Выращивание и характеризация тканеинженерной конструкции из гладкомышечных клеток коронарной артерии сердца человека

Приготовление матрицы из полидиметилсилоксана и клеточной смеси. В работе была использована ПДМС-матрица с горизонтальной поддержкой ТК (титановая проволока диаметром 0,25 мм и длиной 12 мм, Sigma-Aldrich, США). В процессе приготовления матрицы сначала был сделан шаблон с шестью полостями из монолитного акрилового пластика при помощи сверла диаметром 0,79 мм и фрезерного станка с числовым программным управлением (MicroProtoSystems, США). В каждую полость были вставлены две тонкие кромки из того же материала для формирования каналов для поддерживающей титановой проволоки.

Полости заливали жидким ПДМС (SYLGARD 184 kit, DowCorning, США), смешанным с отвердителем в пропорции 10:1, и дегазировали. Затем собранную конструкцию помещали в печь на 6 ч для полимеризации при 65 °С. Конечная ПДМС-матрица имела канал глубиной 3 мм, шириной 2 мм и длиной 12 мм, а также две борозды для размещения анкерной проволоки. Далее каждую ПДМС-матрицу переносили в лунку 6-луночного планшета, где приклеивали ко дну при помощи жидкого ПДМС. Каналы ПДМС-устройств были обработаны 0,2%-м раствором Pluronic F-127 (Sigma-Aldrich, США) для увеличения гидрофобности стенок и промыты деионизированной водой. Затем планшеты были стерилизованы ультрафиолетовым излучением в течение 30 мин. гладкомышечный тканевый сосудистый

Для выращивания ТК из коммерческих ГМК (HCASMC, ThermoFisher, США) была приготовлена клеточная смесь на основе фибрина. Показано, что продукты деградации фибрина в процессе созревания конструкции способствуют пролиферации ГМК и стимулируют формирование внеклеточного матрикса [11]. В предварительных экспериментах по оптимизации условий формирования конструкции использовали клеточную смесь фибробластов и ГМК в пропорции 1:10. В случае использования только ГМК конечная концентрация клеток и остальных компонентов среды была той же самой.

Сердечные фибробласты (NHCF-V, Lonza, США) и ГМК были собраны с культуральных флаконов Т-175 (Thermo Fisher Scientific, США) при помощи TrypLE Express Enzyme (Thermo Fisher Scientific, США). Общая концентрация клеток была доведена до 106, 2 х 106 либо 4 х 106 клеток/мл, после чего клетки смешали с фибриногеном (100 мкл, 20 мг/мл, Sigma-Aldrich, США), апротинином (33 мкг/мл, Sigma-Aldrich, США), тромбином (10 мкл, 100 ЕД/мл, Sigma-Aldrich, США), а также добавили антибиотики пенициллин и стрептомицин (1%-й, Gibco, США). Помимо этого, в зависимости от условий добавляли Matrigel (100 мкл, BD Biosciences, США). После разведения конечная концентрация клеток была 0,5 х 106, 106 или 2 х 106 клеток/мл. Затем смесь была пипетирована в канал каждого ПДМС-устройства. Планшеты инкубировали при 37 °С и 5%-м CO2 в течение 1 ч для полимеризации фибрина, после чего в каждую лунку добавили по 3 мл среды Gibco Medium 231 (Thermo Fisher Scientific, США) с апротинином (33 мкг/мл, Sigma-Aldrich, США), транексамовой кислотой (400 мкМ, Sigma-Aldrich, США), антибиотиками (1%-й, Gibco, США) и ростовой добавкой для пролиферации (Gibco Smooth Muscle Growth Supplement, SMGS; Thermo Fisher Scientific, США) либо для дифференциации клеток (Gibco Smooth Muscle Differentiation Supplement, SMDS; Thermo Fisher Scientific, США).

Среду заменяли каждый 2-й день. После формирования ТК, их механоэластические свойства были измерены с помощью системы оптической регистрации на основе инвертированного микроскопа (рис. 1). Созревшие гладкомышечные волокна имели 350-450 мкм в диаметре и 7 мм в длину (рис. 2,

а).

