к индукции ферментов антиоксидантной защиты.
Такие данные получены на моделях индуцируемого Докс окислительного стресса у животных различных видов [35, 36].
Важно, что введение пептида G на фоне повреждения сердца Докс существенно снижало содержание продуктов ПОЛ в сердце и плазме крови животных и одновременно улучшало интегрированность мембран кардиомиоцитов.
Эти эффекты уменьшения окислительного стресса сопровождались увеличением активности Cu,Zn-SOD и GSH-Px, что указывает на усиление антиоксидантной защиты.
Следует отметить, что внутриклеточная Cu,Zn-SOD контролирует не только образование АФК, но и высокореактивного пероксинитрита, и ограничивает таким образом нитрозильный стресс [37].
Наблюдаемое увеличение активности Cu,Zn-SOD и GSH-Px могло быть связано с увеличением экспрессии генов этих ферментов под влиянием пептида G. Известно также, что некоторые пептиды обладают способностью перехватывать АФК и ингибировать ПОЛ [38].
Однако данные о прямом антиоксидантном действии галанина или пептидов, содержащих карнозиновую последовательность на С-конце молекулы, отсутствуют.
Несомненно, механизмы снижения окислительного стресса с помощью пептида G заслуживают дальнейшего изучения. Мы полагаем, что основными факторами, обуславливающими фармакологическую эффективность пептида G и снижение кардиотоксичности, вызванной длительным введением Докс, можно считать улучшение энергетического обеспечения кардиомиоцитов и усиление ферментативной антиоксидантной защиты. Схема, иллюстрирующая кардиопротектное действие этого синтетического агониста рецепторов галанина, представлена на рис. 5.
Рис. 5. Активация рецептора галанина GalR2 пептидом G снижает систолическую дисфункцию миокарда при КМП, индуцированной Докс, благодаря улучшению метаболического и антиоксидантного состояния сердца
Ранее токсичность пептида G была изучена нами на мышах линии BALB/с. Введение пептида G не вызывало каких-либо признаков интоксикации и гибели животных в течение 14 дней наблюдения [39].
Существенно, что наиболее высокая из испытанных доз пептида G (520 мг/кг) многократно превышала его кумулятивную дозу, использованную в настоящей работе с Докс (4.2 мг/кг).
Эти данные свидетельствуют о хорошей переносимости пептида G и перспективности проведения доклинических исследований этого препарата, обладающего широким спектром защитного действия при Докс- индуцированной КМП.
Заключение
Несмотря на использование антрациклинов нового поколения со сниженной кардиотоксичностью (эпирубицина и идарубицина), Докс остается препаратом, обладающим высоким противоопухолевым эффектом, что, в свою очередь, требует снижения повреждений сердечно-сосудистой системы при его химиотерапевтическом использовании. Приведенные экспериментальные факты свидетельствуют о возможности коррекции КМП у крыс, вызванной хроническим применением Докс, с помощью пептида G - фармакологического агониста рецепторов галанина.
Снижение кардиотоксического действия Докс при введении пептида G подтверждено уменьшением систолической дисфункции левого желудочка и уменьшением активности в крови КК-МВ - маркера повреждения сердечной мышцы. Эти эффекты прямо связаны со снижением окислительного стресса и улучшением метаболического и антиоксидантного состояния сердца.
Для понимания механизмов действия пептида необходимо изучить роль активации рецепторов галанина этим лигандом и пути передачи сигнала в кардиомиоцитах.
Полученные данные создают предпосылки для изучения возможности использования фармакологических лигандов рецепторов галанина в онкологии с целью снижения токсичности антрациклиновых антибиотиков. При этом они свидетельствуют о целесообразности доклинического исследования пептида G, который может быть использован в качестве потенциального противоишемического, мембраностабилизирующего и антиоксидантного лекарственного средства. *
Список литературы
1. Minotti G., Menna P., Salvatorelli E., Cairo G., Gianni L. // Pharmacol. Rev. 2004. V. 56. № 2. Р. 185-229.
2. Zhang S., Liu X., Bawa-Khalfe T., Lu L.S., Lyu Y.L., Liu L.F., Yeh E.T. // Nat. Medicine. 2012. V. 18. № 11. Р. 1639-1642.
