Интрастромальная имплантация трековых мембран с пренатальными стромальными клетками человека при эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы в эксперименте

Эндотелиально-эпителиальная дистрофия (ЭЭД) роговицы - хроническое прогрессирующее заболевание роговицы, в основе патогенеза которого лежит необратимое уменьшение численности клеток заднего эпителия и, как следствие, утрата ими барьерной и насосной функций, что ведет к развитию отека, снижению зрения и появлению у пациента болевого симптома. Лечение ЭЭД роговицы не всегда обеспечивает стабильные клинико-функциональные результаты [1-3], что обусловливает поиск и разработку материалов, способных поддерживать роговицу в слабо дегидратированном состоянии. Особый интерес представляют трековые мембраны на основе полиэтилентерефталата (ПЭТФ). Величина поверхностной энергии трековых мембран из ПЭТФ достаточно мала (32 мДж/м2) [4], поэтому степень гидрофильности данного материала является критичной для использования мембран в качестве имплантата и подложки для адгезии клеток. Для повышения смачиваемости мембран и улучшения адгезии на них культуры клеток [5] возможна модификация поверхности полимерных материалов, в частности, с помощью низкотемпературной плазмы атмосферного давления. Преимуществами метода являются малая глубина проникновения частиц плазмы и изменение свойств только поверхностного слоя материала без существенной тепловой нагрузки [6]. Возможно, использование гидрофильных трековых мембран с дополнительным наслоением на их поверхность пренатальных стромальных клеток человека при лечении ЭЭД роговицы позволит стабилизировать течение заболевания.

Цель работы - изучить возможность применения трековых мембран, в том числе модифицированных холодной плазмой, с последующим наслоением на их поверхность культуры пренатальных стромальных клеток человека для коррекции эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы в эксперименте.

Материалы и методы

Образцы трековых мембран (ТМ) изготавливались путем обработки ионами 40Ar+8 и химического травления пленки ПЭТФ. Модификацию поверхности полученных мембран проводили в НИ ТПУ с использованием экспериментальной установки низкотемпературной плазмы атмосферного давления. Время обработки - 30 с. Пленки стерилизовали посредством у-облучения радионуклидом 60С^о в дозе 1 кГр (Si). Физико-химическое тестирование ТМ проводилось по стандартной методике.

Изучение in vivo биосовместимости ТМ осуществлялось на 16 кроликах породы Sylvilagus bachmani массой 3,5-4,0 кг. Каждому животному предварительно моделировали ЭЭД роговицы путем механического повреждения и удаления заднего эпителия одного из глаз. Через 2 нед. после развития заболевания кролики в зависимости от планируемого лечения были разделены на четыре группы. Группа 1 (контрольная) - 4 кролика с ЭЭД роговицы (4 глаза); группа 2-4 животных с ЭЭД (4 глаза), которым в строму роговой оболочки имплантировали немодифицированную плазмой ТМ; группа 3 - 4 животных с ЭЭД (4 глаза), которым имплантировали в роговицу немодифицированную плазмой ТМ с наслоенной на поверхность культурой пренатальных стромальных клеток (ПСК) человека; группа 4 - 4 животных с ЭЭД (4 глаза), которым имплантировали модифицированную плазмой ТМ с наслоенной на поверхность культурой ПСК человека.

На ТМ предварительно высаживали культуру ПСК, выделенную в 2004 г. из легкого 11-недельного эмбриона человека и поддерживаемую ex vivo (линия FL-42, ООО «Банк стволовых клеток», г. Томск). Стерильные ТМ помещали в лунки 24-луночных культуральных планшетов (Orange Scientific, Бельгия), содержащие взвесь ПСК человека в концентрации 3 х 104 жизнеспособных кариоцитов в 1 мл полной культуральной среды. Через 72 ч культивирования при 37°С и 100%-й влажности в воздушной атмосфере (после достижения клеточного монослоя) ТМ с наслоенной культурой ПСК человека имплантировали кроликам 3-й и 4-й групп.

Имплантация ТМ осуществлялась в условиях операционной на фоне наркоза (внутривенное введение золетила (Virbac Sante Animale, Франция), 15 мг/кг). После обработки операционного поля с соблюдением правил асептики и антисептики в роговице животных с предварительно индуцированной ЭЭД формировали два тоннельных (до глубоких слоев стромы) надреза в 1,5 мм от лимба к центру роговицы шириной 1,2 мм с ориентацией на 3 и 9 ч. С помощью шпателя через оба тоннельных надреза формировали интрастромальный «карман» в собственном веществе роговицы. Далее в один из тоннельных надрезов вводили цанговый пинцет, проводя его сквозь расслоенное собственное вещество «кармана», и выводили через противоположный тоннельный надрез, где браншами пинцета захватывали свернутую валиком ТМ. Во время обратного движения пинцета ТМ имплантировали в интрастромальный «карман» роговицы. С помощью шпателя ТМ аккуратно расправляли. Адаптацию краев тоннельных надрезов обеспечивали путем гидратации.