пластина-держатель, 3 - консоль, 4 - магнит, 5 - гибкий сенсор, 6 - ПДМС-матрица с конструкцией, 7 - лунка планшета, 8 - моторизованная платформа, 9 - объектив, 10 - камера, 11 - инвертированный микроскоп, 12 - компьютер, 13 - микроконтроллер

Рис. 2. Калибровочный график упругости и кадры смещения кончика гибкого сенсора: а - общий вид тканевой конструкции и центральная часть с концом гибкого сенсора, размер масштабной шкалы 300 мкм; Ь - график, показывающий линейную зависимость изменения массы от смещения положения консоли с гибким сенсором (п = 5, г = 0,99997); с - обработанные бинарные изображения положения сенсора при поэтапном смещении моторизованной платформы с планшетом

Устройство для измерения механоэластических свойств тканеинженерных конструкций. Для измерения модуля продольной упругости был использован гибкий зонд из полиэфирэфиркетона (Putnam Plastics, США) с наружным диаметром 365 мкм, диаметром отверстия 120 мкм и длиной 42 мм. Зонд был приклеен к консоли из органического стекла, которая в свою очередь прикреплена к пластине-держателю с двумя магнитами для контроля положения зонда. Консоль, пластина-держатель и гибкий зонд были смонтированы при помощи фрикционного крепления к конденсору инвертированного флуоресцентного микроскопа (Eclipse Ti, Nikon, США), оснащенного микроконтроллером (MS-2000 Flat-Top XYZ Automated Stage, ASI, США), который позволяет точно перемещать платформу по двум измерениям (см. рис. 1).

Упругость гибкого сенсора была откалибрована и имела линейную зависимость деформапшг от приложенной силы (рис. 2, b). Оптическая регистрация смещения кончика гибкого зонда осуществлялась при помощи цифровой камеры (ZylasCMOS Camera, Andor Technology, Северная Ирландия) через равные интервалы смещения платформы с планшетом так, что каждое смещение соответствовало определенной приложенной силе, величине которой вычинили, используя калибровочный график.

Протоколы измерений и имм^/нигостоаимиоесков окрашивание. В эксперименте применяли два протокола. Первый протокол заключался в серии последовательных измерений положения концов гибкого зонда при смещении платформы на каждые 200 мкм перед внесением веществ и после интубации с веществами в течение двух часов. Согласно второму идотоколу, регистрации были проведены при постоянной приложенной силе = 0,062иО в теионое йВтиу. В течение первых 15 мин были выполнены контрольные регистрации, после чего были последовательно внесены блеббистатин (Бб) в концентрации -Є моМ через 20 мин и цитохалазин Д (Цито-Д) в концентрации 50 мкМ через 55 мин от нттоарпротиропв. Два оценки способности клеток отвечать на Р-адренергическую и холинэргическую стимуляцию ТК был инкубирован в стандартных средах, содержащих 1 мкМоль изопротеренола КИно) --аипа-АЫЫаЬ, США) и 5 мкМ ацетилхолина (Ацх) (Sigma-Aldrich, США) в течение 60 мин.

Блеббистатин и Цито-Д применяли до оценки влияния фармакологических стимулов на сократительную функцию и эластичность внеклеточного матрикса ТК. Блеббистатин является обратимым ингибитором АТФ-азной активности миозина II [12], в то время как цитохалазин Д блокирует полимеризацию актина, тем самым нарушает организацию сети фи- ламентов цитоскелета и при этом не влияет на внеклеточный матрикс [13].

Для иммуногистохимического окрашивания тканевые конструкции сначала фшсеиговали із 4%-м растворе парафармальдегида в течение 15 мин, отмывали трехкратно с помощью натрий-фосфатного буфера, затем помещали в парафин и делали срезы толщиной 5 мкм. Доступность антигенов обеспечивали инкубацией срезов они ЫИбЗиК) мМ растворе цитрате натрия (рН 6,0) в течение 10 мин. Были использованы первичные мышиные моноклональные антитела к а-актину мышечных клеток (а-SMA) (Sigma-Aldrich, США), моноклональные антитела кролика к десмину(АЬяат, США) и вторичные антитела против мыши (Thermo Fisher,

США) и кролика (Thermo Fisher, США), конъюгированные с Alexa (568 и 488 нм), а также краситель для окрашивавши ядер DAPI (Fluoromount-G368/451, Sauthern Biotech, США). Регистрацию цветных изо- браженгш делшги наконфокшгьном микроскопе Zeiss LSM780 (Carl Zeiss, Германия).