3. Tokarska-Schlattner M., Wallimann T., Schlattner U. // C. R. Biol. 2006. V. 329. № 9. Р. 657-668.
4. Octavia Y., Tocchetti C.G., Gabrielson K.L., Janssens S., Crijns H.J., Moens A.L. // J. Mol. Cell. Cardiol. 2012. V. 52. № 6. Р. 1213-1225.
5. Timotin A., Pisarenko O., Sidorova M., Studneva I., Shul- zhenko V., Palkeeva M., Serebryakova L., Molokoedov A., Veselova O., Cinato M., et al. // Oncotarget. 2017. V. 8. № 13. Р. 21241-21252.
6. Pisarenko O., Timotin A., Sidorova M., Studneva I., Shulzhen- ko V., Palkeeva M., Serebryakova L., Molokoedov A., Veselova O., Cinato M., Boal F., Tronchere H., Kunduzova O. // Oncotarget. 2017. V. 8. № 60. Р. 101659-101671.
7. Азьмуко А.А., Веселова О.М., Молокоедов А.С., Овчинников М.В., Палькеева М.Е., Писаренко О.И., Серебрякова Л.И., Сидорова М.В., Студнева И.М. Патент № 2648846. РФ. A61K 38/10 (2006.01). 2018.
8. Palkeeva M., Studneva I., Molokoedov A., Serebryakova L., Veselova O., Ovchinnikov M., Sidorova M., Pisarenko O. // Biomed. Pharmacother. 2019. V. 109. P. 1556-1562.
9. Studneva I., Palkeeva M., Veselova O., Molokoedov A., Ovchinnikov M., Sidorova M., Pisarenko O. // Cardiovascular. Toxicol. 2019. V. 19. № 2. Р. 136-146.
10. Bergmeyer H.U. Methods of enzymatic analysis. New York: Acad. Press, 1974. Р. 1464-1467, 1772-1776, 1777-1781, 2127-2131.
11. Draper H.H., Hadley M. // Meth. Enzymol. 1990. V. 186. P.421-434.
12. Beauchamp C., Fridovich I. // Anal. Biochem. 1971. V. 44. № 1. P. 276-287.
13. Beers R.F., Sizer I.W. // J. Biol. Chem. 1952. V. 195. № 1. Р. 133-140.
14. Paglia D.E., Valentine W.N. // J. Lab. Clin. Med. 1967. V. 70. № 1. P. 158-169.
15. Uchlyama M., Mihara M. // Anal. Biochem. 1978. V. 86. № 1. Р. 271-278.
16. Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии. Руководство под ред. Д.Э. Коржевского. СПб.: Спец- Лит, 2013. 127 с.
17. Кактурский Л.В., Бахтин А.А. // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Современные подходы в клинико-морфологической диагностике и лечении заболеваний человека», Санкт-Петербург, 9-10 октября 2015. С. 103-106.
18. Zervou S., Whittington H.J., Russell A.J., Lygate C.A. // Mini-Rev. Med. Chem. 2016. V. 16. Р. 19-28.
19. Hrelia S., Fiorentini D., Maraldi T., Angeloni C., Bordoni А., Biagi P.L., Hakim G. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1567. № 1-2. P. 150-156.
20. Sanborn Т., Gavin W., Berkowitz S., Perille Т., Leach M. // Am. J. Physiol. 1979. V. 273. № 5. P. H535-H541.
21. Weisner R.J., Deussen A., Borst M., Schrader J., Grieshaber M.K. // J. Mol. Cell. Cardiol. 1989. V. 21. № 1. Р. 49-59.