Спустя 8 нед. от начала исследования кроликов выводили из эксперимента, выполняли энуклеацию оперированных глаз, полученный материал фиксировали для световой микроскопии. Умерщвление экспериментальных животных осуществляли с соблюдением правил и норм Европейского общества (86/609EEC) и Хельсинской декларации.

Срезы роговицы окрашивали гематоксилином и эозином, по методу Ван Гизона и полихромным красителем по Маллори. Для подсчета числа фибробластов, удельного объема сосудов, площади отека и параметров клеточной лейкоцитарной инфильтрации (количество лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, базофилов) в полученных срезах использовали световой микроскоп ЛОМО Биолам АУ-12 (Россия), окуляры х 7, х 40, х 90, собственное увеличение микроскопа х1,5, окулярную сетку Автандилова на 50 точек, окулярную вставку с известной площадью. Морфометрию срезов проводили с помощью компьютерной программы ImageJ 1.46.

Для статистического анализа полученных результатов применялся статистический пакет IBMSPSS Statistics 20. Рассчитывали следующие параметры выборок: медиану Ме, 25%-й и 75%-й квартили. Результаты представлены в виде Ме (Q1-Q3), а также М ± т, где М - среднее значение, т - ошибка среднего. Для оценки исходной сопоставимости экспериментальных групп для количественных данных применяли критерий Краскела - Уоллиса, для номинальных - точный Е-критерий Фишера. Анализ динамики показателей проводили с помощью парного критерия Вилкоксона. Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали 17-критерий Манна - Уитни. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Согласно результатам световой микроскопии, через 8 нед. от начала эксперимента у животных 1-й группы (контроль) в переднем эпителии роговицы обнаруживались клетки с признаками гидропической дегенерации. В собственном веществе наблюдался неравномерно выраженный отек (удельный объем (28,3 ± 10,1)%), в передней трети - новообразованные сосуды (удельный объем (2,5 ± 1,9)%), умеренная лейкоцитарная инфильтрация (рис. 1, таблица). Набухшие коллагеновые волокна располагались рыхло. Передняя и задняя пограничные мембраны имели нормальное строение. Задний эпителий частично отсутствовал, частично был замещен клетками отростчатой формы.

У животных 2-й группы обнаруживались выраженный отек собственного вещества (удельный объем (18,83 ± 5,8)%), разволокнение и нарушение тинкториальных свойств коллагеновых волокон преимущественно вокруг ТМ. Удельный объем новообразованных сосудов составлял (3,2 ± 2,3)% (рис. 2, см. таблицу). Между передним эпителием роговицы и ТМ коллагеновые волокна располагались более компактно. Между задним эпителием и ТМ обнаруживалась грануляционная ткань. Передний и задний эпителий, а также передняя и задняя пограничная мембраны были без особенностей и соответствовали строению таковых у животных 1-й группы.

В 3-й группе передний эпителий роговицы был сохранен на всем протяжении. Непосредственно под передней пограничной мембраной, которая слабо просматривалась, в собственном веществе обнаруживались скопления фибробластов ((133 ± 26) клеток в поле зрения) (см. таблицу).

трековый мембрана эндотелиальный дистрофия роговица

а b

Рис. 1. Фрагмент роговицы кролика 1-й группы: передний (я) и задний (b) отделы, отек (о), гидратированные коллагеновые волокна (горизонтальные стрелки), новообразованные сосуды (с), клеточная инфильтрация (инф), отростчатые клетки (косые стрелки) на месте заднего эпителия (ЗЭп), ПЭп - передний эпителий. Окраска гематоксилином и эозином, х200

Таблица

Морфометрические показатели посттравматической реакции роговицы спустя 6 нед от начала моделирования эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы

Рис. 2. Фрагмент роговицы кролика 2-й группы: грануляционная ткань (гр), неравномерно выраженный интерстициальный отек (о), полнокровие новообразованных сосудов (с), клеточная инфильтрация (инф) в месте имплантации трековой мембраны (М). Окраска гематоксилином и эозином, *200

Рис. 3. Фрагмент роговицы кролика 3-й группы: выраженный отек (о), новообразованные сосуды (с), единичные лейкоциты (л), клеточная инфильтрация (инф) собственного вещества роговицы и фибробласты (стрелки) на поверхности трековой мембраны (М). Окраска гематоксилином и эозином (а), полихромным красителем по Маллори (b), *200

На поверхности ТМ наблюдались единичные клетки фибробластоподобной формы (рис. 3). В собственном веществе роговицы выявлялись неравномерно выраженный отек (удельный объем (14,4 ± 6,3)%), новообразованные сосуды (удельный объем (6,52 ± 3,9)%), лимфо-лейкоцитарная инфильтрация (см. таблицу). Вблизи ТМ располагались набухшие, рыхлые коллагеновые волокна. Задняя пограничная мембрана имела нормальное строение. Строение заднего эпителия было сходным с таковым у кроликов 1-й, 2-й групп.

