Уровень мРНК CD16A и CD16B как потенциальный иммунологический маркер при колоректальном раке

Размещено на http://www.allbest.ru/

Уровень мРНК CD16A и CD16B как потенциальный иммунологический маркер при колоректальном раке

Красногорова Н.В.

Новиков Д.В.

Фомина С.Г.

Алясова А.В.

РЕЗЮМЕ

Цель исследования - оценить уровни мРНК генов, кодирующих CD16A (FCGR3A) и CD16B (FCGR3B), в периферической крови и опухолях больных колоректальным раком (КРР).

Материалы и методы. В исследование включили 66 больных КРР, проходивших лечение в Нижегородском областном клиническом онкологическом диспансере. Группа сравнения состояла из 111 доноров крови из Нижегородского областного центра крови имени Н.Я. Климовой. Определение относительных уровней мРНК в образцах периферической крови и опухолях проводили методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Результаты. В периферической крови больных КРР уровень мРНК FCGR3A и FCGR3B был статистически значимо ниже, чем у здоровых лиц. Сниженный уровень сохранялся через 7-10 дней после операции. Нормированный уровень мРНК FCGR3A в крови и опухолях больных КРР, а также в крови здоровых доноров в несколько раз превышал уровень мРНК FCGR3В. На II стадии развития опухоли у больных КРР уровень мРНК FCGR3A и FCGR3В статистически значимо понижался, но по мере прогрессии опухоли нормализовался. Умеренная степень дифференцировки опухоли также характеризовалась падением уровня мРНК тестированных генов, при высокой степени дифферен- цировки наблюдалась направленность к падению. Сниженный уровень мРНК FCGR3A и FCGR3В в крови больных обнаруживался при отсутствии метастазов. В образцах опухолей мРНК FCGR3A тестировалась в 95,5% случаев, мРНК FCGR3В - 68,2%. Прогрессирование КРР сопровождалось повышением уровня мРНК FCGR3A в опухолях, уровень мРНК FCGR3В не менялся. Обнаружена положительная корреляционная связь уровня мРНК FCGR3A с уровнем мРНК TNF и FOXP3, что свидетельствует о возможной вовлеченности FCGR3A в регуляцию хронического воспаления в опухолях больных КРР.

Заключение. В крови и образцах опухолей обнаружены изменения уровня мРНК генов, кодирующих молекулы CD16A (FCGR3A) и CD16B (FCGR3A). Результаты свидетельствуют о потенциальной возможности использования данных показателей в качестве мониторинговых иммунологических маркеров при КРР.

Ключевые слова: CD16A, FCGR3A, CD16B, FCGR3B, мРНК, колоректальный рак.

The CD16A and CD16B mRNA level as potential immunological marker in colorectal cancer

Krasnogorova N.V.1, Novikov D.V.1, Fomina S.G.1, Alyasova A.V.2,

Magomedov MA.3, Novikov V.V.1, Karaulov A.V.4

National Research Nizhny Novgorod State University N.I. Lobachevsky (UNN)

Gagarin Av, Nizhny Novgorod, 603950, Russian Federation

Privolzhsky Research Medical University (PRMU)

IO/I, Minin and Pozharsky Sq, Nizhny Novgorod, 603005, Russian Federation

Nizhny Novgorod Regional Clinical Oncology Center

1 Ankudinovskoe Sh, Nizhny Novgorod, 603081, Russian Federation

Sechenov First Moscow Medical University

8/2, Trubetskoy Str, Moscow, 119991, Russian Federation

ABSTRACT

The purpose of this study is to evaluate mRNA levels of genes encoding CD16A (FCGR3A) and CD16B (FCGR3B) in peripheral blood and tumors of colorectal cancer patients (CRC).

Materials and methods. The study included 66 CRC patients from Nizhny Novgorod Regional Clinical Oncology Center and 111 people without cancer as a comparison group from Nizhny Novgorod Regional Blood Center named after N.Ya. Klimova. The mRNA relative levels in peripheral blood and tumor was detected by reverse transcription real-time polymerase chain reaction. The mRNA levels correlation and association with CRC clinical characteristics were assessed by statistic methods.