22. Safer В., Williamson J.R. // J. Biol. Chem. 1973. V. 248. № 7. P. 2570-2579.
23. LaNoue K.F., Walajtys E.I., Williamson J.R. // J. Biol. Chem. 1973. V. 248. № 20. Р. 7171-7183.
24. McKhann G.M., Tower D.B. // Am. J. Physiol. 1961. V. 200. P. 420-424.
25. Katunuma N., Okada M., Nishi Y. // Adv. Enz. Regul. 1966. V. 4. P. 317-336.
26. Watanabe T., Hamazaki N., Aoyama S. // Israel Med. Sci. 1969. V. 5. P. 496-500.
27. Katunuma N., Jkada M. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965. V. 19. P. 109-113.
28. Webling K.E.B., Runesson J., Bartfai T., Langel Ь. // Front. Endocrinol. 2012. V. 3. Article 146.
29. Tian R., Abel E.D. // Circulation. 2001. V. 103. № 24. P. 29612966.
30. Lang R., Gundlach A.L., Holmes F.E., Hobson S.A., Wynick D., Hцkfelt T., Kofler B. // Pharmacol. Rev. 2015. V. 67. № 1. P. 118-175.
31. Runesson J. Galanin receptor ligands. Stockholm University, 2009. 36 р.
32. Krijnen P.A., Nijmeijer R., Meijer C.J., Visser C.A.,
Hack C.E., Niessen H.W. // J. Clin. Pathol. 2002. V. 55. № 11. P. 801-811.
33. Hausenloy D.J., Duchen M.R., Yellon D.M. // Cardiovasc. Res. 2003. V. 60. Р. 617-625.
34. Jay M.A., Ren J. // Curr. Diab. Rev. 2007. V. 3. № 1. P. 33-39.
35. Aniss H.A., Said A.A., Sayed I.H., AdLy C. // Egypt. J. Hosp. Med. 2012. V. 48. Р. 383-393.
36. Li T., Singal P.K. // Circulation. 2000. V. 102. № 17. Р. 21052110.
37. Ferdinandy P., Schulz R. // Br. J. Pharmacol. 2003. V. 138. № 4. P. 532-543.
38. Power O., Jakeman P., FitzGerald R.J. // Amino Acids. 2013. V. 44. № 3. P. 797-820.
39. Серебрякова Л.И., Палькеева М.Е., Студнева И.М., Овчинников М.В., Веселова О.М., Молокоедов А.С., Азьмуко А.А., Арзамасцев Е.В., Афанасьева Е.Ю., Терехова О.А. и др. // Биомед. химия. 2019. Т. 65. № 3. С. 231-238.
Реферат
Механизмы защиты сердца синтетическим агонистом рецепторов галанина при повреждении хроническим введением доксорубицина. И. М. Студнева1, О. М. Веселова1, A. A. Бахтин2, Г. Г. Коновалова1, В. З. Ланкин1, О. И. Писаренко1
1Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии Минздрава России, Москва, 121552 Россия
2Научно-клинический центр оториноларингологии ФМБА России, Москва, 123182 Россия
Применение противоопухолевого препарата доксорубицина (Докс) ограничено из-за его кардиотоксического действия. Изучено влияние нового синтетического агониста рецепторов галанина GalRl- 3 [ЯAla14, Н15]-галанин (2-15) (G) на метаболизм, активность антиоксидантных ферментов, окислительный стресс и функцию сердца у крыс с кардиомиопатией (КМП), вызванной хроническим введением Докс. Совместное введение пептида G и Докс статистически значимо увеличивало фракцию укорочения (ФУ) и фракцию выброса (ФВ) в среднем на 30 ± 4% по сравнению с этими показателями в группе Докс.
Уменьшение дисфункции сердца под действием G сочеталось со снижением в 2.5 раза активности креатинкиназы-МВ (КК-МВ) в плазме крови. Защитное действие пептида G обусловлено снижением пере- кисного окисления липидов (ПОЛ) вследствие увеличения активности Сип-супероксиддисмутазы (Cu,Zn- SOD) и глутатионпероксидазы (GSH-Px) в поврежденном сердце.
