Свободная ДНК в фолликулярной жидкости у женщин с различными показателями овариальной функции

Pasman N.M.2, Kozlov V.A.1, Chernykh E.R.1

The aim of the study was to evaluate cell-free DNA (cfDNA) in the follicular fluid (FF) of women undergoing IVF treatment and to analyze the relationship between cfDNA levels and the parameters of folliculogenesis and oogenesis as well as the quality of embryos.

Materials and methods. The study included 53 women aged 20 to 45 years. In 49 patients, oocytes were obtained by stimulating ovulation with gonadotropins, and 4 patients underwent natural cycle IVF without hormonal stimulation. Measurement of cfDNA was carried out by fluorimetry using QuantiFluor™ Handheld Fluorometers (BioSilica, Russian Federation).

Results. The FF of women with ovulation stimulation revealed a higher level of cfDNA as opposed to FF of women in the natural cycle. There were no differences in the cfDNA levels in women with infertility and oocyte donors. Women with infertility lasting for more than 5 years had a higher level of cfDNA. Women with the elevated anti-Mullerian hormone (AMH) levels were characterized by the high FF cfDNA concentration and a large number of follicles. Likewise, correlation analysis showed that FF cfDNA was significantly and positively correlated with the AMH level. The obtained data revealed the participation of cfDNA in different stages of oogenesis.

Conclusions. The level of FF cfDNA in women may serve as an additional biomarker of the effectiveness of ovulation induction.

Key words: cell free DNA, follicular fluid, IVF, ovarian reserve, infertility.

Введение

Среди различных биомаркеров патологических процессов свободная внеклеточная ДНК (свДНК) в последнее время привлекает большое внимание [1]. Несвязанная с клетками ДНК выявляется в различных биологических жидкостях организма [2-4], ее концентрация возрастает при целом ряде заболеваний (онкологические, аутоиммунные, посттравматический синдром) [5-9], включая акушерско-гинекологическую патологию [10], что обусловливает интерес к исследованию диагностической и прогностической значимости свДНК [11-14].

Наличие свДНК в фолликулярной жидкости (ФЖ) связано с апоптозом и некрозом клеток, окружающих растущий ооцит по мере интенсивного роста фолликула [15]. В этом аспекте концентрация свДНК в ФЖ может являться дополнительным показателем влияния стимуляции гонадотропинами на процесс фолликулогенеза и оогенеза. Оценка овариального резерва женщины является обязательным условием для подбора оптимального протокола стимуляции овуляции в программе вспомогательных репродуктивных технологий. Для этого перед вступлением в программу экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у женщины определяют уровень антимюллерового гормона (АМГ) и число антральных фолликулов (АФ) [16-18]. Однако определение этих показателей не во всех случаях позволяет правильно подобрать оптимальную дозу гонадотропинов для стимуляции овуляции, что чревато развитием опасного синдрома гиперстимуляции яичников. Поэтому уровень свДНК в ФЖ может представлять интерес в качестве дополнительного маркера эффективности ответа яичников на стимуляцию. Еще одним важным параметром, определяющим успешное развитие эмбриона и наступления беременности, является качество ооцитов, во многом определяющее исходы ЭКО. Однако значение свДНК как показателя овариального резерва и биомаркера эффективности стимуляции овуляции остается недостаточно исследованным. Таким образом, целью работы явились оценка уровня свДНК в образцах ФЖ женщин, находящихся в программе ЭКО, и анализ взаимосвязи свДНК с клиническими параметрами и показателями овариальной функции, фолликуло- и оогенеза.

Материалы и методы

В исследование были включены 53 женщины, из них 49 проводили стимуляцию овуляции гонадотропинами, четырем пациенткам процедуру ЭКО осуществляли в естественном цикле. Отдельную группу составили 5 фертильных женщин - доноры ооцитов, у которых для стимуляциии овуляции также использовали гонадотропины. Забор материала осуществляли на базе ООО "Клиника профессора Пасман" (г. Новосибирск), последующая обработка ФЖ и исследование содержания свДНК в ФЖ проводили в лаборатории НИИФКИ (г. Новосибирск). Возраст женщин с бесплодием варьировал от 20 до 45 лет (медиана 33,2), из них женщины раннего репродуктивного возраста (<35 лет) составили 56,6%, позднего (>35 лет) - 43,4%; длительность бесплодия - от 1 года до 18 лет (медиана 7,1). Первичное бесплодие было диагностировано у 52% женщин, вторичное - у 48 (таблица). Причиной бесплодия в 13% случаев был мужской фактор, в 87% случаев - женское бесплодие. Причиной женского бесплодия в 45% случаев являлся трубно-перитонеальный фактор, 5% - эндокринный фактор, 50% - сочетанное бесплодие.

