Вміст білків теплового шоку HSP60 та HSP70 у тканинах пухлин хворих на рак сечового міхура

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вміст білків теплового шоку HSP60 та HSP70 у тканинах пухлин хворих на рак сечового міхура

В. Дмитрик, асп, О. Савчук, д-р біол. наук Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, Україна,

Ю. Зінькова, студ.

ТОВ "Фармацевтичний завод "Біофарма", Київ, Україна

Рак сечового міхура (РСМ) залишається захворюванням з високим показником смертності. РСМ є 9-м за частотою онкологічним захворюванням в світі. Згідно з даними статистики найбільша кількість хворих на РСМ пацієнтів у розвинених країнах. Близько 75 % хворих - чоловіки. Різноманітні молекули були ідентифіковані як потенційні прогностичні індикатори та/або мішені для даного захворювання. Однак пошук мішеней для лікування і попередження РСМ залишається актуальним. Останнім часом проводяться дослідження участі білків теплового шоку (БТШ) у патогенезі злоякісних новоутворень. Високий рівень експресії шаперонів пов'язують із захистом трансформованих клітин та блокуванням апоптозу. Дані про надмірну експресію БТШ опубліковано для різних онкологічних захворювань, серед яких рак молочної залози, шийки матки, товстої кишки, легень та простати. Останні дослідження тісно пов'язують значення вмісту шаперонів із подальшим прогнозом хвороби. Мета роботи - виявити динаміку вмісту БТШ HSP70 та HSP60 у пухлина і стінках здорового міхура у хворих на рСм залежно від стадії раку за TNM класифікацією, а також залежно від ступеня гістопатологічної градації. При дослідженні встановлено збільшення вмісту БТШ у гомогенатах пухлин порівняно зі зразками здорових стінок сечового міхура, тобто підвищений вміст БТШ може бути асоційований із РСМ. Помічено збільшення вмісту БТШ родини HSP60 та HSP70 залежно від стадії РСМ, а також від ступеня диференціації клітин. Високий рівень експресії БТШ може забезпечувати правильне згортання і мембранний транспорт продуктів онкогенів та антионкоге- нів. З іншого боку, високий біосинтез БТШ може регулювати деградацію зіпсованих білків та швидко нормалізувати білковий метаболізм у трансформованих клітинах, забезпечуючи швидкий ріст злоякісних пухлин.

Ключові слова: рак сечового міхура, білки теплового шоку, шаперони, імуноферментний аналіз.

білок тепловий шок сечовий міхур

Рак мочевого пузыря (РМП) остается заболеванием с высоким показателем смертности. РМП является 9-м по частоте онкологическим заболеванием в мире. Согласно данным статистики, наибольшее количество больных РМП пациентов находятся в развитых странах. Около 75 % больных - мужчины. Различные молекулы были идентифицированы в качестве потенциальных прогностических индикаторов и/или мишеней для данного заболевания. Однако поиск мишеней для лечения и предупреждения РМП остается актуальным. В последнее время проводятся исследования участия белков теплового шока (БТШ) при злокачественных новообразованиях, в которых связывают высокую экспрессию БТШ с защитой трансформированных клеток и блокировкой апоптоза. Данные о чрезмерной экспрессии БТШ были опубликованы о ряде онкологических заболеваний, среди которых рак молочной железы, шейки матки, толстой кишки, легких и простаты. Последние исследования тесно связывают уровень экспрессии БТШ с последующим прогнозом болезни. Цель работы - выявить динамику содержания БТШ HSP70 и HSP60 в опухолях и стенках здорового пузыря у больных на РМП в зависимости от стадии заболевания согласно TNM классификации, а также в зависимости от степени клеточной дифференциации. В ходе нашего исследования было установлено увеличение содержания БТШ в гомогенатах опухолей в сравнении с образцами здоровых стенок мочевого пузыря, то есть увеличенное содержание БТШ может быть ассоциировано с развитием РМП. Отмечено увеличение содержания БТШ семьи HSP60 и HSP70 в зависимости от стадии РМП, а также от степени дифференциации клеток. Высокий уровень экспрессии БТШ может обеспечивать правильный фолдинг и мембранный транспорт продуктов онкогенов и против- онкогенов. С другой стороны, высокий биосинтез БТШ может регулировать процесс деградации белков и быстро нормализовать белковый метаболизм в онкоклетках, обеспечивая быстрый рост злокачественных опухолей.