Введение пептида G статистически значимо увеличивало пул адениннуклеотидов (SAH), АТР, фосфокреатина (ФКр) и общего креатина (ХКр) в поврежденном миокарде, а также снижало накопление лактата по сравнению с этим показателем в группе Докс. Улучшение энергетического обеспечения кардиомиоцитов под действием пептида G предотвращало накопление цитотоксичного аммиака и нарушения обмена ключевых аминокислот сердца - глутаминовой (Глу) и аспарагиновой (Асп), а также аланина (Ала). Пептид G снижал морфологические изменения в сердце крыс, получавших Докс.
Результаты указывают на перспективность использования пептида G для эффективной коррекции функциональных, морфологических и метаболических повреждений сердца при химиотерапии антрациклинами.
Ключевые слова антиоксидантные ферменты, галанин, доксорубицин, крыса, метаболизм миокарда.
Список сокращений 2ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота; АЭЗ - аденилатный энергетический заряд; АФК - активные формы кислорода; Докс - доксорубицин; И/Р - ишемия/реперфузия; КК-МВ - креатинкиназа-МВ; КМП - кардиомиопатия; Кр - креатин; ЛЖ - левый желудочек; ПОЛ - перекисное окисление липидов; ТБКАП - тиобарбитуратные кислотно-активные продукты; ФВ - фракция выброса; ФКр - фосфокреатин; ФУ - фракция укорочения; ЭхоКГ - эхокардиография; CAT - каталаза; Cu,Zn-SOD - C^Zn-супероксиддисмутаза; GSH-Px - глутатионпероксидаза; PPARs - рецепторы, активируемые пролифераторами пероксисом; ХАН - пул адениннуклеотидов; ХКр - общий креатин.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Понятие и причины возникновения компенсаторной гипертрофии сердца, ее основные стадии и патогенез. Механизмы, определяющие развитие гипертрофии миокарда при сердечной недостаточности. Особенности формирования патологического изменения сердца у детей.
презентация [479,7 K], добавлен 23.01.2014Жалобы больного при поступлении. Обследование состояния и работы сердца, органов гепатобилиарной системы. Обоснование диагноза ишемической болезни сердца (острый первичный инфаркт миокарда, осложненный острой сердечной недостаточностью) и его лечение.
история болезни [146,8 K], добавлен 02.05.2013Деятельность сердца человека. Нарушение сердечного ритма. Основные типы кардиомиопатии. Понятие миокардитов, эндокардитов и пороков сердца. Классификация форм сердечной недостаточности. Центрогенный и рефлекторный пути нарушения сердечной деятельности.
презентация [216,4 K], добавлен 27.10.2013Признаки синдромов Марфана и Пиквика. Исследование цвета кожи, виды цианоза и причины бледности. Механизм отеков при недостаточности правых отделов сердца. Симптомы, выявляемые при осмотре сердечной области. Техника пальпации сердца, его конфигурация.
презентация [983,3 K], добавлен 06.02.2014Материалы и методы исследования феномена ишемического прекондиционирования при повреждении сердца у кроликов, оценка эффективности его использования в борьбе с инфарктом миокарда. Схема путей внутриклеточной сигнализации, активируемых брадикинином.
презентация [1,3 M], добавлен 17.01.2014Физиологические свойства сердечной мышцы. Границы анатомического расположения сердца, его свойства проводимости. Потенциал действия клеток водителя ритма сердца. Особенности саморегуляции и сократимости миокарда. Оценка автоматии по частоте пульса.
презентация [2,0 M], добавлен 16.01.2014Развитие сердца, особенности строения сердечной мышечной ткани. Гистологическое строение сердечной стенки. Сердечная мышца называется миокардом. Клапанный аппарат сердца: трехстворчатый, легочный, митральный или двустворчатый и аортальный клапаны.