Анализ и статистическая обработка данных. Анализ изображений проводили в программной cpeде кадра была подобрана таким образом, чтобы оставался виден только конец гибкого зонда, после чего зоздавзюсь 0итарннеизрбр:жеш 1Р авычаслярнсо координаты центра окружности в каждом кадре (ррр. 2, с). Pp дхновд пооиьсоных дакрыр вогаисио- лись изменение длины ТК, значение силы, действующей вдоль конструкции (Fc), и значение модуля [ 14]:

где Fc - сила, действующая вдоль ТК, С 0 - исходная длина ТК, Ао - площадь поперечного сечения, AL - изменениедлины ТК.

Учитывая положение ТК в пространстве, формула дет вычисления модуля упругости была модифицирована следующим образом [9]:

где Ft - сила, прикладываемая гибким зондом, ds - расстояние между начальным и текущим положением платформы, dt - расстояние между начальным и текущим положением конца гибкого зонда, a - половина длины конструкции в расслабленном состоянии, D - диаметр тканеинженерной конструкции. Диаметр ТК вычислялся на основе среднего значения трех измерений - в срединной точке и двух точках на расстоянии 1 мм справа и слева от срединной точки.

Статистический анализ проводился с помощью коммерческих программ Microsoft Excel (Microsoft Corporation, США) и OriginLab R2018 (OriginLab Corporation, США). Статистические сравнения между контрольной и опытной группой были сделаны при помощи ^-критерия Стьюдента для зависимых выборок, одномерного дисперсионного анализа для повторных измерений (ANOVA) в случае трех и более групп, а также с использованием непараметрического парного критерия Вилкоксона. Изменение длины в ответ на приложенную силу, измеренное в процентах от изначальной длины препарата, представлено в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего. Различия в полученных результатах считались статистически достоверными при уровне значимости р < 0,05. В процессе калибровки гибкого сенсора для оценки линейности его упругих свойств в зависимости от нагрузки применяли корреляционный анализ.

Результаты и обсуждение

Основные результаты предварительных экспериментов по оптимизации протокола показали следующее: использование культуральной среды с добавкой SMDS не вызывало формирование тканевых фибрилл; добавление Майще 1 ускоряло конденсацию геля и образование гладкомышечных тканеинженерных структур; концентрация ГМК 106 клеток/мл является оптимальной и способствует быстрому формированию конструкций; добавление 10% фибробластов не влияло на скорость формирования конструкций.

Для структурной характеризации конструкций использовали метод флуоресцентной микроскопии. На рис. 3 представлено иммуногистохимическое окрашивание ТК на а-актин гладких мышц, десмин и ядерное ДНК с использованием БАР 1, а также окраска гематоксилином и эозином. Наибольшую белковую фракцию в ГМК составляет а-актин, он также выполняет основную роль в сокращении при взаимодействии с миозином и через полимеризацию участвует в формировании цитоскелета [15]. Десмин является основным белком, составляющим промежуточный филамент сократительного аппарата, и локализован в Z-пластинке поперечно полосатой мышцы и в плотных тельцах гладкой мышечной ткани [16]. Данные иммуногистохимического окрашивания демонстрируют структурную однородность тканеинженерных волокон, равномерное и плотное распределение гладкомышечных клеток в конструкциях.

Рис. 3. Иммуногистохимический анализ продольных срезов конструкции: a - окраска ядерной ДНК при помощи DAPI; b, c - окрашивание на основные маркеры сократительного фенотипа а-актин (красный) и десмин (зеленый); d - объединенное изображение; е - окраска гематоксилином и эозином. Размер масштабной шкалы - 100 мкм

Для проверки стабильности механоэластических свойств ТК были выполнены контрольные измерения в течение 7 дней после сформирования конструкций. Диаграмма растяжения представлены на рис. 4, а. Линейную часть диаграммы использовали для вычисления модуля упругости (рис. 4, Ь). Существенное удлинение ТК наблюдается при приложении попе ечной силы растяжения (Г) больше 0,07 мН. Анализ диаграмм растяжения не выявил статистически значимых изменений между измерениями в 1-, 3- и 7-й дни (Г (2,10) = 0,225; р = 0,8; п = 6). Значение модуля упругости составило 7,4 ± 1,5 кПа в начале эксперимента, 7,9 ± 1,4 кПа на 3-й день и 7,8 ± 1,9 кПа - на 7-й день соответственно.