Ключевые слова: рак мочевого пузыря, белки теплового шока, шапероны, иммуноферментный анализ.

Bladder cancer (BC) continues to be a disease with a high mortality rate. BC is the 9th most frequently diagnosed cancer in the world. According to statistics, the largest number of patients with BC patients in developed countries. About 75 % of patients are men. Various molecules have been identified as potential prognostic indicators and/or targets for a given disease. However, the search for targets for the treatment and prevention of BC remains relevant. Recently, studies have been conducted on the participation of heat shock proteins (HSPs) in malignant neoplasms. In which high expression of HSPs is associated with the protection of transformed cells and the blocking of apoptosis. Data on overexpression of HSPs have been published for a number of oncological diseases, including breast, cervical, colon, lung and prostate cancers. Recent studies have closely linked the level of HSPs expression with the subsequent prognosis of the disease. The aim of the work was to identify the dynamics of HSP70 and HSP60 in tumors and walls of a healthy bladder in BC patients, depending on the stage of cancer with the TNM classification, and also on the degree of cell differentiation. In our study, an increase in HSPs content in homogenates of tumors was found in comparison with samples of healthy bladder walls, that is, an increase in HSPs content may be associated with BC. An increase in the content HSP60 and HSP70 was noted, depending on the BC stage, as well as on the degree of cell differentiation. A high level of HSP expression can ensure the correct folding and membrane transport of products of oncogenes and anti-oncogenes. On the other hand, high synthesis of HSPs can regulate the process of protein degradation and quickly normalize protein metabolism in cancer cells, ensuring the rapid growth of malignant tumors.

Keywords: bladder cancer, heat shock proteins, chaperones, ELISA.

білки теплового шоку сечовий міхур

Вступ

Рак сечового міхура (РСМ) продовжує бути захворюванням з високим показником смертності. РСМ є 9-тим по частоті онкологічним захворюванням в світі [11]. Згідно з даними статистики, найбільша кількість хворих на РСМ пацієнтів в розвинених країнах. Близько 75 % хворих - чоловіки [11]. Білки теплового шоку (БТШ, від англ. HSP-heat shock proteins) є гетерогенною групою еволюційно висококонсервативних білків, які можуть бути синтезовані в усіх клітинах організму та забезпечують захист від внутрішньоклітинних та позаклітинних факторів [13]. БТШ виконують функцію молекулярних шаперонів, які відповідають за підтримання внутрішньоклітинного гомеостазу, забезпечуючи правильну збірку, згортання, збереження конформації білків [10] та їх трансфер у відповідні внутрішньоклітинні ком- партменти, а також беруть участь у регуляції транскрипції генів та процесах клітинного росту, розвитку, диференціації. [2,3,5,8]. Окрім вищеописаного, БТШ за© Дмитрик В., Савчук О., Зінькова Ю., 2019 безпечують нативне згортання розгорнутих білків, та беруть участь в утилізації шляхом деградації необоротно розгорнутих білків [6,15]. БТШ є медіаторами клітинної відповіді, включаючи як інгібування шляхів апоптозу, так і посилення імунної відповіді [3]. БТШ відіграють важливу роль в утворенні антитіл і презентації антигенів [12, 14], розпізнаються як Т-клітинами так і натуральними кілерами (НК) [9]. На основі наближених значень молекулярної маси (кДа) БТШ розподіляють на окремі родини HSP90a, HSP70, HSP60 та маленькі білки теплового шоку [3].