реферат [1,5 M], добавлен 05.06.2010Причины развития пороков сердца - стойкого органического поражения клапанного аппарата различной этиологии, вызывающего нарушение гемодинамики. Симптомы, диагностика и лечение заболевания. Коррекция нарушения ритма сердца и сердечной недостаточности.
презентация [1,5 M], добавлен 08.04.2015Особенности диагностирования и лечении больного ишемической болезнью сердца, стенокардией и хронической сердечной недостаточностью. Характеристика жалоб пациента, результатов обследования, анализов. Этиология болезни, патогенез и лечение ишемии миокарда.
история болезни [346,8 K], добавлен 24.03.2010Основные причины острой сердечной недостаточности: заболевания сердца, гипертрофия миокарда, брадиаритмия, нарушение целостности клапанов или камер сердца, несердечные причины. Признаки и диагностика правожелудочковой и левожелудочковой недостаточности.
презентация [911,8 K], добавлен 01.05.2015Аускультация сердца позволяет оценить свойства звуков, возникающих в процессе сердечной деятельности, определить их характер и причины появления. Патологические состояния, при которых наблюдается ослабление тона над аортой. Расщепление и раздвоение тонов.
презентация [1,7 M], добавлен 09.11.2015Особенности фармакотерапии и характеристика препаратов, применяемых при сердечной недостаточности. Работа фармацевта с лекарственными препаратами, применяемыми при хронической сердечной недостаточности в аптеке "Классика". Побочные действия препаратов.
дипломная работа [1,1 M], добавлен 01.08.2015Строение сердца человека - центрального органа кровеносной системы, понятие автоматии сердечной мышцы. Характерные анатомические и физиологические особенности иннервации сердца. Компоненты и функции проводящей системы сердца. Сердечный цикл, его фазы.
реферат [9,9 M], добавлен 25.07.2010Проводящая система сердца. Этиология нарушений ритма и проводимости сердца. Анализ последствий аритмий. Механизмы усиления нормального автоматизма. Особенности диагностического поиска при нарушениях ритма сердца. Классификация антиаритмических препаратов.
учебное пособие [3,6 M], добавлен 12.06.2016Морфология кардиомицита. Щелевые контакты как основа взаимодействия клеток в сердце. Трансмембранные – потенциал покоя и потенциал действия. Возбудимость кардиомицитов и сердца. Ионные каналы: структура и функции. Ионно-обменные транспортные механизмы.
презентация [7,5 M], добавлен 17.10.2013История лечения аритмии сердца и атеросклероза. Воспалительные заболевания сердца. Порок сердца и гипертония. Инфекционные причины возникновения миокардита. Ишемическая болезнь сердца, кардиосклероз, сердечная недостаточность и коронарные заболевания.
реферат [44,8 K], добавлен 21.02.2011Физиологические свойства рабочего миокарда и подводящей системы сердца. Опыт Станиуса с лигатурами. Геометрия распространения возбуждения по предсердиям. Базисные ионные механизмы миокарда. Потенциалы действия клеток. Основные разновидности экстрасистол.
лекция [3,5 M], добавлен 08.01.2014Патофизиологические механизмы пороков сердца в эксперименте и клинике. Этиологические факторы патологии. Компенсаторная гиперфункция сердца. Регуляторные механизмы, обеспечивающие мобилизацию кардиального и экстракардиальных факторов компенсации.
реферат [20,7 K], добавлен 12.05.2010Патогенез и формы сердечной недостаточности. Факторы сердечной деятельности. Причины развития хронической сердечной недостаточности и принципы её лечения. Классификация и действие лекарственных препаратов, применяемых при сердечной недостаточности.
презентация [513,3 K], добавлен 17.05.2014Эхокардиография сердца - современный безболезненный и безопасный метод диагностики многих болезней сердца и сосудов. Преимущества, показания и противопоказания к проведению и эхокардиографии. Показатели, определяющие нормальное состояние сердечной мышцы.
презентация [1012,7 K], добавлен 14.02.2016