Таблица

Cвободная ДНК в фолликулярной жидкости у женщин с различными клиническими параметрами, нг/мл Cell free DNA in the follicular fluid in women with different clinical parameters, ng/ml

*p - достоверность различий по U-критерию Манна - Уитни.

*p - statistical significance of the differences using Mann - Whitney test.

Гормональный статус определяли на 2--3-й день менструального цикла у каждой пациентки. Средний уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона и простагландина Е 2 в указанные сроки составлял, соответственно, 8,4 ± 4,7 МЕ/л; 6,2 ± 5,6 МЕ/л и 178 ± 175,2 пмоль/л. Процедура ЭКО (инсеминация in vitro) была проведена у 47% женщин, интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (IntraCytoplasmic Sperm Injection, ICSI, ИКСИ) - у 53%. Выбор протокола стимуляции опирался на анамнез и овариальный резерв женщины: 44 из них стимулировали по протоколу антагонистов (короткий протокол), 5 женщин - по протоколу агонистов ГнРг (длинный протокол). Стимуляция яичников проводилась препаратами рекомбинантного или менопаузального ФСГ. Ответ яичников на стимуляцию контролировали путем ультразвуковой оценки роста фолликулов и эндометрия.

Третью группу составили 4 женщины в естественном цикле без введения препаратов ФСГ. Стимуляция овуляции у всех пациенток индуцировалась инъекцией 250 мкг человеческого хорионического гонадотропина, когда один доминирующий фолликул (естественный цикл) или три и более фолликула (стимулированный цикл) достигали диаметра 18 мм при ультразвуковом исследовании. Через 36 ч с момента введения триггера овуляции проводили извлечение ооцитов с помощью трансвагинальной ультразвуковой аспирации. В этот момент осуществлялся сбор образцов ФЖ из доминантных фолликулов. В случае видимой контаминации образцов ФЖ кровью исследование не проводили. Образцы ФЖ центрифугировали при 2 000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость собирали, замораживали и хранили при температуре -80 °С. Концентрацию ДНК оценивали флуориметрическим методом с использованием прибора QuantiFluor™ Handheld Fluorometers и коммерческих наборов Blood DNA Isolation Kit фирмы BioSilica Ltd. (г. Новосибирск) в соответствии с инструкциями производителя.

Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета прикладных программ Statistica 6.0 для Windows. Для выявления значимых различий сравниваемых показателей использовали критерий Манна - Уитни (U) для непарных выборок. Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции Спир- мана (r). Данные представлены в виде медианы, интерквартильного диапазона Ме (LQ--UQ), минимальных и максимальных значений Min-Max. фолликулярный экстракорпоральный оплодотворение

Результаты

Проведенные исследования выявили наличие в ФЖ женщин со стимуляцией овуляции наличие свДНК, уровень которой варьировал в пределах 19,8-65,9 нг/мл (медиана Ме 40,3 нг/мл). Характерно, что образцы ФЖ, полученные в естественном цикле (без введения гонадотропинов), содержали достоверно меньшие концентрации свДНК, чем ФЖ женщин со стимулированной овуляцией (26,8 vs 40,3 нг/мл; ри = 0,03) (рис. 1, а). То есть стимуляция овуляции ассоциировалась с более высоким содержанием в ФЖ свДНК, чем овуляция в естественном цикле. При этом в циклах стимулированной овуляции женщины с бесплодием не отличались по уровню свДНК от женщин- доноров ооцитов (40,3 vs 43,8 нг/мл; ри = 0,44), на основании чего эти группы были объединены при последующем анализе.