Різноманітні молекули були ідентифіковані як потенційні прогностичні індикатори та/або мішеней для РСМ. Однак пошук мішеней для лікування та попередження РСМ залишається актуальним [16]. Останнім часом проводяться дослідження участі білків теплового шоку в патогенезі злоякісних новоутворень, в яких пов'язують високу експресію шаперонів з захистом трансформованих клітин та блокуванням апоптозу. Дані про надмірну експресію шаперонів були опубліковані для різних онкологічних захворювань, серед яких рак молочної залози, шийки матки, товстої кишки, легень та простати. Останні дослідження тісно пов'язують рівень експресії шаперонів з подальшим прогнозом хвороби [7].

Метою роботи було виявити динаміку вмісту БТШ родини HSP70 та HSP60 в пухлинах та стінках здорового міхура у хворих на РСМ залежно від стадії раку за TNM класифікацією, а також залежно від ступеня гістопатологічної градації.

Матеріали та методи

Зразки здорових та патологічних тканин отримані у хворих на РСМ. Заключний діагноз ставився після рентгенологічних, ендоскопічних, клінічних методів дослідження з обов'язковою морфологічною верифікацією. У досліді брали участь 22 пацієнти. Групу T1-2 становили 12 чоловіків, групу T3-4 становили 10 чоловіків. За ступенем клітинної диференціації - 11 чоловіків були включені в групу G1-2, а також 11 чоловіків в групу G3-4.

Гомогенати пухлин сечового міхура були отримані під час операційного втручання. Здорові тканини стінок стравоходу були отримані за допомогою біопсії. Всі зразки гомогенатів здорових стінок та пухлин були нормалізовані за концентрацією білка 10 мкг/мл, використовуючи метод за Бредфорд [1]. Вміст БТШ HSP60 та HSp70 в гомогенатах тканин пухлин визначали з використанням методу імуноферментного аналізу в модифікації ELISA [11]. Використовували набір первинних та вторинних антитіл виробника Santa Cruz Biotechnology,

CA, USA. В плашки для імуноферментного аналізу наносили попередньо нормалізовані за концентрацією білка гомогенати тканин здорових стінок та пухлин та залишали на ніч при температурі 4°C. Після промивки, на плашки наносили 5 % обезжирене сухе молоко та інкубували протягом 1 год при температурі 37°C, після чого знову промивали. Після інкубації протягом 1 год при 37°C з відповідними первинними антитілами проти відповідних БТШ плашки промивали та інкубувалися протягом 1 год при 37°C з відповідними вторинними антитілами конюгованими з пероксидазою хрону. Після чергової промивки були додані субстрати до перокси- дази хрону. Реакцію зупиняли додаванням 2.5 Н H2SO4. Показники оптичної щільності отримували за допомогою відповідного рідера для мікроплашок (piQuantTM, BioTek Instruments, Inc) при довжині хвилі - 492 нм. Статистичну обробку отриманих результатів проводили за допомогою методів варіаційної статистики з використанням комп'ютерної програми Excel.

Результати та обговорення. В невеликій кількості БТШ синтезуються в клітинах за нормальних фізіологічних умов, беруть участь в рості та метаболізмі клітин. Однак за умов клітинного стресу, біосинтез БТШ значно зростає, так як вони беруть участь у коректному відновлені денатурованих внаслідок клітинного стресу білків. Такий, клітинний шок може бути викликаний гіпотермією, іонами важких металів, гіпоксією, гіпероксією та цитотоксичними агентами [3,17]. Клітини злоякісних новоутворень перебувають у стані протеотоксичного стресу внаслідок біосинтезу онкобілків, нестабільності геному, локальної гіпоксії та ацидозу. Більше того, виживаність трансформованих клітин залежить від участі БТШ в захисті онкобілків від агрегації, що в нормі привело б до апоптозу та клітинної гибелі [19].