Results. The study suggests that in the peripheral blood of CRC patients the levels of mRNA FCGR3A and FCGR3B were statistically significantly lower than in healthy individuals. The mRNA levels remained low at 7-10 days after surgery. The FCGR3A mRNA normalized level in the blood and tumors of CRC patients, as well as in the blood of healthy individuals, was several times higher than the FCGR3B mRNA level. At the II stage of tumor development in CRC patients, the FCGR3A and FCGR3B mRNA levels were statistically significantly decreased, but as the tumor progressed is normalized. Moderate degree of tumor differentiation was also characterized by a drop in mRNA levels of the tested genes. Reduced FCGR3A and FCGR3B mRNA levels in the blood of patients were observed in the absence of metastases. In tumor samples, FCGR3A mRNA was tested in 95.5% of cases, FCGR3B mRNA in 68.2% of cases. Progression of CRC was accompanied by an increase in FCGR3A mRNA level in tumors, the FCGR3B mRNA level did not change. Positive correlation of FCGR3A mRNA level with TNF and FOXP3 mRNA levels was found, which indicates the possible involvement of FCGR3A in the regulation of chronic inflammation in tumors of CRC patients.

Conclusion. Changes in mRNA levels of genes encoding CD16A (FCGR3A) and CD16B (FCGR3A) molecules were detected in blood and tumor samples. The results indicate the potential for their use as monitoring immunological markers in CRC.

Key words: CD16A, FCGR3A, CD16B, FCGR3B, mRNA, colorectal cancer.

ВВЕДЕНИЕ

Низкоаффинные рецепторы Ре-фрагментов иммуноглобулинов О III типа (СШ6, РСОКЗ) кодируются у человека двумя генами: FCGR3A и FCGR3B. Экспрессия белка СШ6Л (FCGR3A) характерна для натуральных киллеров. Дополнительно СШ6Л обнаруживается на мембране моноцитов, тканеспецифичных макрофагов, у5Т-лимфоцитов и дендритных клеток. Белок СШ6Б (FCGR3B) является молекулярным маркером нейтрофилов. Также СШ6Б на низком уровне экспрессируется на базофилах и выявляется на эозинофилах после индукции интерфероном у [1]. Оценка экспрессии мембранных молекул СШ6 используется для определения популяционного состава клеток периферической крови и их функционального состояния при различных, в том числе онкологических заболеваниях. Так, при колоректальном раке (КРР) показано, что фенотипическая оценка содержания СШ6+- клеток может быть использована для прогноза выживаемости больных и предсказания ответа на химиотерапию [2]. Однако на транскрипционном уровне детального изучения экспрессии FCGR3A и FCGR3B генов в периферической крови и опухолях больных КРР не проводилось.

Целью исследования явилась оценка уровня мРНК генов, кодирующих СШ6А (FCGR3A) и СШ6Б (FCGR3B), в периферической крови и опухолях больных КРР.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследован биологический материал от 66 больных КРР, проходивших лечение в ГБУЗ НО «Нижегородский областной клинический онкологический диспансер». Для сравнения использовали периферическую кровь от 111 здоровых доноров, полученную из «Нижегородского областного центра крови имени Н.Я. Климовой». От каждого участника было получено информированное согласие на включение в исследование.

Все исследуемые образцы смешивали с равным объемом консервирующего раствора (4 М гуанидин тиоционат, 100 мМ цитрат натрия и O, 1%-й Triton X-100) и хранили при -20 °С до использования. Выделение нуклеиновых кислот проводили методом, предложенным в работе P. Chomczynski и N. Sacchi [3]. Комплементарную ДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MLV (ЗАО «Силекс», Россия) согласно рекомендации производителя. Определение относительного уровня мРНК FCGR3 и фактора некроза опухоли (TNF) проводили с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с использованием амплификаторов DTlite 4 (ООО «ДНК-Техноло- гия», Россия) и CFX96 Touch™ (BioRad, США) в следующих температурных режимах: 94 °С - 10 мин, 50 циклов ПЦР 94 °С - 20 с, 60 °С - 20 с, 72 °С - 20 с. Для мРНК FOXP3 использовали следующие условия: 94 °С - 10 мин, 50 циклов ПЦР 94 °С - 30 с, 55 °С - 30 с, 72 °С - 30 с. Реакционная смесь содержала 70 мМ трис-НС1, pH 8,3, 16 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ Mgd2, 2,5 единицы активности HotTaq-полимеразы (ЗАО «Силекс», Россия), 0,8 мМ дезоксинуклеозидтрифосфатов и по 0,4 нМ каждого из олигонуклеотидов (ЗАО «Синтол», Россия), последовательность которых представлена в табл. 1.

Т а б л и ц а 1 Т a b l e 1

Уровни мРНК рассчитывали по формуле AACt с учетом эффективности реакции [4]. Нормировку уровней мРНК в периферической крови проводили относительно уровня мРНК убиквитина С (UBC), в ткани опухолей - относительно среднего геометрического уровней мРНК (UBC) и тирозин монооксигеназы/триптофан 5-монооксигеназы активационного протеина зета (YWHAZ).