Учитывая исходную клиническую гетерогенность исследуемой группы, первоначально было проанализировано, влияют ли такие факторы, как возраст, длительность бесплодия, а также форма и причина бесплодия на уровень свДНК. Анализ образцов ФЖ женщин раннего (<35 лет) и позднего (>35 лет) репродуктивного возраста не выявил достоверных различий в уровне свДНК (рис. 1, b). В то же время умеренно выраженные, но статистически достоверные различия в концентрации свДНК были выявлены в группах с различной продолжительностью бесплодия. Так, в ФЖ женщин с бесплодием более 5 лет уровень свДНК был выше, чем в группе с длительностью бесплодия <5 лет (36,6 уз 40,9 нг/мл; ри = 0,03) (рис. 1, с). Уровень свДНК в группах женщин с первичным и вторичным бесплодием (40,0 уз 41,1 нг/мл), мужским и женским факторами бесплодия (40,9 уз 39,2 нг/мл), а также с различными факторами женского бесплодия (трубно-перитонеальным, эндокринным, сочетанным) значимо не различались (см. таблицу). Учитывая отсутствие сопряженности свДНК с большинством клинических параметров, изучение взаимосвязи между количеством свДНК и параметрами, характеризующими фолликуло- и оогенез, проводилось в общей группе пациенток.

Рис. 1. Уровень свДНК в фолликулярной жидкости у бесплодных женщин с различными клиническими параметрами: а - в стимулированном (группа 1) и естественном (группа 2) циклах; b - в возрастных группах <35лет (группа 1) и >35 лет (группа 2); c - в группах с продолжительностью бесплодия <5лет (группа 1) и >5 лет (группа 2). Здесь и в рис. 2: данные представлены в виде медианы, интерквартильного диапазона (LQ-UQ), Min-Max. *pu < 0,05; ** pu< 0,01 (критерий Манна - Уитни)

Fig. 1. The level of cfDNA in follicular fluid in women with different clinical parameters: а - in stimulated (group 1) and natural (group 2) cycles; b - in the age groups <35 years (group 1) and > 35 years (group 2); с - in groups with duration of infertility <5 years (group 1) and >5 years (group 2). Here and in Fig. 2 : data are presented as a median (Me), interquartile range (LQ- UQ), Min-Max. * pu < 0.05; ** pu < 0.01 (Mann - Whitney test)

Одним из важных параметров при определении тактики ЭКО и подборе протокола стимуляции является овариальный резерв женщин, который включает оценку базального уровня АМГ и числа АФ. Поэтому на первом этапе исследовали взаимосвязь между данными показателями и содержанием свДНК в ФЖ. В зависимости от ко личества АФ, способных отвечать на стимуляцию суперовуляции, женщин разделили на три группы: АФ <5 (группа 1); АФ 5-14 (группа 2); и АФ >14 (группа 3). Уровень свДНК в группе 3 был в 1,3 раза выше, чем в группе 1 (47,8 уз 37,8; ри = 0,04) (см. рис. 2, а). Тем не менее достоверной корреляционной связи между указанными параметрами не выявили (г = 0,22; р = 0,1).

Рис. 2. Уровень свДНК в фолликулярной жидкости у бесплодных женщин в стимулированных циклах овуляции в зависимости от показателей овариального резерва, количества фолликулов и ооцитов: а - АФ < 5 (группа 1), АФ 5-14 (группа 2) и АФ >14 (группа 3); Ь - уровень АМГ <1,0 нг/мл (группа 1), 1,0--6,0 нг/мл (группа 2), >6,0 нг/мл (группа 3); с - количество ову- ляторных фолликулов <12 (группа 1), >12 (группа 2); й - количество ооцитов <4 (группа 1), 4-8 (группа 2), >8 (группа 3)

Fig. 2. The level of cfDNA in the follicular fluid in women in stimulated ovulation cycles, depending on the parameters of the ovarian reserve and the number of follicles and oocytes. The data are presented on the content of cfDNA: a - AF <5 (group 1), AF 5-14 (group 2) and AF >14 (group 3); b - level of AmG < 1.0 ng/ml (group

1) , 1.0-6.0 ng/ml (group 2), > 6.0 ng/ml (group 3); c - number of ovulatory follicles <12 (group 1), >12 (group

2) ; d - number of oocytes <4 (group 1), 4-8 (group 2), >8 (group 3).