БТШ людини родини HSP60 є продуктом гена HSPD1 та вважається мітохондріальним шапероном. Дослідження останніх десятиліть вказують на присутність HSP60 поза внутрішньомітохондріальним простором, більш того, при онкозахворюваннях відмічена циркуляція HSP60 поза клітинним простором та в кро- вотоці [4]. Незважаючи на численні експериментальні докази наявності HSP60 в позаклітинному просторі, механізм такої транслокації ще не з'ясований. Нами було досліджено вміст HSP60 в гомогенатах пухлин та здорових стінках сечового міхура залежно від стадії захворювання (табл. 1) та залежно від ступеня диференціації клітин (табл. 2).

Таблиця 1. Вміст БТШ родини HSP60 у тканинах пухлин РСМ порівняно з тканинами здорових стінок сечового міхура згідно з TNM класифікації захворювання

Для контролю (здорові стінки міхура) M±m, n=13; для T1-2 M±m, n=12; для T3-4 M±m, n=10; *- p < 0.05 достовірно відносно значень контролю.

Нами було відмічене підвищення вмісту БТШ родини HSP60 залежно від стадії РСМ. Для першої та другої стадії (табл. 1) вміст HSP60 (у.о./мл) був вищим в 1.3 раза, тоді як для третьої та четвертої стадії вміст був вищим в 1.75 раза відносно вмісту в здорових стінках сечового міхура.

Таблиця 2. Вміст БТШ родини HSP60 у тканинах пухлин РСМ порівняно з тканинами здорових стінок сечового міхура відповідно до ступеня диференціації клітин

Для контролю (здорові стінки міхура) M±m, n=13; для T1-2 M±m, n=11; для T3-4 M±m, n=11; *- p < 0.05 достовірно відносно значень контролю.

Відмічене збільшення вмісту HSP60 (у.о./мл) залежно від ступеня диференціації клітин. Для G1-2 вмісту був вищим в 1,77 раза (табл. 2), тоді як для G3-4 вмісту був вишим майже вдвічі. Дещо більше інформації відомо щодо родини БТШ HSP70, ці шаперони класично відносять до внутрішньоклітинних білків, проте відзначають їх позаклітинну присутність [18]. Посилення біосинтезу БТШ родини HSP70 було досліджено для декількох типів злоякісних пухлин, а інгібування експресії HSP70 у трансформованих клітинах призводить до супресії їх клітинного росту [18]. При злоякісних новоутвореннях позаклітинні HSP70 беруть участь в регуляції аспектів імунної відповіді, росту та поширення пухлин [18]. Ми дослідили вміст HSP70 у гомогенатах пухлин та здорових стінках сечового міхура залежно від стадії захворювання (табл. 3) і залежно від ступеня диференціації клітин (табл. 4).

Таблиця 3. Вміст БТШ родини HSP70 у тканинах пухлин РСМ порівняно з тканинами здорових стінок сечового міхура згідно з TNM класифікації захворювання

Для контролю (здорові стінки міхура) M±m, n=13; для T1-2 M±m, n=12; для T3-4 M±m, n=10; *- p < 0.05 достовірно відносно значень контролю

Вміст БТШ родини HSP70 в тканинах пухлин групи Т1-2 був в 1,24 раза вишим, ніж в здорових стінках міхура. У групі Т3-4 вміст БТШ родини HSP70 був у 2,03 раза вищим ніж у здорових стінках сечового міхура.

Таблиця 4. Вміст БТШ родини HSP70 в тканинах пухлин РСМ порівняно з тканинами здорових стінок сечового міхура відповідно до ступеня диференціації клітин

Для контролю (здорові стінки міхура) M±m, n=13; для T1-2 M±m, n=11; для T3-4 M±m, n=11; *- p < 0.05 достовірно відносно значень контролю.

Вміст HSP70 у групі G1-2 був вищим у 1,07 раза, ніж в здорових стінках сечового міхура. У групі G3-4 вміст HSP70 був в 1,51 раза вищим, ніж в здорових стінках стравоходу.