Статистическую обработку данных выполняли методами статистики с помощью компьютерных программ Statistica, версия 8.0 (StatSoft Inc., США) и GraphPad Prism, версия 5.0 (GraphPad Software, США). Исследованные количественные показатели представлены в виде Ме (Qj-Q3), где Ме - медиана, Q - нижний квартиль (25%), (Q3)- верхний квартиль (75%). Для сравнения двух независимых групп по количественным признакам применяли двусторонний критерий Манна - Уитни (U), при сравнении трех и более независимых групп использовали критерий Краскела - Уоллиса (H). Различия между группами считали статистически значимыми при р < 0,05. Для установления связей между уровнями мРНК рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена г.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Определение относительного уровня мРНК генов FCGR3A и FCGR3B в периферической крови доноров и больных КРР показало, что она детектировалась во всех исследованных образцах. Уровень мРНК FCGR3A и FCGR3B в крови первичных больных КРР был статистически значимо ниже, чем у доноров в среднем в 1,5 раза (р < 0,05). Сниженные уровни сохранялись через 7-10 дней после резекции опухоли. Нормированный уровень мРНК FCGR3A у больных КРР и доноров был в среднем в три раза выше уровня мРНК FCGR3B (рис.).

У мужчин, больных КРР, обнаруживалось статистически значимое снижение уровня мРНК FCGR3B в 1,8 раза (р = 0,022) по сравнению со здоровыми мужчинами и отмечалась направленность к снижению уровня мРНК FCGR3A. У женщин, больных КРР, наблюдали лишь тенденцию к снижению уровня мРНК обоих исследуемых генов.

При сопоставлении уровня мРНК FCGR3A и FCGR3B в периферической крови у больных КРР в зависимости от особенностей течения заболевания выявлялся сходный характер их изменений. Так, у больных с высокодифференцированными и умеренно дифференцированными опухолями обнаруживался пониженный уровень мРНК FCGR3A и FCGR3B. У больных с низкодифференцированными опухолями уровень экспрессии тестированных генов в периферической крови был выше и достигал нормальных значений. Обнаружено, что на III, IV стадиях заболевания уровень мРНК FCGR3A и FCGR3B в крови больных КРР находился в пределах нормы, на II стадии был статистически значимо ниже, чем у доноров.

Рисунок. Уровень мРНК FCGR3A и FCGR3B в периферической крови: 1 - доноров (п = 111), 2 - больных КРР при поступлении в стационар и 3 - после оперативного вмешательства (п = 42). * р < 0,05

Figure. The FCGR3A and FCGR3B mRNA level in peripheral blood: 1 - donors, (n = 111), 2 - patients with CRC at admission in hospital (n = 54), 3 - after surgery

(n = 42). * р < 0.05

При этом необходимо отметить, что на I стадии также выявлялся нормальный уровень мРНК тестированных генов. В случае прорастания опухоли в мышечную оболочку (Т2) уровни мРНК обоих генов в крови больных соответствовали нормальным значениям. Дальнейшее прорастание опухоли (Т3) сопровождалось статистически значимым падением уровня мРНК БСОЯЗЛ и БСОЯЗВ (р < 0,05), а на стадии Т4 в крови больных опять регистрировались их уровни, соответствующие таковым у здоровых доноров.

При отсутствии регионарных метастатических узлов уровень мРНК БСОЯЗЛ и БСОЯЗБ был статистически значимо ниже нормы в 2,0 и 2,6 раза соответственно (р < 0,05). Появление регионарных метастатических узлов (N1 и N2) приводило к увеличению уровней мРНК тестируемых генов до нормальных значений. Наличие отдаленных метастазов также сопровождалось нормальным уровнем мРНК БСОЯЗЛ и БСОЯЗБ. На 7-10-й день после удаления опухоли статистически значимых различий в уровне мРНК БСОЯЗЛ и БСОЯЗБ у одних и тех же больных при поступлении в стационар и после оперативного вмешательства не обнаруживалось.