В литературе данные эластичности гладкомышечных ТК варьируют в зависимости от способа выращивания - при статической либо переменной нагрузке; состава среды культивирования; геометрии конструкций - кольцевые [5, 6], фибрилообразные [7]; типа наполнителя клеточной смеси - коллаген, фибрин, а также от происхождения клеток и их количественного соотношения с наполнителем [5, 17-20]. Данные, полученные в отдельных ГМК, менее вариабельны и в основном определяются фенотипом клеток [21-23]. В частности, при измерении эластичности методом атомно-силовой микроскопии в конструкциях, выращенных с использованием гладкомышечных клеток, изолированных из грудной части аорты обезьяны (Масаса fascicularis) и коллагенового матрикса, были получены значения модуля упругости в пределах 13,7 ± 2,4 и 23,3 ± 3,0 кПа [24].

Наблюдаемую вариабельность авторы связывают с возрастными изменениями экспрессии актина и Р 1-субъединицы интегрина [25]. Оценка эластичности с помощью того же метода, проведенная в отдельных ГМК, полученных из грудной аорты здоровых молодых крыс линии Вистар, варьирует в пределах 5-14 кПа [21, 23]. Близкие значения модуля эластичности (--13,7 кПа) были продемонстрированы в отдельных ГМК, изолированных из артериол скелетных мышц крысы линии Спрег-Доули и культивированных в течении 3-7 дней после первого пассажа [22].

Изометрическое измерение эластичности, выполненное D. Seliktar и соавт. с помощью датчика силы в кольцевых трехмерных гладкомышечных конструкциях, выращенных в коллагеновом матриксе (2 мг/мл) из клеток грудной аорты крыс (106 клеток/мл), после 8 дней культивирования показало значения равное 68 кПа [18]. В другой работе, где авторы сравнивали эластические свойства кольцевых конструкций, созданных на основе фибрина (2 мг/мл) и коллагена (2 мг/мл) с использованием того же типа ГМК (аорта крысы, 106 клеток/мл), было показано, что после 5 дней культивирования коллагеновые конструкции обладают значительно большей жесткостью (191 кПа) по сравнению с фибриновыми (19 кПа) [20]. Увеличение концентрации коллагена и фибрина в клеточной смеси до 4 мг/мл увеличивало жесткость до 242 и 28 кПа соответственно.

Показатели эластичности гладкомышечных ТК, полученные в нашей работе, близки к таковым в отдельных ГМК. Это объясняется использованием фибрина в клеточной смеси. Матрикс на основе фибрина широко применяется в тканевой инженерии [26]. Фибриновый гель обладает вазоактивными и высокими адгезивными свойствами, способствует быстрой адаптации и пролиферации клеток в конструкциях [11], но вследствие структурных особенностей имеет значительную эластичность [27]. Следует отметить, что поскольку ГМК обладают высокой пластичностью [28, 29], эластичность конструкций может значительно изменяться в течение культивирования [18, 19]. Это может усложнять интерпретацию данных, особенно в длительных экспериментах, как, например, с применением продолжительной механической стимуляции [18]. Использование в нашей работе ингибиторов фибринолизина (апротинин, транексамовая кислота) и ростовой добавки с низким содержанием сыворотки (SMDS) способствовало устойчивости эластических свойств ТК после их созревания (см. рис. 4).