Отже, вміст БТШ в гомогенатах пухлин був достовірно вищим ніж в зразках здорових стінок сечового міхура, тобто збільшений вміст БТШ може бути асоційований з РСМ. Відмічено підвищення вмісту БТШ родини HSP60 та HSP70 залежно від стадії РСМ, а також від ступеня диференціації клітин. Високий рівень експресії БТШ може забезпечувати правильне згортання та мембранний транспорт продуктів онкогенів та антионкогенів. З іншого боку, високий ступінь біосинтезу БТШ може регулювати деградацію зіпсованих білків та швидко нормалізувати білковий метаболізм в трансформованих клітинах, забезпечуючи ріст злоякісних пухлин. Дані нашого дослідження узгоджуються з даними попередніх досліджень, проведених при вивченні інших новоутворень, які вказують про взаємозв'язок підвищеного рівня БТШ з розвитком злоякісних захворювань. Наші дослідження можуть свідчити про участь БТШ в онкогенезі при РСМ.

Список викорстаних джерел

Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. / M. M. Bradford. - 1976. - №72. - С. 248-254.

Calderwood S.K. Heat shock proteins: stress proteins with Janus- like properties in cancer / S.K. Calderwood, D.R. Ciocca // Int. J. Hyperthermia, 2008. - №24. - С. 31-39.

Heat shock proteins in cancer: chaperones of tumorigenesis. /

S.K. Calderwood, D.B. Sawyer, M.A. Khaleque, D.R. Ciocca // Trends Biochem. Sci., 2006. - №31. - С. 164-172.

Hsp60 expression, new locations, functions and perspectives for cancer diagnosis and therapy / F. Cappello, E. Conway de Macario,

Marasa et al. // Cancer Biol Ther., 2008. - №7. - С. 801-809.

Ciocca D.R. Heat shock proteins in cancer: diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications / D. R. Ciocca, S.K. Calderwood // Cell Stress Chaperones, 2005. - №10. - С. 86-103.

Doyle S.M. Asymmetric deceleration of ClpB or Hsp104 ATPase activity unleashes protein-remodeling activity / S.M. Doyle // Nat. Struct. Mol. Biol., 2007. - №14. - С. 114-122.

Prognostic role of HSPs in human gastrointestinal cancer: a systematic review and meta-analysis / H. Ge, Y. Yan, L. Guo et al. // Onco Targets Ther., 2018. - №11. - С. 351-359.

Gershenson A. Protein folding in the cell: challenges and progress / A. Gershenson, L. M. Gierasch // Curr Opin Struct Biol., 2010. - № 21. -

С. 32-41.

Harada M. Heat shock proteins and the antitumor T cell response /

M. Harada, G. Kimura, K. Nomoto // Biotherapy, 1998. - №10. - С. 229-235.

Hartl F.U. Converging concepts of protein folding in vitro and in vivo / F.U. Hartl, M. Hayer-Hartl. // Nat. Struct. Mol. Biol., 2009. - №16. - С. 574-581.

Plasma levels of MMPs and TIMP-1 in urinary bladder cancer patients / T.V. Ishchuk, D. Glavachek, O.M. Savchuk et al. // Biomedical Research and Therapy, 2018. - №5. - С. 1931-1940.

Kaufmann S. H. Heat shock proteins and the immune response / S. H. Kaufmann // Immunol. Today, 1990. - №11. - С. 129-136.

Lee G. J. A small heat shock protein cooperates with heat shock protein 70 systems to reactivate a heat-denatured protein. / G.J. Lee,

Vierling // Plant Physiol., 2002. - №122. - С. 189-197.

Li Z. Roles of heatshock proteins in antigen presentation and cross-presentation. / Z. Li, A. Menoret, P. Srivastava // Curr. Opin. Immunol., 2002. - №14. - С. 45-51.

Protein quality control: chaperones culling corrupt conformations. / A.J. McClellan, S. Tam, D. Kaganovich, J. Frydman // Nat. Cell. Biol., 2005.

№7. - С. 736-741.