При исследовании уровня мРНК БСОЯЗЛ и БСОЯЗБ в опухолях больных КРР частота обнаружения составила 95,5% (63/66) и 68,2% (45/66) соответственно. При этом медиана уровня мРНК БСОЯЗЛ превышала медиану уровня мРНК БСОЯЗБ в 12,2 раза. Уровень мРНК БСЄЯЗЛ и БСОЯЗБ в опухолях больных разного возраста, пола и с разной степенью дифференцировки опухоли статистически значимо не отличались. На I стадии отмечался наименьший уровень мРНК БСОЯЗЛ, который обнаруживал направленность к повышению, и на IV стадии превышал исходную величину в 3,5 раза (р = 0,04). Наиболее высокий уровень мРНК БСОЯЗЛ выявлялся у больных с множественными метастазами в лимфатические узлы. В отличие от мРНК БСОЯЗЛ уровень мРНК БСОЯЗВ в опухолях не обнаруживал статистически значимых изменений на разных стадиях КРР и в зависимости от наличия и отсутствия метастазов (табл. 2).

Т а б л и ц а 2 Т a b l e 2

Уровень мРНК FCGR3A и FCGR3B в периферической крови и опухолях больных колоректальным раком, Ме (Q--Q3) The FCGR3A and FCGR3B mRNA levels in peripheral blood and tumors of colorectal cancer patients, Me (Q--Q.)

Для оценки связи между провоспалительным окружением клеток опухоли и уровнем экспрессии мРНК FCGR3 у 58 больных КРР определяли относительный уровень мРНК TNF и FOXP3. Уровень мРНК FCGR3A значимо позитивно коррелировал с уровнями мРНК FOXP3 (г = 0,31; р = 0,02) и TNF (г = 0,35; р = 0,09). Связи уровня мРНК FCGR3B с уровнем мРНК TNF и FOXP3 не обнаружено.

ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие КРР сопровождается множественными нарушениями в состоянии иммунной системы, в том числе в количестве клеток, экспрессирующих CD16A и CD16B. На фоне тенденции к повышению числа натуральных киллеров, являющихся основными носителями CD16A, в периферической крови регистрируется снижение их функциональной активности [5]. Кроме того, наблюдается повышение числа CD16B+ нейтрофилов в периферической крови [6]. В соответствии с полученными нами данными, в клетках крови больных КРР обнаруживается ярко выраженная направленность к падению экспрессии обоих генов, кодирующих изоформы СБ16. Наиболее глубокое подавление активности тестированных генов регистрировалось на II стадии КРР. Поздние стадии сопровождались нормализацией уровней мРНК. При этом более выраженные нарушения были выявлены у больных мужского пола, что отражает гендерные различия в картине иммунологических сдвигов при КРР [7]. Полученные данные являются дополнением к картине иммунологических нарушений, связанных с развитием иммуносупрессии при КРР, и демонстрируют снижение клетками крови экспрессии генов, кодирующих СБ16Л и СБ16Б. Различия в уровне мРНК ЯССЯЗА и ЯССЯЗВ на разных стадиях заболевания потенциально могут быть использованы в мониторинговых целях.

Как в периферической крови, так и в опухолях нормированный уровень экспрессии гена ЯССЯЗА многократно превышал уровень экспрессии ЯССЯЗВ. Опухоли характеризовались более высоким соотношением уровня экспрессии ЯССЯЗА и ЯССЯЗВ. Это может быть связано или с незначительной инфильтрацией опухолей нейтрофилами, или с эффектом гибели нейтрофилов в опухолевом микроокружении путем нетоза, который, как недавно продемонстрировано, реализуется с участием CD16B [8]. Прогрессирование КРР сопровождалось повышением в опухолях уровня мРНК FCGR3A, но не FCGR3В. Положительная корреляционная связь уровня мРНК FCGR3A с уровнем мРНК TNF и FOXP3 отражает вероятную вовлеченность экспрессии FCGR3A в регуляцию хронического воспаления в опухолях больных КРР. Ранее нами также была обнаружена корреляция уровня мРНК FCGR3A с экспрессией в опухолях больных КРР генов IL2Ra, MUC1, ICAM1, а также провоспалительного цитокина IL-32 [9].

Ранее показано, что увеличение процентного содержания активированных РОХРЗ-позитивных Т-регуляторных клеток, инфильтрующих опухоль, ассоциировано с присутствием регионарных и отдаленных метастазов у больных КРР [10], а уровень мРНК FOXP3 увеличен в опухолях больших размеров [11]. В нашем исследовании уровень мРНК FCGR3A также был повышен в опухолях больных с множественными регионарными метастазами, что указывает на вероятную связь высокого уровня мРНК FCGR3A с прогрессированием опухолевого процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нормированный уровень мРНК FCGR3A в крови и опухолях больных КРР, а также в крови здоровых доноров в среднем в несколько раз превышал уровень мРНК FCGR3В. На II стадии КРР уровень мРНК FCGR3A и FCGR3В понижались, но по мере прогрессирования опухоли нормализовались. Сниженный уровень мРНК FCGR3A и FCGR3В в крови больных наблюдался при отсутствии метастазов. Прогрессирование КРР сопровождалось повышением в опухолях уровня мРНК FCGR3A, уровень мРНК FCGR3E не менялся. Обнаружена положительная корреляционная связь уровня мРНК FCGR3A с уровнем мРНК TNF и FOXP3, что свидетельствует о возможной вовлеченности FCGR3A в регуляцию хронического воспаления в опухолях больных КРР. Результаты свидетельствуют о потенциальной возможности использования при КРР уровня мРНК FCGR3A и FCGR3B в качестве иммунологического маркера в мониторинговых целях.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