У кроликов 4-й группы передний эпителий имел нормальное строение. Под нечетко просматриваемой передней пограничной мембраной, как и в 3-й группе, выявлялись скопления фибробластов ((159,9 ± 35) клеток в поле зрения) (рис. 4, см. таблицу).

На поверхности ТМ наблюдались единичные клетки фибробластоподобной формы. Отек собственного вещества был незначителен (удельный объем (12,58 ± 5,1)%) (см. таблицу). На отдельных участках коллагеновые волокна располагались рыхло. Задняя пограничная мембрана - без особенностей. Строение заднего эпителия было сходным с таковым у кроликов 1-, 2-, 3-й групп.

Согласно результатам исследования, имплантация ТМ в собственное вещество роговицы при ЭЭД роговой оболочки способствует уменьшению (в 1,5 раза) отека ее собственного вещества и более интенсивному (в 1,7 раза) накоплению фибробластов вблизи ТМ по сравнению с состоянием роговицы в группе модели заболевания без лечения. Наличие ПСК человека на поверхности ТМ независимо от исходного состояния полимерного материала после интрастромальной имплантации индуцирует пролиферацию фибробластов в 1,5-1,8 раза и неоваскуляризацию собственного вещества роговицы в 1,8-2,0 раза по сравнению с имплантацией ТМ без культуры клеток. Степень гидратации собственного вещества роговой оболочки при этом уменьшается в 1,3-1,5 раза. Модификация ТМ холодной плазмой не оказывает влияния на изученные морфометрические показатели роговицы.

а в

Рис. 4. Фрагмент роговицы кролика 4-й группы: фибробласты (стрелки) в собственном веществе роговицы и на поверхности трековой мембраны (М), инфильтрация (инф), отек (о). Окраска гематоксилином и эозином (я) и полихромным красителем по Маллори (b), *200

Выводы

Имплантация трековой мембраны из полиэтилентерефталата при эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы способствует развитию продуктивной фазы инфильтративного воспаления в роговице кроликов.

Предварительная in vitro адгезия пренатальных стромальных клеток человека на трековые мембраны независимо от исходного состояния полимерного материала уменьшает выраженность деструктивных изменений роговицы кролика при эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговой оболочки.

Модификация трековых мембран холодной плазмой не влияет на изученные морфометрические показатели роговицы кроликов при эндотелиально-эпителиальной дистрофии данной оболочки.

Литература / references

1. Agarwal A., Narang P., Kumar D.A., Agarwal A. Young donor - graftassisted endothelial keratoplasty (PDEK/ DMEK) with epithelial debridement for chronic pseudophakic bullous keratopathy. Canadian Journal of Ophthalmology. 2017; 5: 519-526

2. Shulman J., Kropinak M., Ritterband D.C. Failed descemet-stripping automated endothelial keratoplasty grafts: a clinicopathologic analysis. American Journal of Ophthalmology. 2009; 148 (5): 752-759.

3. Terry M.A., Shamie N., Chen E.S. Endothelial keratoplasty: the influence of donor endothelial cell densities on dislocation, primary graft failure, and 1-year cell counts. Cornea. 2008; 27 (10): 1131-1137.

4. Миронюк А.В., Придатко А.В., Сиволапов П.В., Сви- дерский В.А. Особенности оценки смачивания полимерных поверхностей. Технологии органических и неорганических веществ. Восточно-Европейский журнал передовых технологий. 2014; 1 (6): 23-26. [Mironyuk A.V., Pridatko A.V., Sivolapov P.V., Sviderskyi V.A. Features of evaluation of polymer surface wetting. Technology of organic and inorganic substances. East European Journal of Advanced Technology. 2014; 1 (6): 23-26 (in Russ.)].

5. Alonso J.G., Dalmolin C., Nahorny J., Recco A.A.C., Fontana L.C., Becker D. Active screen plasma system applied to polymer surface modification: Poly(lactic acid) surface activation before polyaniline graft polymerization in aqueous medium. Journal of Polymer Engineering. 2018; 38: 795-802.

6. Jacobs T., Declercq H., De Geyter N., Cornelissen R., Du- bruel P., Leys C., Beaurain A., Payen E., Morent R. Plasma surface modification of polylactic acid to promote interaction with fibroblasts. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2013; 24; 469-478.

Размещено на allbest.ru