Рис. 4. Стабильность механоэластических свойств тканеинженерных конструкций: а - диаграмма растяжения конструкции. Повторные измерения на 1-, 4- и 7-й день; b - рассчитанный модуль упругости (модуль Юнга), х ± SEM, n = 6. Статистические отличия между тремя группами отсутствуют

Рис. 5. Влияние блеббистатина и цитохалазина Д на механоэластические свойства тканеинженерных конструкций: а - кривая динамики изменения растяжения конструкции в ответ на последовательное применение 30 мкМ блеббистатина и 50 мкМ цитохалазина Д при постоянной приложенной силе 0,062 мН; Ь - диаграмма растяжения конструкции в контроле и после инкубации с блеббистатином и цитохалазином Д

На рис. 5 показаны результаты отдельного эксперимента по тестированию механоэластических свойств ТК под воздействием Бб и Цито-Д. Видно, что добавление 30 мкМоль Бб вызывает увеличение растяжения ТК с 1,2 до 1,45% (рис. 5, а). Последующая обработка Цито-Д в концентрации 50 мкМоль способствует дальнейшей релаксации ТК и увеличению растяжения до 1,8%. Это соотносится с изменениями эластичности, соответствующими приложенной силе 0,062 мН на диаграмме растяжения конструкции, представленной на рис. 5, Ь. Известно, что Бб является селективным ингибитором АТФ-аз- ной активности различных изоформ миозина II в поперечнополосатых [12] и ГМК [30], тогда как Ци- то-Д изменяет механические свойства путем деполимеризации актиновых филаментов цитоскелета клеток [13]. Соответственно, добавление Бб ингибирует связанное с миозином сокращение, а последующая инкубация с Цито-Д разрушает актиновое тоническое сокращение и увеличивает релаксацию ТК.

Адренергическая и холинергическая стимуляции являются одними из наиболее важных систем, задействованных в регуляции сердечно-сосудистого тонуса. С одной стороны, известно, что в-адренергическая стимуляция через активацию аденилатциклазы и увеличение цАМФ влияет на уровень внутриклеточного Са 2+ [31, 32]. Релаксацию обусловливают следующие предложенные механизмы: гиперполяризация через Са 2+ активируемые калиевые каналы, уменьшение чувствительности сократительных элементов к Са 2+ вследствие фосфорилирования киназы легких цепей миозина, уменьшение содержания цитозольного Са 2+ через регуляцию Са 2+-транспортирующих систем саркоплазматического ретикулума и плазмалеммы и др. [33, 34]. С другой стороны, васкулярные ГМК находятся в близком структурном и функциональном взаимодействии с клетками эндотелия, который может регулировать тонус сосудов через паракринное взаимодействие либо через межклеточные каналы, соединяющие два типа клеток [35]. Поэтому возможна опосредованная адренергическая регуляция сократимости ГМК с участием эндотелиальных клеток [35-37].

В наших экспериментах инкубация ТК с Изо в концентрации 1 мкМ вызывала небольшое, но значимое уменьшение эластичности при увеличении приложенной силы растяжения свыше 0,05 мН (р < 0,05, n = 6), а также значимое увеличение модуля упругости (р < 0,05, n = 6) с 7,9 ± 1,5 кПа до 10,2 ± 2,1 кПа (рис. 6). В ранних работах по изучению влияния p-адренергической стимуляции на тонус сосудов и на сократимость ГМК, эксперименты в основном проводились in vivo либо in vitro на изолированных препаратах сосудов животных, где типичным является релаксирующий эффект [32, 33, 35]. На изолированных ГМК был продемонстрирован двойной механизм регуляции кальциевых каналов, когда при наноконцентрациях Изо увеличивал ток кальциевых каналов L-типа, в то время как при микроконцентрациях его действие было обратным [38]. Поскольку для выращивания конструкций нами использовались только ГМК, зависимость механизма ответа от концентрации Изо может лежать в основе наблюдаемого эффекта уменьшения эластичности.

Действие Ацх на васкулярные ГМК осуществляется через М 3-мускариновые рецепторы [39]. Согласно концепции участия эндотелиальных клеток в гуморальной регуляции тонуса сосудов, первичную роль в ответ на холинергическую стимуляцию выполняют эндотелиальные клетки, а примыкающие к ним ГМК являются пассивными реципиентами монооксида азота [40], хотя из ранних работ известно, что в случае прямого воздействии на ГМК, Ацх, связываясь с М 3-рецептором, активирует фосфолипазу С и через инозитолтрифосфатный путь может индуцировать сократительный эффект [41]. В наших экспериментах применение Ацх вызывало незначительное уменьшение эластичности ТК (рис. 6, Ь).