В зависимости от уровня АМГ все женщины также были разделены на три группы: с низким (<1,0 нг/мл; группа 1), средним (1,0-6,0 нг/мл; группа 2) и высоким (>6,0 нг/мл; группа 3) уровнем гормона. Содержание свДНК в ФЖ у женщин группы 3 было достоверно выше, чем у женщин группы 2 (53,7 уз 38,5; ри = 0,01) и в виде выраженного тренда превышало аналогичный показатель в группе 1 (53,7 уз 41,0; ри = 0,059) (рис. 2, Ь). При этом между уровнем АМГ и концентрацией свДНК отмечалась умеренная прямая корреляционная взаимосвязь (г = 0,31; р = 0,03).

Важно отметить, что ответ яичников на стимуляцию существенно различался, что проявлялось вариациями в количестве овуляторных фолликулов и полученных ооцитов. Оценка содержания свДНК с учетом данных параметров показала, что концентрация свДНК в образцах ФЖ женщин с высоким количеством овуляторных фолликулов (>12) составляла 44,2 (40,0-53,6) нг/ мл и была достоверно выше, чем у женщин с меньшим (<12) количеством фолликулов 36,6 (29,8-47,5) нг/мл; ри = 0,04 (см. рис. 2, с). Однако значимой корреляционной связи между указанными параметрами не выявили (г = 0,25; р = 0,1). Для анализа взаимосвязи свДНК с количеством ооцитов, получаемых при трансвагинальной пункции яичников, женщин разделили на три группы - с низким (<4; группа 1), средним (4-8; группа 2) и высоким (>8; группа 3) содержанием ооцитов. Уровень свДНК в ФЖ женщин в сформированных группах значимо не различался (см. рис. 2, с 1).

Обсуждение

Одной из важнейших задач при подборе протокола стимуляции яичников у женщин, находящихся в программе ЭКО, является оценка овариального резерва. Выбор оптимального протокола позволяет получить оптимальное число фолликулов и, соответственно, достаточное число ооцитов и эмбрионов, чтобы отобрать для переноса эмбрионы высокого качества. У пациенток с нарушениями овариального резерва подобная задача становится фактически неразрешимой. Полученные нами данные показали сопряженность свДНК с уровнем сывороточного АМГ и количеством АФ, которые, по данным литературы, характеризуют овариальный резерв [16, 18]. В частности, у женщин с повышенным уровнем АМГ (>6 нг/мл) регистрировалась наиболее высокая концентрация свДНК, при этом между указанными параметрами обнаруживалась прямая корреляционная взаимосвязь. Это, по-видимому, связано со способностью АМГ (в высоких концентрациях) вызывать в клетках гранулозы оксидативный стресс и индукцию Раз/РаБЬ- опосредованного апоптоза, что сопровождается высвобождением свДНК [15].

Высокий уровень АМГ наиболее часто выявляется при большом количестве АФ у женщин с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ) и мультифолликулярными яичниками. Так, б. Тгауег и соавт. выявили повышенный уровень свДНК в группе женщин с СПКЯ [14]. В настоящем исследовании продемонстрировано, что наличие большого числа АФ (>14) у женщин с мультифолликулярными яичниками также ассоциируется с высокой концентрацией свДНК. Интересно отметить, что б. Тгауег и соавт. в своих исследованиях выявили повышенный уровень свДНК (в виде тренда) не только в группе с СПКЯ, но и у женщин со сниженным овариальным резервом.

Одним из новых фактов, полученных в нашем исследовании, стали данные о сопряженности высоких концентраций свДНК с большим количеством овуляторных фолликулов. Это, по-видимому, объясняется тем, что созревание большого количества фолликулов при стимуляции гонадотропинами сопровождается выраженными процессами апоптоза клеток гранулезы [24].

По данным литературы, крупные фолликулы с ооцитами высокого качества содержат меньше свДНК, чем мелкие фолликулы с незрелыми ооцитами [21]. В наших исследованиях мы не выявили различий в концентрации свДНК в зависимости от количества ооцитов. Возможно, это связано с тем, что для исследований отбирали образцы ФЖ только из крупных фолликулов. Таким образом, уровень свДНК в ФЖ может служить дополнительным биомаркером эффективности ответа яичников на стимуляцию гонадотропинами.