Molecular genetics of bladder cancer: Emerging mechanisms of tumor initiation and progression / D.J. McConkey, S. Lee, W. Choi et al. // Urol Oncol., 2010. - №28. - С. 429 - 440.

Parsell D. A. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins / D.A. Parsell, S. Lindquist // Ann. Rev. Genet., 1993. - №27. - С. 437-496.

Pockley A.G. The dual immunoregulatory roles of stress proteins / A.G. Pockley, M. Muthana, S.K. Calderwood // Trends Biochem Sci., 2008.

№33. - С. 71-79.

Taipale M. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights / M. Taipale, D. Jarosz, S. Lindquist // Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2010. - №11. - С. 515-528.

Reference

Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72(1):248-254.

Calderwood, S. K. & Ciocca, D. R. Heat shock proteins: stress proteins with Janus-like properties in cancer. Int. J. Hyperthermia 24, 31-39 (2008).

Calderwood, S. K., Khaleque, M. A., Sawyer, D. B. & Ciocca, D. R. Heat shock proteins in cancer: chaperones of tumorigenesis. Trends Biochem. Sci. 31, 164-172 (2006).

Cappello F, Conway de Macario E, Marasa' L, Zummo G, Macario AJL (2008) Hsp60 expression, new locations, functions and perspectives for cancer diagnosis and therapy. Cancer Biol Ther 7: 801-809.

Ciocca DR, Calderwood SK. Heat shock proteins in cancer: diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications. Cell Stress Chaperones 2005;10:86-103.

Doyle, S. M. et al. Asymmetric deceleration of ClpB or Hsp104 ATPase activity unleashes protein-remodeling activity. Nat. Struct. Mol. Biol.

14, 114-122 (2007).

Ge H, Yan Y, Guo L, Tian F, Wu D. Prognostic role of HSPs in

human gastrointestinal cancer: a systematic review and meta

analysis. Onco Targets Ther. 2018;11:351-359. Published 2018 Jan 15. doi:10.2147/OTT.S155816

Gershenson A, Gierasch LM. Protein folding in the cell: challenges and progress. Curr Opin Struct Biol. 2010;21(1):32-41.

Harada, M., Kimura, G. & Nomoto, K. Heat shock proteins and the antitumor T cell response. Biotherapy 10, 229-235 (1998).

Hartl, F. U. & Hayer-Hartl, M. Converging concepts of protein folding in vitro and in vivo. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 574-581 (2009)

Ishchuk T, Glavachek D, Savchuk O, Yakovlev P, Falaleeva T,

Beregova T, Ostapchenko L. (2018). Plasma levels of MMPs and TIMP-1 in urinary bladder cancer patients. Biomedical Research and Therapy. 5.

1931-1940. 10.15419/bmrat.v5i1.407.

Kaufmann, S. H. Heat shock proteins and the immune response.

Immunol. Today 11, 129-136 (1990).

Lee G.J., Vierling E. A small heat shock protein cooperates with heat shock protein 70 systems to reactivate a heat-denatured protein. Plant Physiol. 2002;122:189-197. doi: 10.1104/pp.122.1.189.

Li, Z., Menoret, A. & Srivastava, P. Roles of heatshock proteins in antigen presentation and cross-presentation. Curr. Opin. Immunol. 14, 4551 (2002).

McClellan, A. J., Tam, S., Kaganovich, D. & Frydman, J. Protein quality control: chaperones culling corrupt conformations. Nat. Cell. Biol. 7, 736-741 (2005)

McConkey DJ, Lee S, Choi W, et al. Molecular genetics of bladder cancer: Emerging mechanisms of tumor initiation and progression. Urol Oncol 2010;28:429 - 40.

Parsell, D. A. & Lindquist, S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins. Ann. Rev. Genet. 27, 437-496 (1993)

Pockley AG, Muthana M, Calderwood SK (2008) The dual immunoregulatory roles of stress proteins. Trends Biochem Sci 33: 71-79.

Taipale, M., Jarosz, D. F. & Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11,515-528 (2010)

Размещено на Allbest.ru