Рис. 6. Изменение упругости тканеинженерных конструкций в ответ на адренергическую и холинэргическую стимуляцию: a - диаграмма растяжения конструкции в контроле и под действием изопротеренола и ацетилхолина; b - изменение модуля упругости (модуля Юнга) под действием изопротеренола и ацетилхолина, х ± SEM, n = 6

Незначительный эффект, скорее всего, обусловлен гомогенной клеточной популяцией, т.е. отсутствием эндотелиальных клеток в клеточной смеси при выращивании конструкций. Последующие эксперименты с добавлением фракции эндотелиальных клеток позволят оценить роль взаимодействия различных типов клеток как в холинергической, так и в адренергической регуляции сократимости гладкомышечных ТК.

Заключение

Литература

1. Iyemere V.P., Proudfoot D., Weissberg P.L., Weissberg P.L., Shanahan C.M. Vascular smooth muscle cell phenotypic plasticity and the regulation of vascular calcification. J. Intern. Med. 2006; 260 (3): 192-210. DOI: 10.1111/j.1365- 2796.2006.01692.x.

2. Bennett M.R., Sinha S., Owens G.K. Vascular smooth muscle cells in atherosclerosis. Circ. Res. 2016; 118 (4): 692-702. DOI: 10.1161/CrRCRESAHA.115.306361.

3. Ailawadi G., Moehle C.W., Pei H., Walton S.P., Yang Z., Kron I.L., Lau C.L., Owens G.K. Smooth muscle phenotypic modulation is an early event in aortic aneurysms. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2009; 138 (6): 1392-1399. DOI: 10.1016/j. jtcvs.2009.07.075.

4. Touyz R.M., Alves-Lopes R., Rios F.J., Camargo L.L., Anag- nostopoulou A., Arner A., Montezano A.C. Vascular smooth muscle contraction in hypertension. Cardiovasc. Res. 2018; 114 (4): 529-539. DOI: 10.1093/cvr/cvy023.

5. Gwyther T.A., Hu J.Z., Billiar K.L., Rolle M.W. Directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering. J. Vis. Exp. 2011; 57: e3366. DOI: 10.3791/3366.

6. Dash B.C., Levi K., Schwan J., Luo J., Bartulos O., Wu H., Qiu C., Yi T., Ren Y., Campbell S., Rolle M.W., Qyang Y. Tissue-engineered vascular rings from human iPSC-derived smooth muscle cells. Stem Cell Reports. 2016; 7 (1): 19-28. DOI: 10.1016/j.stemcr.2016.05.004.

7. West A.R., Zaman N., Cole D.J., Walker M.J., Legant W.R., Boudou T., Chen C.S., Favreau J.T., Gaudette G.R., Cowley E.A., Maksym G.N. Development and characterization of a 3D multicell microtissue culture model of airway smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 2013; 304 (1): L4-16. DOI: 10.1152/ajplung.00168.2012.

8. Vunjak Novakovic G., Eschenhagen T., Mummery C. Myocardial tissue engineering: in vitro models. Cold Spring Harb PerspectMed. 2014; 4 (3): pii: a014076. DOI: 10.1101/cshper- spect.a014076.

9. Sidorov V.Y., Samson P.C., Sidorova T.N., Davidson J.M., Lim C.C., Wikswo J.P. I-Wire Heart-on-a-Chip I: Three-dimensional cardiac tissue constructs for physiology and pharmacology. Acta Biomater. 2017; 48: 68-78. DOI: 10.1016/j. actbio.2016.11.009.

10. Schroer A.K., Shotwell M.S., Sidorov V.Y., Wikswo J.P., Merryman W.D. I-Wire Heart-on-a-Chip II: Biomechanical analysis of contractile, three-dimensional cardiomyocyte tissue constructs. Acta Biomater. 2017; 48: 79-87. DOI: 10.1016/j.actbio.2016.11.010.