Gillis C., Gouel-Cheron A., Jonsson F., Bruhns P. Contribution of human FcyRs to disease with evidence from

human polymorphisms and transgenic animal stud

ies. Front. Immunol. 2014; 5: 254. DOI: 10.3389/fim- mu.2014.00254.

Schauer D., Starlinger P., Alidzanovic L., Zajc P., Maier T., Feldman A., Padickakudy R., Buchberger E., Elleder V., Spittler A., Stift J., Pop L., Gruenberger B., Gruenberger T., Brostjan C. Chemotherapy of colorectal liver metastases induces a rapid rise in intermediate blood monocytes which predicts treatment response. Oncoimmunology. 2016; 5 (6): e1160185. DOI: 10.1080/2162402X.2016.1160185.

Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature protocols. 2006; 1 (2): 581-585. DOI: 10.1038/ nprot.2006.83.

Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-“CT Method. Methods. 2001; 25 (4): 402-408. DOI: 10.1006/meth.2001.1262.

Rocca Y.S., Roberti M.P., Julia E.P., Pampena M.B., Bruno L., Rivero S., Huertas E., Sanchez Loria F., Pairola A., Caignard A., Mordoh J., Levy E.M. Phenotypic and functional dysregulated blood NK cells in colorectal cancer patients can be activated by cetuximab plus IL-2 or IL- 15. Front. Immunol. 2016; 7: 413. DOI: 10.3389/fim- mu.2016.00413.

Shaul M.E., Fridlender Z.G. Cancer related circulating and tumor-associated neutrophils - subtypes, sources and function. FEBS J. 2018 (в печати). DOI: 10.1111/febs.14524.

Klein S.L., Flanagan K.L. Sex differences in immune responses. Nat. Rev. Immunol. 2016; 16 (10): 626-638. DOI: 10.1038/nri.2016.90.

Millrud C.R., Kagedal A., Kumlien Georen S., Winqvist O., Uddman R., Razavi R., Munck-Wikland E., Cardell L.O. NET-producing CD16high CD62Ldim neutrophils migrate to tumor sites and predict improved survival in patients with HNSCC. Int. J. Cancer. 2017; 140 (11): 25572567. DOI: 10.1002/ijc.30671.

Новиков Д.В., Фомина С.Г., Гурина Н.Н., Перен- ков А.Д., Красногорова Н.В., Шумилова С.В., Луков- никова Л.Б., Новиков В.В., Караулов А.В. Корреляция экспрессии MUC1, ICAM1, IL32, FcyR3A и FoxP3 в опухолевых очагах больных раком молочной железы. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62 (1): 35-39. [Novikov D.V., Fomina S.G., Gurina N.N., Peren- kov A.D., Krasnogorova N.V., Shumilova S.V., Lukovni- kova L.B., Novikov V.V., Karaulov A.V. The correlation of expression of MUC 1, ICAM 1, IL 32, FcyR3A and FoxP3 in tumor nidus of patients with breast cancer. 2017; 62 (1): 35-39 (in Russ.)].

Lin Y.C., Mahalingam J., Chiang J.M., Su P.J., Chu Y.Y., Lai H.Y., Fang J.H., Huang C.T., Chiu C.T., Lin C.Y. Activated but not resting regulatory T cells accumulated in tumor microenvironment and correlated with tumor progression in patients with colorectal cancer. Int. J. Cancer. 2013; 132 (6): 1341-1350. DOI: 10.1002/ijc.27784. колоректальный рак опухоль

Ganapathi S.K., Beggs A.D., Hodgson S.V., Kumar D.

Expression and DNA mйthylation of TNF, IFNG and FOXP3 in colorectal cancer and their prognostic sig- nificance. Br. J. Cancer. 2014; 111 (8): 1581-1589. DOI: 10.1038/bjc.2014.477.

Размещено на Allbest.ru