11. Ahmann K.A., Weinbaum J.S., Johnson S.L., Tranquillo R.T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 2010; 16 (10): 3261-3270. DOI: 10.1089/ten.tea.2009.0708.

12. Kovacs M., Toth J., Hetenyi C., Malnasi-Csizmadia A., Sellers J.R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. J. Biol. Chem. 2004; 279 (34): 35557-35563. DOI: 10.1074/jbc. M405319200.

13. Wakatsuki T., Schwab B., Thompson N.C., Elson E.L. Effects of cytochalasin D and latrunculin B on mechanical properties of cells. J. Cell Sci. 2001; 114 (Pt 5): 1025-1036. PMID: 11181185.

14. Warren M.L. Forces. In: Taylor E.F. (edit.) Introductory Physics. San Francisco: W.H. Freeman and Company, 1979: 82-83.

15. Gunst S.J., Zhang W. Actin cytoskeletal dynamics in smooth muscle: a new paradigm for the regulation of smooth muscle contraction. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2008; 295 (3): C576-587. DOI: 10.1152/ajpcell.00253.2008.

16. Paulin D., Li Z. Desmin: a major intermediate filament protein essential for the structural integrity and function of muscle. Exp. Cell Res. 2004; 301 (1): 1-7. DOI: 10.1016/j.yex- cr.2004.08.004.

17. Hirai J., Kanda K., Oka T., Matsuda T. Highly oriented, tubular hybrid vascular tissue for a low pressure circulatory system. Asaio J. 1994; 40 (3): M383-388. PMID: 8555543 DOI: 10.1097/00002480-199407000-00027.

18. Seliktar D., Black R.A., Vito R.P., Nerem R.M. Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro. Ann. Biomed. Eng. 2000; 28 (4): 351-362. PMID: 10870892. DOI: 10.1114/1.275.

19. Rowe S.L., Stegemann J.P. Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios.

Biomacromolecules. 2006; 7 (11): 2942-2948. DOI: 10.1021/ bm0602233.

20. Cummings C.L., Gawlitta D., Nerem R.M., Stegemann J.P. Properties of engineered vascular constructs made from collagen, fibrin, and collagen-fibrin mixtures. Biomaterials. 2004; 25 (17): 3699-3706. DOI: 10.1016/j.biomateri- als.2003.10.073.

21. Sehgel N.L., Sun Z., Hong Z., Hunter W.C., Hill M.A., Vat- ner D.E., Vatner S.F., Meininger G.A. Augmented vascular smooth muscle cell stiffness and adhesion when hypertension is superimposed on aging. Hypertension. 2015; 65 (2): 370377. DOI: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.114.04456.

22. Hong Z., Reeves K.J., Sun Z., Li Z., Brown N.J., Meininger G.A. Vascular smooth muscle cell stiffness and adhesion to collagen I modified by vasoactive agonists. PLoS One. 2015; 10 (3): e0119533. DOI: 10.1371/journal.pone.0119533.

23. Zhou N., Lee J.J., Stoll S., Ma B., Costa K.D., Qiu H. Rho kinase regulates aortic vascular smooth muscle cell stiffness via actin/SRF/myocardin in hypertension. Cell Physiol. Biochem. 2017; 44 (2): 701-715. DOI: 10.1159/000485284.

24. Qiu H., Zhu Y., Sun Z., Trzeciakowski J.P., Gansner M., De- pre C., Resuello R.R., Natividad F.F., Hunter W.C., Genin G.M., Elson E.L., Vatner W.E., Meininger G.A., Vatler S.F. Short communication: vascular smooth muscle cell stiffness as a mechanism for increased aortic stiffness with aging. Circ. Res. 2010; 107 (5): 615-619. DOI: 10.1161/CIRCRESA- HA.110.221846.

25. Zhu Y., Qiu H., Trzeciakowski J.P., Sun Z., Li Z., Hong Z., Hill M.A., Hunter W.C., Vatner D.E., Vatner S.F., Meininger G.A. Temporal analysis of vascular smooth muscle cell elasticity and adhesion reveals oscillation waveforms that differ with aging. Aging Cell. 2012; 11 (5): 741-750. DOI: 10.1111/j.1474-9726.2012.00840.x.

26. Shaikh F.M., Callanan A., Kavanagh E.G., Burke P.E., Grace P.A., McGloughlin T.M. Fibrin: a natural biodegradable scaffold in vascular tissue engineering. Cells Tissues Organs. 2008; 188 (4): 333-346. DOI: 10.1159/000139772.

27. Litvinov R.I., Weisel J.W. Fibrin mechanical properties and their structural origins. Matrix Biol. 2017; 60-61: 110-123. DOI: 10.1016/j.matbio.2016.08.003.

28. Rensen S.S., Doevendans P.A., van Eys G.J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth. Heart J. 2007; 15 (3): 100-108. DOI: 10.1007/ bf03085963.

29. Tuna B.G., Bakker E.N., VanBavel E. Smooth muscle biomechanics and plasticity: relevance for vascular calibre and remodelling. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 2012; 110 (1): 35-41. DOI: 10.1111/j.1742-7843.2011.00794.x.

30. Eddinger T.J., Meer D.P., Miner A.S., Meehl J., Rovner A.S., Ratz P.H. Potent inhibition of arterial smooth muscle tonic contractions by the selective myosin II inhibitor, blebbista- tin. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2007; 320 (2): 865-870. DOI: 10.1124/jpet.106.109363.

31. Tanaka Y., Horinouchi T., Koike K. New insights into beta-adrenoceptors in smooth muscle: distribution of receptor subtypes and molecular mechanisms triggering muscle relaxation. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2005; 32 (7): 503-514. DOI: 10.1111/j.1440-1681.2005.04222.x.

32. Eckly A.E., Stoclet J.C., Lugnier C. Isoprenaline induces endothelium-independent relaxation and accumulation of cyclic nucleotides in the rat aorta. Eur. J. Pharmacol. 1994; 271 (1): 237-240. DOI: 10.1016/0014-2999(94)90287-9.

33. Scheid C.R., Honeyman T.W., Fay F.S. Mechanism of beta-adrenergic relaxation of smooth muscle. Nature. 1979; 277 (5691): 32-36. DOI: 10.1038/277032a0.

34. Mueller E., van Breemen C. Role of intracellular Ca2+ sequestration in beta-adrenergic relaxation of a smooth muscle. Nature. 1979; 281 (5733): 682-683. DOI: 10.1038/281682a0.

35. Gray D.W., Marshall I. Novel signal transduction pathway mediating endothelium-dependent beta-adrenoceptor vasorelaxation in rat thoracic aorta. Br. J. Pharmacol. 1992; 107 (3): 684-690. DOI: 10.1111/j.1476-5381.1992.tb 14507.x.

36. Graves J., Poston L. Beta-adrenoceptor agonist mediated relaxation of rat isolated resistance arteries: a role for the endothelium and nitric oxide. Br. J. Pharmacol. 1993; 108 (3): 631-637. DOI: 10.1111/j.1476-5381.1993.tb12853.x.

37. Chalon S., Tejura B., Moreno H. Jr., Urae A., Blaschke T.F., Hoffman B.B. Role of nitric oxide in isoprenaline and sodium nitroprusside-induced relaxation in human hand veins. Br. J. Clin. Pharmacol. 1999; 47 (1): 91-98. DOI: 10.1046/j.1365- 2125.1999.00863.x.

38. Xiong Z., Sperelakis N., Fenoglio-Preiser C. Isoproterenol modulates the calcium channels through two different mechanisms in smooth-muscle cells from rabbit portal vein. Pflugers Arch. 1994; 428 (2): 105-113. DOI: 10.1007/bf00374847.

39. Walch L., Brink C., Norel X. The muscarinic receptor subtypes in human blood vessels. Therapie. 2001; 56 (3): 223226. PMID: 11475798.

40. Furchgott R.F., Zawadzki J.V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 1980; 288 (5789): 373-376. DOI: 10.1038/288373a0.

41. Itoh T., Fujiwara T., Kubota Y., Nishiye E., Kuriyama H. Roles of protein kinase C on the mechanical activity of vascular smooth muscles. Am. J. Hypertens. 1990; 3 (8 Pt 2): 216s-219s. DOI: 10.1093/ajh/3.8.216.

Размещено на Allbest.ru